養(yǎng)真接骨膠囊微生物限度檢查方法驗證

楊劼　段肖翠　李濤　崔力劍　馬華民　李三鐵　焦寧

050051　石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院(楊劼、崔力劍、馬華民、焦寧)；河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，河北省實驗動物重點實驗室(段肖翠)；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(李濤)；河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(李三鐵)

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·論著·

養(yǎng)真接骨膠囊微生物限度檢查方法驗證

楊劼段肖翠李濤崔力劍馬華民李三鐵焦寧

050051石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院(楊劼、崔力劍、馬華民、焦寧)；河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，河北省實驗動物重點實驗室(段肖翠)；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院(李濤)；河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(李三鐵)

【摘要】目的建立養(yǎng)真接骨膠囊的微生物限度檢查方法。方法采用平皿法(培養(yǎng)基稀釋法)與常規(guī)法，以金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉菌和乙型副傷寒沙門菌為陽性對照菌，進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)與控制菌驗證。結(jié)果規(guī)定條件下培養(yǎng)，結(jié)果3個批次藥品本底組菌落數(shù)均為0。3個批次藥品五種陽性菌回收率均高于70%，證明無抑菌現(xiàn)象。3個批次藥品試驗組和菌液組在加入靛基質(zhì)試液后液面出現(xiàn)玫瑰紅色，而對照組和稀釋組未出現(xiàn)。3個批次藥品試驗組和菌液組產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而對照組和稀釋組未出現(xiàn)。3個批次藥品試驗組和菌液組有菌落，而對照組和陰性對照未出現(xiàn)。結(jié)論養(yǎng)真接骨膠囊樣品可采用1∶10供試液，平皿法檢查細(xì)菌數(shù)，常規(guī)法檢查霉菌及酵母菌數(shù)和控制菌。

【關(guān)鍵詞】養(yǎng)真接骨膠囊；微生物限度檢測；方法學(xué)驗證；培養(yǎng)基稀釋法

中藥合劑、口服液、片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑等是目前發(fā)展起來的中成藥新制型。具有易于服用、便于攜帶、儲存、患者用藥的依從性好等優(yōu)點，然而，由于中藥成分復(fù)雜，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，我細(xì)菌的生長繁殖提供了適宜的環(huán)境，增加了藥物應(yīng)用的不良反應(yīng)發(fā)生率和患者就醫(yī)風(fēng)險。因此，如何有效的檢測和控制細(xì)菌的種類和數(shù)量尤為重要。然而，建立的中藥檢測方法是否靈敏、準(zhǔn)確、可行，仍需要驗證方法的可適用性，那么中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證的目的, 就是證明采用的方法是否適合于相應(yīng)的檢測要求。在建立中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時, 分析方法需經(jīng)驗證; 在處方、工藝等變更或改變原分析方法時, 也需對分析方法進(jìn)行驗證。而有些藥物的檢測方法現(xiàn)在看來專屬性差，不能有效地驗證真假偽劣，還需要制定更準(zhǔn)確、更先進(jìn)的檢測方法[1]。中國藥典規(guī)定的檢查項目包括有細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)和控制菌的檢查[1]，同時參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-5]，本文按照相關(guān)操作規(guī)范，對相應(yīng)的微生物限度檢查方法進(jìn)行驗證。

1材料與方法

1.1主要儀器高壓蒸汽滅菌器、恒溫電熱培養(yǎng)箱，電熱鼓風(fēng)干燥箱、勻漿儀。

1.2主要試劑養(yǎng)真接骨膠囊，生產(chǎn)單位：河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院；培養(yǎng)基主要有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、pH值7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(TTB)、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基(DHL)。以上培養(yǎng)基均購買自北京三藥并且通過了藥典所規(guī)定的相關(guān)適用性試驗；陽性對照菌主要有金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]和乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]，以上菌種均購買自中國藥品生物制品檢定所，且傳代次數(shù)未超過第五代。稀釋劑為pH值7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.3菌液制備于10 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的斜面新鮮培養(yǎng)物，34℃條件下培養(yǎng)24 h；于10 ml改良馬丁培養(yǎng)基中接種白色念珠菌的斜面新鮮培養(yǎng)物，25.0℃條件下培養(yǎng)48 h；取上述培養(yǎng)物 1 ml置9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液無菌試管內(nèi)，采用10倍遞增稀釋法使菌數(shù)為50～100 cfu/ml。于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中接種黑曲霉的斜面新鮮培養(yǎng)物，25℃條件下培養(yǎng)5 d，之后加入含0.05%(ml/ml)聚山梨酯-80的0.9%無菌氯化鈉溶液5 ml，洗下霉菌孢子，吸出孢子懸液，取1 ml菌液加0.05%(ml/ml)聚山梨酯-80的0.9%無菌氯化鈉溶液9 ml，采用10倍遞增稀釋法使菌數(shù)為50～100 cfu/ml。

1.4實驗步驟

1.4.1平皿法供試液制備：取樣品10 g加pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，設(shè)定勻漿儀2 000 r/min，混勻1 min，作為1∶10供試液。

1.4.2細(xì)菌數(shù)：取上述1∶10供試液0.2 ml置1個無菌平皿中，平行制備2個皿，倒入45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，作為供試品對照組，按平皿法測定細(xì)菌本底菌落數(shù)；取上述1∶10供試液0.2 ml與上述陽性對照菌懸液1 ml同置一無菌平皿中，每種陽性菌平行制備2個皿，倒入45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，作為試驗組，按平皿法測定菌落總數(shù)；分別取制備好的陽性對照菌懸液或孢子懸液1 ml，置1個無菌平皿中，每種陽性菌平行制備2個皿，倒入45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，作為菌液組，按平皿法測定菌落數(shù)。

1.4.3霉菌和酵母菌數(shù)：常規(guī)法驗證取上述1∶10供試液1 ml置1個無菌平皿中，平行制備2個皿，倒入45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，作為供試品對照組，按平皿法測定細(xì)菌本底菌落數(shù)；取上述1∶10供試液1 ml與上述陽性對照菌懸液1 ml同置1個無菌平皿中，每種陽性菌平行制備2個皿，倒入45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，作為試驗組，按平皿法測定菌落總數(shù)；分別取制備好的陽性對照菌懸液或孢子懸液1 ml，置1個無菌平皿中，每種陽性菌平行制備2個皿，倒入45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中混勻，作為菌液組，按平皿法測定菌落數(shù)。

1.4.4大腸埃希菌：常規(guī)法驗證取100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基4份，2份分別加入1∶10供試液10 ml,其中1份加入上述大腸埃希菌的菌懸液(營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)菌落數(shù)為85 cfu/ml)1 ml,其他2份分別加入上述大腸埃希菌的菌懸液1 ml和10 ml pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。置于34℃培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物 0.2 ml，接種至含5 ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)34℃培養(yǎng)，24 h在366 nm紫外燈下觀察是否有藍(lán)白色熒光后，加入靛基質(zhì)試液，觀察液面是否出現(xiàn)玫瑰紅色。

1.4.5大腸菌群：常規(guī)法驗證取10 ml膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管4份，2份分別加入1∶10供試液1 ml，其中1份加大腸埃希菌的菌懸液1 ml；第3份加上述大腸埃希菌的菌懸液(營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)菌落數(shù)為85 cfu/ml)1 ml、第4份加稀釋劑1 ml。于34℃培養(yǎng)24 h后，觀察是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

1.4.6沙門菌：常規(guī)法驗證取3份200 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，2份各加入10 g供試品，其中1份加入上述沙門菌菌懸液(營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)菌落數(shù)為64 cfu/ml)1 ml，與第3份同置34℃培養(yǎng)24 h后，分別取上述培養(yǎng)物1 ml接種于10 ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，同條件下培養(yǎng)24 h后分別劃線于DHL和EMB平板上，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，觀察菌落生長情況。

2結(jié)果

2.1按平皿法測定供試品對照組菌落數(shù),霉菌和酵母菌數(shù)。規(guī)定條件下培養(yǎng)，結(jié)果3個批次藥品本底組菌落數(shù)均為0。見表1。

表1　供試品對照組計數(shù)結(jié)果　cfu

2.2按平皿法測定試驗組、菌液組菌落數(shù)結(jié)果3個批次藥品五種陽性菌回收率均高于70%，證明無抑菌現(xiàn)象，說明養(yǎng)真接骨膠囊樣品可用平皿法進(jìn)行微生物限度檢查。見表2。

表2　五種陽性菌回收率計算結(jié)果

2.3常規(guī)法檢測大腸埃希菌結(jié)果3個批次藥品試驗組和菌液組在加入靛基質(zhì)試液后液面出現(xiàn)玫瑰紅色，而對照組和稀釋組未出現(xiàn)。說明養(yǎng)真接骨膠囊樣品可用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查。見表3。

表3　大腸埃希菌的驗證結(jié)果

2.4常規(guī)法檢測大腸菌群結(jié)果3個批次藥品試驗組和菌液組產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而對照組和稀釋組未出現(xiàn)。說明養(yǎng)真接骨膠囊樣品可用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查。見表4。

表4　大腸菌群的驗證結(jié)果

2.5常規(guī)法檢測沙門菌結(jié)果3個批次藥品試驗組和菌液組有菌落，而對照組和陰性對照未出現(xiàn)。說明養(yǎng)真接骨膠囊樣品可用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查。見表5。

表5　沙門菌的驗證結(jié)果

3討論

中藥是指在中醫(yī)理論指導(dǎo)下應(yīng)用的藥物。中藥傳統(tǒng)劑型是湯劑，但因其體積較大、味苦，服用、攜帶不方便；易發(fā)霉、發(fā)酵、不能久貯；不宜大量制備，也不利于及時搶救危重患者等缺點，因此近年來，廣大中醫(yī)藥研究者對湯劑進(jìn)行了有效的劑型改革，例如中藥合劑、口服液、片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑等，都是盡量保留湯劑藥效，并克服其缺點的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的中成藥新制型。目前中藥材的來源非常復(fù)雜，參差不齊，中藥材科屬不同、環(huán)境不同以及栽培、采收、加工炮制方式不同且品種繁多，造成中成藥的質(zhì)量難以控制，也給中成藥的臨床應(yīng)用帶來了一定的隱患；中成藥生產(chǎn)工藝控制不當(dāng)也是造成成藥質(zhì)量不佳的原因之一。中藥制劑的生產(chǎn)過程對最終成品質(zhì)量的影響至關(guān)重要，不恰當(dāng)?shù)闹苿┕に嚮蛘卟话凑找?guī)程的操作，均會影響制劑的療效以及有效成分的均一性。另一方面，研發(fā)階段生產(chǎn)工藝制定不當(dāng)。比如，有的生產(chǎn)工藝過于復(fù)雜，生產(chǎn)工藝參數(shù)不合理，生產(chǎn)廠家對生產(chǎn)工藝缺乏篩選優(yōu)化方面的系統(tǒng)研究，難以保證制劑質(zhì)量。

在藥物制劑的質(zhì)量檢測中，微生物的檢測是一個十分重要的方面，對于中藥制劑，微生物的檢測和控制尤為重要。由于大部分中成藥的處方十分復(fù)雜，其藥用成分的組成甚至不被研究者完全了解，要對其進(jìn)行質(zhì)量控制，防止劣藥出現(xiàn)，加強品控，防止醫(yī)療事故的發(fā)生，我們必須對微生物限度的檢測方法進(jìn)行驗證，這些方法包括常規(guī)檢測法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法等[6,7]。

養(yǎng)真接骨膠囊為我院自制的中藥制劑，其處方為骨碎補120 g，續(xù)斷60 g，自然銅120 g，黃瓜子400 g，乳香120 g，沒藥120 g，制川烏120 g，土鱉蟲60 g，紅花60 g，川芎120 g，具有較強的滋補肝腎，強筋壯骨，活血化瘀，消腫止痛的作用，能加速成骨、促進(jìn)骨折愈合，用于治療骨折等，在我院應(yīng)用較為廣泛。為保證藥品質(zhì)量，確保使用的有效性和安全性，需要對該藥進(jìn)行微生物限度檢查。養(yǎng)真接骨膠囊成分為中成藥，其成分復(fù)雜，某些成分可能含有一定的抑菌作用，按照《中國藥典》(2010年版)要求，在建立藥品的微生物限度檢查方法時，需要對檢查方法進(jìn)行驗證。

養(yǎng)真接骨膠囊是含有多種中藥成分，其中任何成分含有抑菌性均可影響微生物限度檢查的準(zhǔn)確性，本實驗所應(yīng)用的菌株，在驗證過程中，為防止供試液的抑菌活性對試驗菌株的抑制作用，在操作過程中，一定要注意細(xì)節(jié)，以免對回收率產(chǎn)生影響，本實驗通過稀釋法，對供試品進(jìn)行稀釋，減少其對各類菌株的抑制作用，而在此實驗中，我們采用了平皿法(培養(yǎng)基稀釋法)與常規(guī)法對細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)以及控制菌進(jìn)行了驗證[8]。

本實驗采用平皿法對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌進(jìn)行驗證，上述菌株的回收率均大于70%，說明養(yǎng)真接骨膠囊對上述菌株無抑菌作用。養(yǎng)真接骨膠囊微生物限度檢測的驗證實驗確認(rèn)了該檢測方法的正確性，確定了檢測結(jié)果的有效性與數(shù)據(jù)的可靠性，確保了藥品的質(zhì)量。

近年來，隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，帶動了對中藥復(fù)方質(zhì)量控制從初級研究層次向更深層次邁進(jìn)。多學(xué)科的交叉融合，各種新技術(shù)、新方法的出現(xiàn)也為復(fù)方質(zhì)量控制的研究發(fā)展帶來了新的思路，中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制將仍逐步向藥效物質(zhì)基礎(chǔ)控制的模式轉(zhuǎn)變([9-12])。目前國家藥典及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)目前還不完善，而且國家藥典收載的中藥材和中藥制劑品種很有限，許多中藥材缺乏統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)。很多中成藥指標(biāo)成分檢驗標(biāo)準(zhǔn)過于單一，使企業(yè)容易忽視其它指標(biāo)成分，造成各指標(biāo)成分間的比例失調(diào)，影響中藥制劑的臨床療效。對于中成藥的質(zhì)量控制，我們?nèi)詰?yīng)加快質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的建設(shè)，制定完善的制劑工藝，嚴(yán)格規(guī)范中藥生產(chǎn)的全過程，在此基礎(chǔ)上，多種分析技術(shù)聯(lián)用控制中藥制劑的質(zhì)量([13,14])。

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(收稿日期：2015-11-26)

【中圖分類號】R 915.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)09-1363-04

通訊作者：焦寧，050051石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.026

項目來源：河北省中藥管理局中醫(yī)藥類科研計劃(編號：2012011)

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