糖尿病大鼠骨折愈合過程中VEGF、BMP-2及BMP-7的動(dòng)態(tài)觀察

唐周舟　許永濤　馬亮

434020　湖北省荊州市中心醫(yī)院骨科

?

·論著·

糖尿病大鼠骨折愈合過程中VEGF、BMP-2及BMP-7的動(dòng)態(tài)觀察

唐周舟許永濤馬亮

434020湖北省荊州市中心醫(yī)院骨科

【摘要】目的動(dòng)態(tài)觀察糖尿病模型大鼠骨折愈合過程中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)的變化趨勢(shì)，探索影響糖尿病骨折愈合的機(jī)制。方法選取Wester 雄性大鼠70只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病組[(腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)造模]和對(duì)照組，每組35只。采用線鋸鋸斷2組大鼠的左側(cè)脛骨，采用外固定復(fù)位處理，觀察2組大鼠術(shù)后第1、3、5、7周的血清及骨痂中VEGF、BMP-2、BMP-7的表達(dá)變化。結(jié)果糖尿病組大鼠術(shù)后第1周、術(shù)后第3周的VEGF、BMP-2、BMP-7的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，術(shù)后第5、第7周2組大鼠骨痂組織中的VEGF、BMP-2、BMP-7的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。糖尿病組與對(duì)照組大鼠的血清中VEGF、BMP-2、BMP-7在術(shù)后第1～7周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，糖尿病大鼠術(shù)后第1、第3周BMP-7的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論糖尿病大鼠血清、骨痂組織中BMP-7、BMP-2及VEGF表達(dá)減少可能是其延遲愈合的一個(gè)重要原因。

【關(guān)鍵詞】糖尿??；骨折；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7

糖尿病是體內(nèi)血糖代謝異常導(dǎo)致的內(nèi)分泌失衡性疾病，相關(guān)研究表明，該病不僅是內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，炎性因子以及免疫調(diào)節(jié)因子在其發(fā)生發(fā)展中同樣重要的作用[1]。骨折患者采用外固定或者切口內(nèi)固定治療后，骨折部位愈合往往可以自行愈合，但局部血流供應(yīng)、相關(guān)炎癥損傷以及自身免疫性因素均在一定程度上影響了骨折部分骨痂線的形成[1,2]。糖尿病患者體內(nèi)血糖代謝失衡，動(dòng)脈血中的異常升高的血糖將導(dǎo)致骨折延遲愈合，或者不愈合[3]。隨著細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)的發(fā)展，影響骨折代謝的細(xì)胞因子在骨折愈合中的作用研究愈加受到重視。本研究動(dòng)態(tài)觀察糖尿病模型大鼠骨折愈合過程中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、BMP-7的變化趨勢(shì)，探索影響糖尿病骨折愈合的機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取Wester 雄性大鼠70只，編號(hào)后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為糖尿病組[腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)造模]和對(duì)照組，每組35只。體重230～280 g，平均體重(264±12)g；均喂養(yǎng)于光照12 h、自由進(jìn)食進(jìn)水、濕度40%～60%、溫度23～25℃的環(huán)境中，所有實(shí)驗(yàn)大鼠均購買自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2014-0081)。

1.2造模方法無特定病原體動(dòng)物級(jí)2個(gè)月齡雄性大鼠70只(江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重250～300 g。糖尿病組:于實(shí)驗(yàn)前禁食24 h,實(shí)驗(yàn)時(shí)以4%水合氯醛280 μl/kg腹腔注射麻醉,固定于無菌手術(shù)板上,給予50 mg/kg STZ腹腔內(nèi)一次性快速注射。動(dòng)物單籠喂養(yǎng),定量飲水與普通喂食飼養(yǎng)14 d。糖尿病組大鼠模型在誘導(dǎo)劑注射前和誘導(dǎo)劑注射后14 d。若誘導(dǎo)劑注射前基礎(chǔ)血糖水平<8.0 mmol/L,誘導(dǎo)后14 d血糖水平>11.1 mmol/L,大鼠體重明顯下降,且隨機(jī)抽樣的胰腺組織學(xué)觀察證實(shí)胰島細(xì)胞被破壞,即可視為糖尿病模型誘導(dǎo)成功。

1.3檢測方法攝左下肢X線片,門靜脈采血5 ml,3 000 r/min離心15 min,取上清液冷凍保存待測;處死大鼠后,取骨折斷端及周圍組織,以0.9%氯化鈉溶液沖洗,10%甲醛固定12～24 h備用。全部標(biāo)本采集完成后一次性成批檢測VEGF、BMP-2、BMP-7。骨組織中相關(guān)指標(biāo)的檢測：骨折斷端組織于10%甲醛溶液固定12～24 h后,經(jīng)10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣3周,脫鈣滿意后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚5 μm,HE染色后經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)。

2結(jié)果

2.12組大鼠骨痂組織中VEGF、BMP-2、BMP-7的表達(dá)灰度值變化2組大鼠的骨痂組織中VEGF、BMP-2、BMP-7在術(shù)后第1～3周呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，之后逐漸恢復(fù)；糖尿病組大鼠術(shù)后第1周、第3周均顯著低于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)；術(shù)后第5周、第7周2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.22組大鼠骨血清中VEGF、BMP-2、BMP-7的表達(dá)水平變化2組大鼠血清中VEGF、BMP-2、BMP-7在術(shù)后第1～7周呈先增高后降低，在術(shù)后第5～7周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；糖尿病組大鼠術(shù)后第1、第3周BMP-7的表達(dá)水平顯著的低于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)。見表2。

2.32組大鼠X線片觀察術(shù)后第1周2組X線片下骨痂形成數(shù)量較少，骨痂形成陰影差距不明顯；術(shù)后第3、5周，2組骨折側(cè)脛骨骨折部位的骨痂形成數(shù)量增加，但糖尿病組的骨痂形成透光陰影疏密不均，其光密度明顯低于對(duì)照組；術(shù)后第7周，對(duì)照組骨折已經(jīng)基本愈合，骨折線消失，糖尿病組的骨折斷端仍然存在骨痂稀疏不均勻，骨折線存在。見圖1～4。

表12組大鼠骨痂組織中VEGF、BMP-2、BMP-7的表達(dá)灰度值

指標(biāo)術(shù)后第1周術(shù)后第3周術(shù)后第5周術(shù)后第7周VEGF 對(duì)照組163.4±7.2146.4±8.0158.6±6.1175.0±8.9 糖尿病組157.1±8.9140.1±6.9155.2±7.3174.8±8.5 t值2.9542.7611.2090.894 P值<0.05<0.05>0.05>0.05BMP-2 對(duì)照組154.6±5.5139.4±6.2155.5±7.2168.9±9.1 糖尿病組143.7±6.1130.5±7.4156.3±8.1167.2±8.8 t值3.0293.1160.4180.397 P值<0.05<0.05>0.05>0.05BMP-7 對(duì)照組181.4±8.3170.2±7.7182.0±7.9189.9±8.5 糖尿病組158.0±9.1144.3±6.1181.5±8.3187.8±9.3 t值4.5925.0130.6040.775 P值<0.001<0.001>0.05>0.05

表22組大鼠骨血清中VEGF、BMP-2、BMP-7的表達(dá)水平變化

指標(biāo)術(shù)后第1周術(shù)后第3周術(shù)后第5周術(shù)后第7周VEGF 糖尿病組1.77±0.092.98±0.142.31±0.081.72±0.09 對(duì)照組1.79±0.123.04±0.122.32±0.091.69±0.10 t值0.5070.6180.4920.528 P值>0.05>0.05>0.05>0.05BMP-2 糖尿病組2.20±0.072.70±0.122.31±0.092.15±0.07 對(duì)照組2.35±0.102.83±0.112.30±0.072.13±0.05 t值0.7290.6740.0840.105 P值>0.05>0.05>0.05>0.05BMP-7 糖尿病組1.57±0.382.04±0.411.96±0.331.40±0.27 對(duì)照組3.01±0.923.29±0.572.04±0.391.47±0.30 t值4.0963.1860.2630.379 P值<0.01<0.05>0.05>0.05

糖尿病組對(duì)照組

圖1術(shù)后第1周X線片

糖尿病組對(duì)照組

圖2術(shù)后第3周X線片

3討論

在巨大外力作用下，出現(xiàn)了骨折移位線，骨皮質(zhì)連續(xù)性中斷，并可出現(xiàn)骨小梁的微小隱匿性骨折。對(duì)于骨折部位無明顯肌腱斷裂、神經(jīng)或者血管損傷的患

糖尿病組對(duì)照組

圖3術(shù)后第5周X線片

糖尿病組對(duì)照組

圖4術(shù)后第7周X線片

者，可早期清創(chuàng)一期復(fù)位[4,5]，而對(duì)于創(chuàng)傷較大，切口呈開放性的骨折，需要徹底清除壞死的肌瓣及異物，促進(jìn)傷口預(yù)后和骨折部位的固定。一般認(rèn)為，影響骨折愈合的因素包括全身因素及局部因素如骨折的類型和數(shù)量、骨折部位的血液供應(yīng)、軟組織的損傷程度、軟組織的嵌入、感染等[6,7]。其中在骨痂形成、塑形與改建期，骨折部位骨小梁的形成對(duì)于骨折愈合具有重要意義。原始骨痂形成期骨內(nèi)、外膜增生，新生血管長入，成骨細(xì)胞大量增生，合成并分泌骨基質(zhì)，而骨板形成塑形期可見原始骨痂中新生骨小梁增粗，排列逐漸規(guī)則和致密[8]。VEGF是最有力的促血管生長因子,VEGF的表達(dá)受多種因素的調(diào)控,BMP能夠誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞,導(dǎo)致新骨形成[9,10]。本研究通過動(dòng)態(tài)分析觀察VEGF以及BMP的變化，進(jìn)而揭示其在骨折愈合中的作用。

本研究觀察到，2組骨折大鼠模型在術(shù)后第1周2組大鼠的X片下骨痂形成數(shù)量較少，且均無明顯骨痂形成，在這一時(shí)期，2組均處于炎癥期，主要表現(xiàn)為血管擴(kuò)張、血漿滲出、水腫及炎性細(xì)胞浸潤，并有少量新生血管以及軟骨痂形成，但無明顯骨痂線的形成。術(shù)后第3、5周，2組大鼠骨折側(cè)脛骨骨折部位的骨痂形成數(shù)量增加，但可以觀察到糖尿病組大鼠其骨痂數(shù)量較少，提示糖尿病可以影響軟骨痂期或者硬骨痂期大鼠體內(nèi)骨痂的形成或者軟骨痂的塑形，導(dǎo)致術(shù)后7周仍然出現(xiàn)部分骨痂線未完全愈合，出現(xiàn)延遲愈合。自第2周,隨著骨折的修復(fù),肉芽組織長入血腫,軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞侵入發(fā)生軟骨內(nèi)骨化及膜內(nèi)骨化，而VEGF、BMP-2、BMP-7在這一時(shí)期內(nèi)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，提示了VEGF對(duì)于新生血管的調(diào)控作用。骨形成蛋白誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨或者骨細(xì)胞對(duì)于軟骨的形成、骨化及內(nèi)膜骨化具有明顯的一致性，提示了VEGF、BMP-2、BMP-7在術(shù)后4周內(nèi)顯著促進(jìn)骨折愈合。而術(shù)后4周內(nèi)3個(gè)指標(biāo)明顯較對(duì)照組低,提示在愈合關(guān)鍵時(shí)期,這些促骨骼生長因子的減少是糖尿病骨折延遲愈合的重要原因。這對(duì)這一發(fā)現(xiàn)，臨床上可以對(duì)于糖尿病患者進(jìn)行體外VEGF、BMP-2、BMP-7的誘導(dǎo)注射治療，通過特異性地合成誘導(dǎo)成熟富集，定向注射到骨折部位，進(jìn)而有利于促進(jìn)骨折愈合[11,12]。然而術(shù)后5～7周的骨折大鼠，其體內(nèi)血清以及骨組織中VEGF、BMP-2、BMP-7的表達(dá)無明顯差異，考慮糖尿病組大鼠體內(nèi)的低水平可以反饋性調(diào)節(jié)機(jī)體分泌相關(guān)骨折影響因子，但這一時(shí)期的骨誘導(dǎo)分化蛋白及血管形成調(diào)控因子的表達(dá)對(duì)于相關(guān)分化較為成熟的軟骨或者骨內(nèi)膜等組織的影響較小，難以發(fā)揮促進(jìn)骨折愈合的作用。

綜上所述，糖尿病大鼠血清、骨痂組織中BMP-7、BMP-2及VEGF表達(dá)減少可能是其延遲愈合的一個(gè)重要原因，但各因素、各細(xì)胞因子之間的相互作用和影響的機(jī)制不清楚，需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

1何畔,常磊,王愉思.糖尿病兔骨折愈合過程中神經(jīng)生長因子及血小板衍生生長因子-A的表達(dá).廣東醫(yī)學(xué),2014,22:2999-3001.

2李潤良.老年糖尿病人髖部骨折手術(shù)治療分析.糖尿病新世界,2015,25:94-96.

3陳玉鳳,郭獻(xiàn)山,王林棟,等.糖尿病合并非創(chuàng)傷性骨折的發(fā)生部位和危險(xiǎn)因素.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,25:138-141.

4Beamer B,Hettrich C,Lane J.Vascular endothelial growth factor: an essential component of angiogenesis and fracture healing.HSS J,2010,6:85-94.

5Song XS,Zhou XZ,Zhang G,et al.Low-dose X-ray irradiation promotes fracture healing through up-regulation of vascular endothelial growth factor.Med Hypotheses,2010,75:522-524.

6倪晶貞,王琪紅,宋濤.老年糖尿病患者髖部骨折后肺部感染情況觀察及護(hù)理效果分析.中國高等醫(yī)學(xué)教育,2015,23:142-143.

7潘艷麗,唐松濤,竇家慶,等.定量CT評(píng)價(jià)老年2型糖尿病患者腰椎骨密度及骨折的研究.中國骨質(zhì)疏松雜志,2012,18:323-326.

8戴蓉,劉華清,顧勤明,等.高齡住院老年人中2型糖尿病與老年性骨折呈負(fù)相關(guān)—病例對(duì)照研究.中國骨質(zhì)疏松雜志,2013,19:1281-1285.

9陳曉佩,吳天鳳,鄭和昕,等.骨折風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具(FRAX)對(duì)中老年2型糖尿病患者骨折風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測價(jià)值.中華老年醫(yī)學(xué)雜志,2015,34:168-170.

10周健強(qiáng),付昆,李洪潮,等.糖尿病對(duì)股骨粗隆骨折患者圍術(shù)期發(fā)生并發(fā)癥影響的研究.重慶醫(yī)學(xué),2015,43:407-409.

11Chu T,Liu Y,Wang Z,et al.Sustained vascular endothelial growth factor blockade by antivascular endothelial growth factor antibodies results in nonunion in the process of fracture healing in rabbits.J Trauma,2009,66:1180-1183.

12Dong LQ,Yin H,Wang CX,et al.Effect of the timing of surgery on the fracture healing process and the expression levels of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein-2.Exp Ther Med,2014,8:595-599.

Dynamic observation on the changes of BMP-7,BMP-2 and VEGF during fracture healing in diabetic rat models

TANGZhouzhou,XUYongtao,MALiang.

CentralHospitalofJingzhouCity,Hubei,Jingzhou434020,China

【Abstract】ObjectiveTo observe dynamically the changes of vascular endothelial growth factor (VEGF), bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) during fracture healing in diabetic rats,and to explore the mechanism of affecting fracture healing in diabetic rats.Methods Seventy Wistar male rats were selected in the study,according to random digits table these rats were divided into diabetes group (n=35) in which the rats were injected intraperitoneally with streptozotocin (STZ) to establish diabetes models, and the other 35 rats were served as control group. The left tibias of rats in both groups were sawn to break,then were treated by external fixation reduction.The changes of expression levels of VEGF,BMP-2,BMP-7 in serum and bony callus were detected and observed on 1w,3w,5w,7w after operation.ResultsThe expression levels of BMP-7,BMP-2 and VEGF in bony callus of diabetes group were significantly lower than those in control group on 1w,3w after operation (P<0.05),however, there were no significant differences in the expression levels of VEGF,BMP-2,BMP-7 in bony callus on 5w,7w after operation between two groups (P>0.05). There were no significant differences in the serum levels of VEGF,BMP-7,BMP-7 from the first week to the seventh week after operation between two groups (P>0.05),except that the expression levels of BMP-7 in diabetes group on 1w,3w after operation were significantly lower than those in control group (P>0.05).ConclusionThe decrease of expression levels of BMP-7,BMP-2,VEGF in serum and bone callus of diabetic rats may be an important cause of delayed healing.

【Key words】diabetes mellitus;fracture;vascular endothelial growth factor;BMP-2;BMP-7

(收稿日期：2015-11-17)

【中圖分類號(hào)】R 274.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)09-1297-03

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.004

項(xiàng)目來源：湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):2015FFB05410)