高血壓合并房顫患者外周血SIRT1表達(dá)及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系

歐陽春，張里克，盧遠(yuǎn)航，李先林

(湖北省中山醫(yī)院，武漢430030)

高血壓合并房顫患者外周血SIRT1表達(dá)及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系

歐陽春，張里克，盧遠(yuǎn)航，李先林

(湖北省中山醫(yī)院，武漢430030)

目的 探討高血壓合并房顫患者外周血沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)mRNA和蛋白表達(dá)水平及其與氧化應(yīng)激的關(guān)系。方法 選擇高血壓合并房顫患者60例，根據(jù)房顫類型分為持續(xù)房顫組26例和陣發(fā)房顫組34例，另選高血壓竇性心律患者40例(對(duì)照組)，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blotting法檢測(cè)各組外周血單核細(xì)胞SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)；采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)外周血丙二醛(MDA)，免疫比濁法檢測(cè)外周血高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)；分析外周血SIRT1表達(dá)與MDA、hs-CRP的關(guān)系。結(jié)果 陣發(fā)房顫組SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于持續(xù)房顫組、對(duì)照組(P均<0.05)，而持續(xù)房顫組、對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。持續(xù)房顫組血清MDA、hs-CRP水平均顯著高于陣發(fā)房顫組和對(duì)照組(P均<0.05)；陣發(fā)性房顫組血清MDA、hs-CRP水平較對(duì)照組雖有升高趨勢(shì)，但兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。持續(xù)房顫組和陣發(fā)房顫組SIRT1表達(dá)與MDA呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)，與hs-CRP無明顯相關(guān)性(P均>0.05)，對(duì)照組SIRT1表達(dá)與MDA、hs-CRP均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。結(jié)論 SIRT1是心肌細(xì)胞的保護(hù)因素，與氧化應(yīng)激呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

高血壓；房顫；氧化應(yīng)激；沉默信息調(diào)節(jié)因子1；丙二醛；高敏C反應(yīng)蛋白

心房顫動(dòng)(簡稱房顫)是臨床常見的心律失常之一，有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的活性氧簇在促進(jìn)房顫的發(fā)生中具有重要作用[1，2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；福赏ㄟ^調(diào)節(jié)心臟活性氧簇，參與對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)控[3，4]。因此推測(cè)，外周血SIRT1表達(dá)變化可能影響房顫的發(fā)生、發(fā)展過程，但目前鮮見關(guān)于SIRT1與房顫及氧化應(yīng)激關(guān)系的報(bào)道。本研究觀察高血壓合并房顫患者外周血SIRT1表達(dá)變化，并分析SIRT1與氧化應(yīng)激的關(guān)系，旨在為房顫的預(yù)防及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年7月～2014年7月在我院住院治療的高血壓合并房顫患者60例。高血壓的診斷參照《中國高血壓防治指南》(2010年版)[5]；房顫的診斷標(biāo)準(zhǔn)：心電圖顯示P波消失，代之以大小不等、形狀各異、間隔不等、不規(guī)則的細(xì)小f波，頻率一般為350～600次/min，f波間無等電位線存在，其發(fā)作呈持續(xù)(持續(xù)時(shí)間6～12個(gè)月)或陣發(fā)性(每次發(fā)作時(shí)間≤48 h，服用藥物后消失或自行消失)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并冠心病、風(fēng)濕性心臟病者；②合并嚴(yán)重感染或伴有自身免疫性疾病者；③肝腎功能異?；蚝喜⒑粑到y(tǒng)疾病者；④罹患糖尿病、繼發(fā)性高血壓或惡性腫瘤者。根據(jù)房顫類型分為持續(xù)房顫組26例、陣發(fā)房顫組34例。持續(xù)房顫組男11例、女15例，年齡(56.8±6.3)歲，合并高血脂23例；陣發(fā)房顫組男14例、女20例，年齡(57.6±7.5)歲，合并高血脂29例。同期另選在我院就診的高血壓竇性心律患者40例(對(duì)照組)，男16例、女24例，年齡(55.9±6.1)歲，合并高血脂33例。三組性別、年齡及合并高血脂情況等具有可比性。

1.2 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.2.1 外周血SIRT1 mRNA ①總mRNA提取：抽取各組肘靜脈血5 mL，置于抗凝管中，2 500 r/min離心10 min，分離單核細(xì)胞；抽取單核細(xì)胞，置于離心管中，加入5倍生理鹽水搖勻，2 500 r/min離心15 min，棄去上清液；再加入1.5 mL TRIzol溶液，充分振蕩使細(xì)胞完全裂解；分別加入100 μL氯仿、500 μL異丙醇搖勻，靜置10 min，2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀用吸水紙吸干，室溫干燥5 min。將提取的總RNA加入1 μL溴酚藍(lán)，置于瓊脂糖凝膠上樣孔內(nèi)，常規(guī)電泳20 min，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA光密度(OD)，OD260/OD280為1.8～2.0為合格。②cDNA合成：采用SYBR Green Assay逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。將提取的總mRNA按照以下條件逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：總RNA 2 μL，2×buffer 10 μL，Oligo(DT) 0.5 μL，dNTP 10 mmol，逆轉(zhuǎn)錄酶22 U/μL，DMSO 44 μL，RNasin 0.25 μL，ddH2O 0.25 μL。上述體系放入PCR擴(kuò)增儀中反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：60 ℃變性5 min，30 ℃變性1 min，60 ℃退火20 min，95 ℃延伸10 min，最后10 ℃延伸5 min。③SIRT1 mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)，SIRT1上游引物：5′-ATGTAGAGTCTGATGGTCTAGC-3′，下游引物：5′-CGTTGTGGTGTTAGTTTCTGCG-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CACGATCATCATCTCTCAGCTT-3′，下游引物：5′-AAGTCGTTCGGATGGCTGTACA-3′；PCR反應(yīng)體系20 μL：Taq 10 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。根據(jù)擴(kuò)增曲線與溶解曲線計(jì)算Ct值，目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct；ΔΔCt=試驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。

1.2.2 外周血SIRT1蛋白 采用Western blotting法。將外周血用裂解液處理后，按照Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量；凝膠蛋白電泳，將電泳凝膠用NC膜轉(zhuǎn)膜后封閉，再置于封閉液稀釋的Ⅰ抗孵育，化學(xué)發(fā)光顯影后掃描，White/Ultraviolet Transilluminator凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析半定量。以β-actin作為內(nèi)參照，二者比值為相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo) 清晨空腹抽取各組肘靜脈血2 mL，靜置1 h，2 500 r/min分離15 min，取血清，保存?zhèn)錂z。采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)血清丙二醛(MDA)、采用免疫比濁法檢測(cè)血清高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 各組外周血SIRT1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)比較

注：與持續(xù)房顫組比較，*P<0.05；與陣發(fā)房顫組比較，#P<0.05。

2.2 各組血清MDA、hs-CRP水平比較 見表2。

表2 各組血清MDA、hs-CRP水平比較

注：與持續(xù)房顫組比較，*P<0.05。

2.3 SIRT1 mRNA表達(dá)與MDA、hs-CRP的關(guān)系 相關(guān)性分析顯示，持續(xù)房顫組、陣發(fā)房顫組SIRT1 mRNA表達(dá)與MDA均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.589、-0.324，P均<0.05)，與hs-CRP均無明顯相關(guān)性(r分別為0.171、0.198，P均>0.05)；對(duì)照組SIRT1 mRNA表達(dá)與MDA、hs-CRP均無明顯相關(guān)性(r分別為0.203、0.257，P均>0.05)。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，60歲以上人群房顫的發(fā)病率約為1%，其發(fā)病率隨著年齡增長逐漸升高[6]。研究證實(shí)，高血壓伴發(fā)房顫患者發(fā)生栓塞性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。房顫發(fā)生時(shí)心房肌的氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加、氧化還原基因表達(dá)失衡以及線粒體DNA存在氧化損傷，表明氧化應(yīng)激與房顫的發(fā)生有關(guān)；氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)損傷線粒體和鈣泵功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而激活依賴鈣離子蛋白水解酶，促使心肌收縮功能減退，繼而導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)[7]。因此，對(duì)高血壓患者給予抗氧化作用藥物，可防止心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，減少房顫的發(fā)生。

SIRT是存在于多種生物中的高度保守基因，在人類共有7個(gè)同源基因，目前研究較多的是SIRT1。SIRT1在多種疾病中參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控[8]。樊磊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1與先天性心臟病、心肌炎、心力衰竭等心臟疾病密切相關(guān)；SIRT1主要參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的生長、分化過程，對(duì)心臟的發(fā)育具有促進(jìn)和保護(hù)作用[10]。Ulas等[11]在動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，激活SIRT1能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NO合酶的活性，改善內(nèi)皮功能，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化。趙軍等[12]通過建立心室快速起搏所致心力衰竭犬模型發(fā)現(xiàn)，心肌SIRT1表達(dá)水平顯著升高，提示SIRT1能夠避免心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，證實(shí)SIRT1能夠抑制心臟組織重構(gòu)所致的心力衰竭。氧化應(yīng)激反應(yīng)參與了房顫的發(fā)生，其機(jī)制可能是氧化應(yīng)激導(dǎo)致心房組織發(fā)生結(jié)構(gòu)和電生理重構(gòu)。譚含璇等[13]對(duì)心房快速起搏房顫犬給予抗氧化劑后，房顫發(fā)生率明顯降低，房顫持續(xù)時(shí)間明顯縮短，證實(shí)活性氧清除劑能夠抑制心房發(fā)生電生理重構(gòu)。胡明珠等[14]報(bào)道，SIRT1表達(dá)上調(diào)能夠激活FOXO信號(hào)途徑，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平顯著降低，從而避免機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。鄔云斌等[15]也證實(shí)，SIRT1能夠通過抑制氧化應(yīng)激水平，阻斷p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，SIRT1能夠使p53去乙?；?，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝；而能量限制會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)增加，使細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷減輕。推測(cè)SIRT1可能參與了房顫的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，陣發(fā)房顫組SIRT1表達(dá)水平顯著升高，提示在房顫早期SIRT1高表達(dá)能夠抑制房顫的發(fā)展，但隨著陣發(fā)性房顫發(fā)展成持續(xù)性房顫，SIRT1表達(dá)開始降低。本研究還發(fā)現(xiàn)，持續(xù)房顫組血清MDA、hs-CRP水平顯著高于對(duì)照組、陣發(fā)房顫組，而陣發(fā)房顫組與對(duì)照組比較，血清MDA、hs-CRP水平也有升高趨勢(shì)，提示炎癥對(duì)房顫的促發(fā)和維持可能有一定作用。相關(guān)分析顯示，無論持續(xù)還是陣發(fā)房顫，SIRT1 mRNA表達(dá)與MDA均呈負(fù)相關(guān)，而對(duì)照組SIRT1 mRNA表達(dá)與MDA、hs-CRP無明顯相關(guān)性，與孫雪林[16]等報(bào)道一致。當(dāng)炎癥因子沉積于心房組織中，會(huì)導(dǎo)致局部組織發(fā)生纖維化，進(jìn)而誘發(fā)房顫；炎癥與氧化應(yīng)激互為因果，共同導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生重構(gòu)[17，18]。房顫患者SIRT1表達(dá)與MDA呈負(fù)相關(guān)，說明SIRT1能夠抑制氧化應(yīng)激，特別對(duì)于陣發(fā)房顫。SIRT1能夠在早期抑制房顫的發(fā)展。但隨著房顫程度的加重，這種保護(hù)作用開始減弱[19，20]。

綜上所述，高血壓合并房顫患者外周血SIRT1表達(dá)增加，SIRT1與氧化應(yīng)激呈負(fù)相關(guān)，與hs-CRP無明顯相關(guān)性，故認(rèn)為SIRT1是心肌細(xì)胞的保護(hù)因素，通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)可抑制房顫的進(jìn)展。但本研究未充分考慮持續(xù)SIRT1表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞和房顫的不利影響，確切結(jié)論還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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