痰熱清注射液輔助化療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果及其作用機制

李珍，葉志華，馮娟娟

(河南省人民醫(yī)院，鄭州450008)

·基礎(chǔ)研究·

痰熱清注射液輔助化療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果及其作用機制

李珍，葉志華，馮娟娟

(河南省人民醫(yī)院，鄭州450008)

目的 觀察痰熱清注射液輔助化療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果，并探討其作用機制。方法 選擇C57BL/6小鼠50只，隨機分為空白組、模型組、順鉑組、痰熱清組及順鉑聯(lián)合痰熱清組。除空白組外，其余組建立Lewis肺癌模型。接種Lewis肺癌瘤株后1天，順鉑組隔天腹腔注射1.5 mg/kg順鉑，痰熱清組腹腔注射3.5 mL/kg痰熱清注射液，順鉑聯(lián)合痰熱清組腹腔注射等量順鉑、痰熱清注射液；空白組、模型組腹腔注射等量生理鹽水。各組連續(xù)給藥2周。測量小鼠接種后5、7、10、14天腫瘤體積，計算腫瘤抑制率。末次給藥后，檢測股骨骨髓細(xì)胞(BMC)計數(shù)及外周血WBC、RBC、PLT，并檢測小鼠血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管抑素(AS)、內(nèi)皮抑素(ES)、IL-2、TNF-α、IFN-γ水平。結(jié)果 接種14天，與模型組比較，順鉑組、痰熱清組、順鉑聯(lián)合痰熱清組腫瘤體積縮小(P<0.05或<0.01)，且順鉑聯(lián)合痰熱清組效果更明顯。順鉑聯(lián)合痰熱清組腫瘤抑制率明顯高于順鉑組和痰熱清組(P<0.05或<0.01)。與模型組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組BMC、WBC、RBC、PLT明顯降低(P<0.05或<0.01)，但均高于順鉑組、均低于痰熱清組(P<0.05或<0.01)。與空白組比較，模型組血清VEGF、TNF-α水平明顯升高，AS、ES、IL-2、IFN-γ明顯降低(P均<0.01)。與模型組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組血清VEGF、TNF-α明顯降低，AS、ES、IL-2、IFN-γ明顯升高(P<0.05或<0.01)。與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組血清VEGF更低，AS、ES、IL-2更高(P均<0.01)，與痰熱清組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組VEGF、TNF-α更高，AS、ES、IL-2、IFN-γ更低(P均<0.01)。結(jié)論 痰熱清注射液輔助化療能改善Lewis肺癌小鼠外周血細(xì)胞異常，增強免疫功能，抑制腫瘤生長；其機制可能與降低血清VEGF、TNF-α，升高AS、ES、IL-2、IFN-γ水平有關(guān)。

肺癌；痰熱清注射液；免疫功能；內(nèi)皮生長因子；血管抑素；小鼠

腫瘤擴散、轉(zhuǎn)移與血管形成有關(guān)，其血管形成受體內(nèi)多種因素調(diào)控，如內(nèi)皮生長因子、血管抑素等[1～3]。痰熱清注射液為一種中藥制劑，具有清熱、化痰、解毒之功效， 臨床主要用于風(fēng)溫肺熱病痰熱阻肺證。研究表明，痰熱清注射液在抑制肺癌生長、穩(wěn)定和控制病灶、延緩復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面有一定的作用[4,5]。2014年2月～2015年8月，我們觀察了痰熱清注射液聯(lián)合化療對小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級C57BL/6小鼠56只，4周齡，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(冀)2010-0038。Lewis肺癌瘤株，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。LD-5M立式低速冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；精密移液器，端士Socorex公司；BIO-RAD酶標(biāo)儀Xmark，美國BIO-RAD伯樂公司；DW-86L626型低溫冰箱，青島海爾股份有限公司。痰熱清注射液(批號：1107114)，上海凱寶藥業(yè)有限公司；順鉑(批號：2030111DB)，齊魯制藥公司；小鼠VEGF試劑盒(批號：HTAC017)、ES試劑盒(批號：HTAC023)、AS試劑盒(批號：HTAC011)、IL-2試劑盒(批號：HTAC012)、TNF-α試劑盒(批號：HTAC009)、IFN-γ試劑盒(批號：HTAC015)，均為ELISA試劑盒，由Andy-gene公司提供。

1.2 模型制備 參照文獻[6]方法建立Lewis肺癌小鼠模型。37 ℃溫水復(fù)蘇Lewis肺癌瘤株，調(diào)整瘤株密度至1×107/mL。取0.1 mL接種于2只小鼠右腋皮下；接種第11天，將小鼠以脫頸方式處死，取生長良好的癌組織，洗凈，剪碎，研磨，調(diào)整腫瘤細(xì)胞密度至1×107/mL，再次接種于小鼠，重復(fù)上述操作。參照上述方法將接種3次的腫瘤細(xì)胞接種于40只小鼠右腋皮下。

1.3 動物分組及處理 取荷瘤小鼠40只，隨機分為模型組、順鉑組、痰熱清組、順鉑聯(lián)合痰熱清組，每組10只。另取未制模小鼠10只作為空白組。接種Lewis肺癌瘤株后1天，順鉑組隔天腹腔注射順鉑1.5 mg/kg；痰熱清組腹腔注射痰熱清注射液3.5 mL/kg，順鉑聯(lián)合痰熱清組應(yīng)用順鉑、痰熱清注射液，劑量及用法分別同順鉑組及痰熱清組；空白組、模型組腹腔注射等量生理鹽水。各組連續(xù)給藥2周。造模過程中或給藥過程中部分小鼠死亡，最終空白組、模型組、順鉑組、痰熱清組、順鉑聯(lián)合痰熱清組剩余小鼠分別為9、8、7、9、8只。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 腫瘤體積及抑瘤率 模型組、順鉑組、痰熱清組、順鉑聯(lián)合痰熱清組接種后5、7、10、14天，采用動物腫瘤測量跟蹤系統(tǒng)，電子數(shù)顯卡尺測量腫瘤最長徑、最短徑(cm)，腫瘤體積=腫瘤最長徑×最短徑×最短徑/2，計算腫瘤抑制率=(腫瘤體積-模型組腫瘤體積)/模型組腫瘤體積×100%。

1.4.2 外周血細(xì)胞及股骨骨髓細(xì)胞(BMC)數(shù)量 取小鼠股動脈血0.5 mL，采用流式細(xì)胞儀計數(shù)外周血WBC、RBC、PLT；待小鼠處死后，剪取小鼠股骨，PBS沖洗骨髓腔，4 000 r/min離心15 min，棄上清，加入PBS混勻。光鏡下于計數(shù)板上計數(shù)單根股骨全部骨髓細(xì)胞(BMC)。

1.4.3 血清相關(guān)細(xì)胞因子檢測 取小鼠股動脈血，靜置30 min，4 000 r/min離心15 min，取上清，低溫保存，備用。采用酶標(biāo)儀，ELISA法檢測外周血血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管抑素(AS)、內(nèi)皮抑素(ES)、IL-2、TNF-α、IFN-γ水平。嚴(yán)格按試劑盒說明步驟檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤體積及抑制率比較 見表1。

表1 各組不同時間腫瘤體積及腫瘤抑制率比較±s)

注：與模型組同時間點比較，#P<0.05，##P<0.01；與順鉑組同時間點比較，△P<0.05，△△P<0.01；與痰熱清組同時間點比較，*P<0.05，**P<0.01。與同組接種5天比較，▲▲P<0.01；與同組接種7天比較，○P<0.05；與同組接種10天比較，◆P<0.05。

2.2 各組外周血細(xì)胞及BMC數(shù)量比較 見表2。

2.3 各組血清相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 見表3。

表2 各組外周血細(xì)胞及BMC數(shù)量比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與痰熱清組比較，◇P<0.05，◇◇P<0.01。

表3 各組血清相關(guān)細(xì)胞因子水平比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與順鉑組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與痰熱清組比較，◇P<0.05，◇◇P<0.01。

3 討論

肺癌的早期發(fā)現(xiàn)率較低，臨床上多數(shù)患者就診時病情已屬中晚期，治愈率極低?；熓欠伟┑闹饕委煼椒?，90%以上的肺癌需要接受化療，但化療除能殺死腫瘤細(xì)胞外，對人體正常細(xì)胞及免疫功能也有損害[7，8]。近年來，中藥復(fù)方制劑作為生物調(diào)節(jié)劑已用于惡性腫瘤的綜合治療，以低毒、廉價、高效等優(yōu)勢受到越來越多的關(guān)注。

痰熱清注射液的主要成分為黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹等，具有清熱、化痰、解毒之功效，可增強機體的免疫功能。痰熱清注射液在臨床輔助治療腫瘤方面有一定的成效。耿秀艷等[9]報道，婦科腫瘤老年患者術(shù)后給予痰熱清注射液霧化吸入可增強患者的免疫功能。楊旭初等[10]報道，肺癌患者應(yīng)用痰熱清注射液可減少放射性肺炎及放射性肺纖維化的發(fā)生。李永偉等[11]報道，痰熱清注射液可改善原發(fā)性肝癌肝動脈栓塞化療術(shù)后患者栓塞綜合征的發(fā)生，患者發(fā)熱持續(xù)時間縮短。本研究結(jié)果顯示，接種腫瘤細(xì)胞第14天，與模型組比較，順鉑組、痰熱清組、順鉑聯(lián)合痰熱清組腫瘤體積均明顯縮小，但順鉑聯(lián)合痰熱清組體積明顯小于、抑瘤率明顯高于順鉑組、痰熱清組，提示痰熱清注射液具有增強順鉑抑制腫瘤生長的作用。

骨髓是淋巴細(xì)胞發(fā)育、分化成熟的主要場所之一，與機體的抗腫瘤免疫功能密切相關(guān)，在化療過程中，骨髓極易受到損傷，而骨髓細(xì)胞數(shù)量可反映機體免疫功能狀態(tài)及淋巴細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)。本研究中，與模型組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組BMC、WBC、PLT、RBC明顯降低，但均高于順鉑組、低于痰熱清組，提示順鉑聯(lián)合痰熱清能保護化療小鼠的骨髓，促進淋巴細(xì)胞分化、發(fā)育及發(fā)揮免疫活性，進而增強淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

IFN-γ是典型的Th1類細(xì)胞因子，TNF-α由巨噬細(xì)胞及活化T細(xì)胞產(chǎn)生，二者均可促進抗原提呈細(xì)胞對腫瘤抗原的提呈及細(xì)胞毒性T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別，在機體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[12,13]。IL-2能夠誘導(dǎo)干擾素和多種細(xì)胞因子的分泌，是免疫調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，能促進Fas抗原的表達(dá)，促進細(xì)胞凋亡[14]。馬鳴等[15]研究證實，痰熱清注射液對化療造成的機體免疫功能損傷有明顯的保護作用，并對機體抗腫瘤免疫有明顯的促進作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組血清TNF-α明顯降低，IL-2、IFN-γ明顯升高；與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組的IL-2更高；與痰熱清組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組TNF-α更高，IL-2、IFN-γ更低；這說明IFN-γ、TNF-α、IL-2可增強淋巴細(xì)胞抗腫瘤免疫活性，從而改善腫瘤患者機體的免疫狀態(tài)。與痰熱清組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組IFN-γ、IL-2更低，TNF-α、VEGF更高，說明痰熱清與順鉑二者具有協(xié)同作用，聯(lián)合應(yīng)用可更好地改善腫瘤患者機體的免疫狀態(tài)。

血管生成促進因子VEGF主要通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的 PI3K 等信號通路而發(fā)揮調(diào)控作用[16]；血管生成抑制因子主要包括AS、ES，AS主要通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移來發(fā)揮其抗腫瘤作用[17]；而ES具有廣泛的抗癌活性，能干擾新的血管生成，是最有效的內(nèi)源性血管生長抑制劑之一[18]。本研究結(jié)果顯示， 與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組血清VEGF更低，AS、ES更高；與痰熱清組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組血清VEGF更高，AS、ES更低；說明順鉑聯(lián)合痰熱清抑制VEGF、上調(diào)AS、ES水平的效果優(yōu)于順鉑。與痰熱清組比較，順鉑聯(lián)合痰熱清組血清AS、ES更低，VEGF更高，提示痰熱清與順鉑聯(lián)合抑制腫瘤生長的效果更加明顯，兩者協(xié)同對腫瘤產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，熱清注射液能夠改善Lewis肺癌小鼠外周血細(xì)胞異常，增強免疫功能，抑制腫瘤生長，可能與調(diào)控血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、VEGF、ES及AS水平密切相關(guān)。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(81001103)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.008

R734.2

A

1002-266X(2016)20-0025-04

2015-11-11)