羅非魚無乳鏈球菌EsxA基因克隆與原核表達

馬艷平， 梁志凌， 馬江耀， 劉振興， 郝　樂，柯　浩

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東廣州 510640)

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羅非魚無乳鏈球菌EsxA基因克隆與原核表達

馬艷平， 梁志凌， 馬江耀， 劉振興， 郝樂，柯浩*

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東廣州 510640)

摘要：Ⅶ型分泌系統(tǒng)(T7SS)是近年來發(fā)現(xiàn)的分泌系統(tǒng)，分泌兩種胞外蛋白,EsxA基因編碼的ESAT6蛋白和EsxB基因編碼的CFP-10蛋白。分泌蛋白具有良好的免疫原性，促進細菌從巨噬細胞吞噬體逃逸、影響巨噬細胞凋亡及裂解細胞等生物學功能，與致病性密切相關(guān)。以羅非魚源無乳鏈球菌為模板，克隆到294 bp的EsxA基因，將目的序列克隆到pMD18-T載體，經(jīng)測序，目的序列與無乳鏈球菌EsxA基因同源率在99%以上。EsxA基因克隆到pET32a載體中，重組載體在28℃、0.5 mmol/L IPTG誘導條件下表達量最大，可溶性表達。將純化的ESAT6蛋白免疫Balb/c鼠，成功制備ESAT6蛋白鼠多克隆抗體，經(jīng)Western blot，ESAT6蛋白具有良好的反應原性。研究結(jié)果為進一步進行無乳鏈球菌ESAT6蛋白的免疫學功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Ⅶ型分泌系統(tǒng)；無乳鏈球菌；EsxA基因；克隆與表達

Ⅶ型分泌系統(tǒng)(type Ⅶ secretion system, T7SS)由多種組分構(gòu)成，分泌兩種具有免疫原性的胞外蛋白，即EsxA基因編碼的早期分泌抗原靶6(earlier secreted antigen target 6，ESAT6)和EsxB基因編碼的培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filter protein 10, CFP-10)。它們具有良好的免疫原性，能改變宿主細胞信號傳導、促進細菌從巨噬細胞吞噬體逃逸、影響細胞凋亡及裂解細胞等生物學功能，與致病性密切相關(guān)。分支桿菌屬細菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌等細菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)分泌蛋白功能已有文獻報道[1-4]。

對結(jié)核分支桿菌ESAT6和CFP-10的研究最為深入。ESAT6和CFP-10 是結(jié)核分支桿菌重要的T細胞抗原，可被感染結(jié)核分支桿菌的動物或人的T淋巴細胞識別，并可誘導其產(chǎn)生高水平的IFN-γ[5]，同時它也具有刺激B細胞反應的抗原決定簇[6]。近年的研究中，用ESAT6和CFP-10基礎(chǔ)的亞單位疫苗或DNA疫苗，都在動物試驗中顯示出很好的免疫保護性[7-8]。

無乳鏈球菌屬于B群鏈球菌，是重要的人畜共患細菌性疫病致病原。魚類包括羅非魚在內(nèi)的多種魚類均可受到無乳鏈球菌的感染，死亡率很高[9-15]。近年來我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)受到無乳鏈球菌的嚴重威脅。疫苗是防控鏈球菌有效的方法，關(guān)于羅非魚鏈球菌亞單位疫苗的研究是近年來的一個熱點[16-18]，但未見無乳鏈球菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)分泌蛋白ESAT6基礎(chǔ)的疫苗研究。近期學者對無乳鏈球菌ESAT6樣蛋白進行生物信息學分析，認為ESAT6蛋白和CFP-10以同源二聚體的形式發(fā)揮作用。分子C端具有特征性的色氨酸-X-甘氨酸(WXG)序列，ESAT6蛋白與結(jié)核分支桿菌ESAT6有14.9%相似度，與金黃色葡萄球菌ESAT6有22.7%的相似度。晶體結(jié)構(gòu)衍射試驗預測無乳鏈球菌ESAT6蛋白可作為細菌的黏附素參與細菌對宿主細胞的黏附與入侵[19-20]。因此，本試驗對羅非魚無乳鏈球菌ESAT6蛋白進行克隆與表達，分析其分子特征，進一步為無乳鏈球菌ESAT6蛋白的免疫學功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

無乳鏈球菌廣東中新株(ZX1)，由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所水產(chǎn)病害室分離鑒定并保存；大腸埃希菌Dpα、BL21(DE3)菌株、pET32a質(zhì)粒，廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所水產(chǎn)病害室保存；Taq酶、dNTP、pMD-18T載體、內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Maker，TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒,Axygen公司產(chǎn)品；蛋白Maker,Fermentas公司產(chǎn)品；細菌基因組提取試劑盒,天根公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank公布的無乳鏈球菌基因組 (GenBank No.CP003810.1)EsxA基因序列，分別設(shè)計引物(表1)，其中，EsxA-1基因下劃線為BamHⅠ酶切位點，EsxA-2基因下劃線為HindⅢ酶切位點。擴增EsxA基因的完整讀碼框，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

表1　EsxA基因擴增引物序列

1.2.2EsxA基因的克隆與序列分析使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取無乳鏈球菌ZX1株基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，以EsxA-F/EsxA-R為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體16℃連接2 h后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Dpα菌株，涂布Amp+抗性LA平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆進行PCR鑒定，鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pMD18T-EsxA送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。利用BlastT程序、ExPASy程序、Swiss-PDBviewer和Lasergene軟件對目的基因進行序列分析和編碼氨基酸序列活性位點、抗原性分析。

1.2.3重組質(zhì)粒pET32a-EsxA的構(gòu)建利用質(zhì)粒提取試劑盒提取pMD18T-EsxA，用EsxA-1/EsxA-2引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進行PCR純化后，將目的片段酶切產(chǎn)物和pET32a酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Dpα，挑取單克隆菌株進行PCR鑒定和酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒pET32a-EsxA送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。

1.2.4ESAT6蛋白表達、純化用質(zhì)粒提取試劑盒提取pET32a-EsxA重組質(zhì)粒，取1 μL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)BL21(DE3)菌株。將含有重組質(zhì)粒pET32a-EsxA的大腸埃希菌BL21(DE3)接種于10 mL Amp抗性的LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)過夜，再按1∶100比例接種于100 mL無抗性LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖床2 h～3 h，待菌液OD值達到0.4～0.5時，分別加入0.2、0.5、1 mmol/L IPTG，分別于28℃、37℃誘導24 h。離心收集菌體，ddH2O洗滌菌體2次后，再用20 mL ddH2O懸浮菌體，用超聲波破碎30 min，破碎后分別收集上清和沉淀，沉淀用1 mL ddH2O懸浮，分別取20 μL上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳。選取最佳表達條件的上清液，采用Novagen His Bind 蛋白純化試劑盒進行純化。

1.2.5ESAT6蛋白鼠多克隆抗體的制備將純化蛋白進行BCA蛋白定量，按50 μg ESAT6純化蛋白與等體積的完全弗氏佐劑混合，充分乳化后在鼠尾根部進行多點免疫注射，按相同的劑量與等體積的不完全弗氏佐劑混合，間隔14 d進行第2次、第3次以及第4次免疫。4次免疫后第10天，對小鼠斷尾小量采血測定效價。效價達到要求后，用純化的50 μg ESAT6純化蛋白加強免疫，2 d～4 d內(nèi)進行眼球采血，收集、分離得到含有抗ESAT6蛋白的鼠多克隆抗體的血清。

1.2.6Western blot檢測ESAT6蛋白免疫原性純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，經(jīng)160 mA、3 h轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素薄膜上，將轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素薄膜用50 g/L脫脂奶粉封閉液封閉2 h后，先后以鼠抗ESAT6抗體(1∶1 000稀釋)、HRP標記的羊抗鼠抗體(1∶2 000稀釋)在室溫下各孵育1 h后，用DAB顯色試劑盒顯色后檢測。

2結(jié)果

2.1EsxA基因的克隆、序列、活性位點及抗原表位分析

以無乳鏈球菌ZX1菌株的基因組DNA為模板，引物EsxA-F/EsxA-R進行PCR擴增，克隆、測序獲得294 bp的目的序列，該序列含有EsxA基因的完整開放閱讀框，將目的片段克隆到pMD-18T載體上，經(jīng)測序，Blast顯示目的序列與GenBank上已登錄的羅非魚源無乳鏈球菌EsxA基因序列(No.CP003810.1)高度同源(100%)。利用ExPASy蛋白質(zhì)翻譯軟件，該基因編碼蛋白ESAT6具有98個氨基酸，具有WXG 特征性序列(圖1), 與結(jié)核分支桿菌ESAT6有14.9%的相似度，與金黃色葡萄球菌ESAT6有22.7%的相似度。利用Lasergene軟件對ESAT6抗原性進行分析，ESAT6氨基酸序列中可形成符合親水性>0，抗原指數(shù)>0, 表面可及性>1條件的抗原表位共有9個。

圖1　無乳鏈球菌ZX1菌株ESAT6蛋白Clustal W比對結(jié)果

2.2重組表達載體的構(gòu)建、表達與純化

以測序正確的pMD18T-EsxA重組質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴增、膠回收。目的片段和pET32a質(zhì)粒分別經(jīng)雙酶切后進行連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21。挑取陽性克隆菌株，經(jīng)PCR和酶切鑒定，測序證實插入序列正確(圖2)，重組載體命名為pET32a-EsxA。

M.DNA 標準DL 1 000;1.pET32a-EsxA重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果；2.pET32a-EsxA重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

M.DNA Marker DL 1 000;1.PCR results of recombinant plasmid pET32a-EsxA；2.Enzyme digestion result of recombinant plasmid pET32a-EsxA

圖2pET32a-EsxA重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

Fig.2The identification results of recombinant

plasmid pET32a-EsxA

重組表達菌株經(jīng)不同IPTG濃度、不同誘導溫度誘導表達，誘導表達后的菌體經(jīng)超聲波破碎，分別收集上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,顯示目的蛋白僅存在于上清中，表明目的蛋白主要以可溶性形式表達，在28℃、0.5 mmol/L IPTG誘導條件下，表達量最大。表達產(chǎn)物經(jīng)His-Bind蛋白純化試劑盒純化，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示,獲得大小約為28 ku的蛋白條帶(圖3)，與預期大小一致。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.純化的重組ESAT6蛋白；2.誘導的pET32a-ESAT6

M.Protein molecular weight Marker；1.Purified ESAT6 protein； 2.Induced pET32a-ESAT6

圖3重組ESAT6蛋白的SDS-PAGE分析

Fig.3SDS-PAGE analysis of ESAT6 protein

2.3鼠抗ESAT6蛋白多克隆抗體的制備與效價測定

以純化后的蛋白為免疫原，經(jīng)過4次免疫，眼球采血，用間接ELISA方法測定制備的鼠抗血清效價，如表2所示，鼠抗ESAT6蛋白血清的最終效價為1∶160 000。

表2　4次免后間接ELISA方法測定鼠抗

2.4Western blot檢測純化蛋白免疫原性

Westem blot檢測結(jié)果表明，鼠抗ESAT6血清在28 ku處重鏈有一明顯的雜交條帶，與預期的重組蛋白ESAT6分子質(zhì)量大小相符(圖4)，說明ESAT6蛋白具有良好的反應原性。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.純化重組蛋白ESAT6

M.Protein molecular weight Marker；1.Purified ESAT6 protein

圖4重組蛋白ESAT6 Western blot分析

Fig.4Western blot analysis of ESAT6 protein

3討論

EsxA基因編碼的早期分泌抗原6，具有良好的免疫原性。而在無乳鏈球菌中發(fā)現(xiàn)，兩種分泌蛋白以同源二聚體的形式發(fā)揮作用，統(tǒng)稱為ESAT6蛋白。生物信息學分析認為ESAT6、CFP-10異源二聚體是由同源二聚體進化變異而來[20]，我們預測無乳鏈球菌ESAT6同源二聚體也與致病性密切相關(guān)，目前對無乳鏈球菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)研究還未報道，其分泌蛋白ESAT6是否具有免疫原性，是否具有致病力呢？我們期望通過研究，明確ESAT6蛋白的生物學功能。

本研究克隆了羅非魚源無乳鏈球菌ZX1菌株的EsxA基因，Blast顯示EsxA基因具有高度保守性。用ExPAsy軟件預測分析，含有WXG活性位點。據(jù)文獻報道，當親水性>0，抗原指數(shù)>0，表面可及性>1時，形成表位的可能性較大[21]。用Lasgene預測EsxA基因編碼的ESAT6蛋白的抗原性，EsxA編碼ESAT6蛋白可形成9個抗原表位，推測該蛋白具有較強的免疫原性。

本研究將EsxA基因插入到pET32a表達載體中，在原核表達系統(tǒng)中成功獲得重組蛋白，利用原核表達系統(tǒng)表達的重組蛋白以可溶性表達或包涵體的形式存在，可溶性表達存在于上清里，蛋白純化較為方便。包涵體存在于離心沉淀中，這種表達蛋白需經(jīng)過溶解、變性、復性等處理， 蛋白純化步驟繁瑣，本研究獲得了可溶性表達的重組蛋白，為后續(xù)的試驗提供了便利，重組蛋白利用His標簽經(jīng)His-Bind純化柱純化，重組蛋白純度達到95%以上，經(jīng)透析后可直接用于免疫試驗。

本研究制備的抗ESAT6蛋白鼠多抗效價達到1∶160 000。并將其用于ESAT6重組蛋白Western blot鑒定，證實制備的ESAT6重組蛋白具有較好的反應原性。這就為EsxA基因免疫功能的研究奠定了良好的基礎(chǔ)，EsxA基因可作為新型無乳鏈球菌亞單位疫苗的候選基因，并為羅非魚無乳鏈球菌病的基因工程亞單位疫苗的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和試驗材料。

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Clonging and Protokaryon Expression of EsxA Gene ofStreptococcusagalactiaein Tilapia

MA Yan-ping, LIANG Zhi-ling, MA Jiang-yao, LIU Zhen-xing, HAO Le, KE Hao

(GuangdongPublicLabofVeterinaryPublicHealth，InstituteofVeterinaryMedicine，GuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou,Guangdong,510640，China)

Abstract:New discovered type Ⅶ secretion system (T7SS) secrets two extracellular proteins including EsxA coded ESAT6 and EsxB coded CFP-10, which is related to pathogenicity closely. ESAT6 and CFP-10 proteins have diverse functions such as promoting bacteria from phagosome of macrophage,impacting macrophage apoptosis and lysis. The two secreted proteins in T7SS of Streptococcus agalactiae form the homologous dimmers,collectively known as ESAT6 protein,may be bacterial adhesion protein showing important for host-cell attachment and invasion in S.agalactiae through bioinformatics analysis.But ESAT6 protein whether has the virulence and its pathogenesis is not clear,therefore it is necessary to study on it.We cloned 294 bp sequence from tilapia Streptococcus agalactiae.And the sequence was cloned into pMD18-T vector,the homology is 99% with tilapia Streptococcus agalactiae EsxA gene.EsxA gene was cloned into pET32a vector.The best solouble expression was under 0.5 mmol/L IPTG,28℃.In addition,the purified protein was used to immunize Balb/c mice to prepare mouse anti-ESAT6 protein antibody.ESAT6 protein had sastisfied reactogenicity through Western blot test.These results encouraged further research for the immunological function of S.agalactiae ESAT6 protein.

Key words:type Ⅶ secretion system;Streptococcus agalactiae; EsxA gene;clonging and expression

文章編號:1007-5038(2016)04-0035-05

中圖分類號:S852.4;Q789

文獻標識碼:A

作者簡介：馬艷平(1984-), 女, 山東德州人,碩士, 主要從事水產(chǎn)病害學研究。*通訊作者

基金項目：廣東省海洋漁業(yè)局科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(A201401C06);廣州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(GZCQC1202FG04002-01);廣州市科技攻關(guān)項目(2014J4100229)

收稿日期：2015-09-21