• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新孢子蟲二溫式PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

    2016-05-10 09:41:59陳千林王振寶宋迎春劉夢麗許正茂巴音查汗
    動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2016年4期

    陳千林,王振寶,宋迎春,劉夢麗,許正茂,巴音查汗*

    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心,新疆伊寧 835000;3.巴音郭楞蒙古自治州動物疾病控制與診斷中心,新疆庫爾勒 841000)

    ?

    新孢子蟲二溫式PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

    陳千林1,王振寶2,宋迎春3,劉夢麗1,許正茂1,巴音查汗1*

    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心,新疆伊寧 835000;3.巴音郭楞蒙古自治州動物疾病控制與診斷中心,新疆庫爾勒 841000)

    摘要:根據(jù)新孢子蟲Nc2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化反應(yīng)中Taq DNA聚合酶、引物濃度和退火溫度等,建立新孢子蟲二溫式PCR檢測方法。結(jié)果顯示,擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的片段大小(266 bp)相符,未擴(kuò)增出弓形蟲等蟲種的陽性DNA片段;擴(kuò)增片段經(jīng)克隆、測序發(fā)現(xiàn)與引物基因序列的同源性為100%;最低檢出量為32.5 fg/μL,是三步法PCR的10(-1)倍,但循環(huán)時間縮短了38 min;重復(fù)3次對10(-4)、10(-5)、10(-6)和10(-7)稀釋的陽性質(zhì)粒進(jìn)行二溫?cái)U(kuò)增,10(-7)稀釋均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。同時對156份牛全血DNA進(jìn)行檢測,檢出率為10.90%(17/156),與《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)的檢出符合率為83.33%(30/36),二者檢測結(jié)果差異性不顯著(P>0.05)。由此可見,建立的二溫式PCR檢測方法可用于臨床診斷和日常監(jiān)測新孢子蟲,為監(jiān)控“帶蟲宿主”提供技術(shù)支撐。

    關(guān)鍵詞:新孢子蟲;Nc2基因;二溫式PCR

    新孢子蟲病(Neosporiasis)是由犬新孢子蟲(Neosporacaninum)寄生于多種哺乳動物有核細(xì)胞內(nèi)的一種原蟲病。該病可導(dǎo)致妊娠母畜發(fā)生流產(chǎn)、死胎等,新生仔畜發(fā)生運(yùn)動障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等,牛對該病尤為敏感[1]。犬是新孢子蟲的終末宿主兼中間宿主,牛、羊、馬、豬等多種家畜均可作為其中間宿主。宿主通過吞食被孢子化卵囊或速殖子污染的水或飼草而發(fā)生水平感染;胎兒及仔畜可通過胎盤發(fā)生垂直感染[2]。感染后主要寄生于腦、脊髓、神經(jīng)和內(nèi)臟等組織中[3]。據(jù)報(bào)道,該病在牛類動物中的感染率為10%~40%,最高可達(dá)82%[4-5];我國新疆、青海、北京、吉林等地也有報(bào)道[6-7]。由其導(dǎo)致的繁殖障礙性疾病給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于目前還沒有可用于防治新孢子蟲病的有效疫苗和特效藥物,準(zhǔn)確的檢測、監(jiān)控技術(shù)是綜合防治該病的關(guān)鍵。

    與三步法PCR檢測相比,二溫式PCR將退火、延伸合并成一個溫度,在提高退火溫度的同時增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性[8]。Nc2基因是新孢子蟲重要的表面抗原(SRS2)基因,被認(rèn)為是診斷犬新孢子蟲的特異性基因之一[9]。本試驗(yàn)在Nc2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,通過優(yōu)化各反應(yīng)條件,建立了一種特異、靈敏、快捷的二溫式PCR檢測方法。檢測結(jié)果與《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)的檢出符合率為83.33%(30/36)。本研究建立的二溫式PCR檢測方法可用于新孢子蟲病的臨床診斷和流行病學(xué)監(jiān)測。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1試驗(yàn)樣品血樣采集于巴州地區(qū)某4縣1市的156份牛全血;弓形蟲、牛環(huán)形泰勒、牛巴貝斯和牛雙芽巴貝斯等陽性DNA,由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.2試驗(yàn)試劑DNeasy Blood/Tissue,德國QIAGEN公司產(chǎn)品;Premix ExTaq、DNA Marker DL 2 000、Plasmid Purification Kit等,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;pEASY-Blunt Zero Cloning Kit,北京Trans公司產(chǎn)品;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

    1.1.3主要儀器ProFlexTMBase梯度PCR儀,美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品;Qsep 100全自動單通道毛細(xì)管電泳分析儀,中國臺灣Bioptic Inc公司產(chǎn)品;JY 1600C電泳儀,北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品;G: BOX EF(MOT)全自動凝膠成像分析儀,英國SYNGENE公司產(chǎn)品。

    1.2方法

    1.2.1模板DNA制備嚴(yán)格按照QIAGEN DNA提取試劑盒提取血樣DNA,并使用NANO DROP 2 000測得DNA含量,置-20 ℃保存待檢。

    1.2.2引物和PCR擴(kuò)增運(yùn)用Primer Premier 5.0和Oligo 6.24軟件,根據(jù)GenBank中犬新孢子蟲Nc2基因序列(登錄號:JQ410454.1)保守區(qū)設(shè)計(jì)擴(kuò)增長度適用于二溫式PCR檢測的診斷引物Nc2 F和Nc2 R。Nc2 F序列為:5′-CAGGGTAATGCGGATCAGT-3′,Nc2 R序列為:5′ -GCTGGGTAGTGCTCGTC-3′;57℃退火,擴(kuò)增266 bp序列。《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)中引物NCF序列為:5′-GGGTGAACCGAGGGAAT-3′,NCR序列為:5′-TCGCCAGTCAACCTACG-3′;58 ℃退火,擴(kuò)增231 bp序列。委托北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。同時用2對引物共同對全血DNA進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

    1.2.3陽性DNA克隆、測序回收、純化陽性產(chǎn)物連入pEASY-Blunt Zero Clong Vector,再轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Trans 1-T1感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)Amp+/LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后運(yùn)用Plasmid Purification Kit提取菌體質(zhì)粒,并對質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒和克隆菌送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序,對測序結(jié)果列進(jìn)行同源性比對。

    1.2.4優(yōu)化二溫法反應(yīng)體系及循環(huán)條件均勻設(shè)計(jì)法對25 μL反應(yīng)體系的TaqDNA聚合酶、引物濃度和退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化。TaqDNA聚合酶(5 U/μL)選擇0.08 μL~0.16 μL,以0.02 μL為一個梯度;引物(10 pmol/L)選擇0.5 μL~1.5 μL,以0.5 μL為一個梯度;退火溫度參照引物合成的建議溫度,擬設(shè)計(jì)退火-延伸溫度為56℃~72℃,以1℃為一個溫度梯度篩選最佳退火溫度。

    1.2.5特異性試驗(yàn)應(yīng)用優(yōu)化的二溫反應(yīng)條件分別擴(kuò)增新孢子蟲、弓形蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛巴貝斯蟲和牛雙芽巴貝斯蟲陽性DNA,以評價其特異性。

    1.2.6靈敏性試驗(yàn)對陽性質(zhì)粒(濃度為32.5 ng/μL)進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-8,并對每個滴度模板進(jìn)行二溫PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證其靈敏性。

    1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)分別對滴度為10-4(3.25 pg/μL)、10-5(325 fg/μL)、10-6(32.5 fg/μL)和10-7(3.25 fg/μL)的稀釋質(zhì)粒重復(fù)進(jìn)行3次二溫?cái)U(kuò)增,以檢測其重復(fù)性。

    1.2.8樣品檢測應(yīng)用建立的二溫式PCR檢測方法和《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)共同對156份牛全血DNA進(jìn)行檢測,比較2種方法檢出符合率,了解當(dāng)?shù)嘏H盒骆咦酉x病流行情況,并運(yùn)用SPASS軟件對兩種檢測方法進(jìn)行差異性分析。

    2結(jié)果

    2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

    2對引物三步法PCR反應(yīng)體系為25 μL:10 × PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL,上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.1 μL,模板DNA 1 μL。Nc2 F/R循環(huán)溫度為:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s,35次循環(huán);72℃ 5 min。SN/T 3499—2013 NC F/R循環(huán)溫度為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,30次循環(huán);72℃ 10 min。取6 μL產(chǎn)物經(jīng)100 V電泳40 min,分別在266 bp和231 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,均與預(yù)期目的片段大小相符(圖1)。

    M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1~2.兩對引物的陽性檢測;3~4.陰性對照

    M.DNA Marker DL 2 000;1-2.Positive test of two pairs of primers;3-4.Negative control

    圖1PCR擴(kuò)增結(jié)果

    Fig.1PCR amplification results

    2.2PCR產(chǎn)物的克隆、測序結(jié)果

    陽性質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定,獲得266 bp的擴(kuò)增條帶,與預(yù)期目的條帶相符。測序結(jié)果與引物所在基因序列(登錄號:JQ410454.1)的同源性為100 %(圖2)。

    2.3二溫法反應(yīng)體系及循環(huán)條件的優(yōu)化結(jié)果

    均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化的25 μL二溫反應(yīng)體系為:10×PCR buffer(Mg2+plus)2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL,上下游引物(10 pmol/L)1.5 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.16 μL,模板DNA 1 μL。循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃ 15 s,64℃退火-延伸30 s,30次循環(huán);72℃5 min。總循環(huán)時間為43 min,較三步法節(jié)約38 min。取4 μL產(chǎn)物電泳發(fā)現(xiàn)泳道9擴(kuò)增條帶最亮,因此將64 ℃作為最佳退火-延伸溫度(圖3)。

    2.4特異性試驗(yàn)結(jié)果

    毛細(xì)管電泳儀選擇的DNA標(biāo)準(zhǔn)為0~1 000 bp,只有當(dāng)擴(kuò)增片段吸收峰高于Lower Marker激光頻射(RFU)方可判定為有效擴(kuò)增,且產(chǎn)物量與RFU值呈正相關(guān)。圖4中僅出現(xiàn)與目的片段大小相符的單一吸收峰,說明該引物的特異性非常好。同時對新孢子蟲、弓形蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛巴貝斯

    蟲和牛雙芽巴貝斯蟲陽性DNA進(jìn)行二溫?cái)U(kuò)增,僅有新孢子蟲陽性DNA出現(xiàn)266 bp的擴(kuò)增條帶,可見二溫法的特異性較好(圖5)。

    2.5靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

    二溫法擴(kuò)增稀釋至10-7的陽性質(zhì)粒時未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,即最低檢出量為32.5 fg/μL,有效檢出量是三步法的10-1倍,說明其靈敏性較好(圖6)。

    圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列比對

    M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1~17.退火-延伸溫度為56 ℃~72 ℃

    M.DNA Marker DL 2 000;1-17.The annealing-extension temperatures were 56 ℃-72 ℃

    圖3篩選最佳退火-延伸溫度

    Fig.3Screening optimal annealing-extension temperature

    圖4 Nc2 F/R 引物二溫式PCR產(chǎn)物在266 bp處的特異性條帶

    M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.新孢子蟲陽性;2.弓形蟲陽性;3.牛環(huán)形泰勒蟲陽性;4.牛巴貝斯蟲陽性;5.牛雙芽巴貝斯蟲陽性;6.陰性對照

    M.DNA Marker DL 2 000;1.N.caninumpositive;2.T.gondiipositive;3.T.annulatapositive;4.B.bovispositive;5.B.bigeminapositive;6.Negative control

    圖5特異性試驗(yàn)結(jié)果

    Fig.5Specificity test results

    2.6重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

    二溫式PCR分別重復(fù)擴(kuò)增稀釋度為10-4、10-5、10-6、10-7的陽性質(zhì)粒發(fā)現(xiàn),10-4、10-5和10-6時呈漸暗的擴(kuò)增條帶,10-7無擴(kuò)增條帶,與原結(jié)果一致,說明該方法的重復(fù)性較好(圖7)。

    2.7臨床檢測結(jié)果

    2對引物共同對巴州部分地區(qū)牛全血DNA進(jìn)行檢測,二者同時檢出15份陽性樣品,檢出符合率為83.33%(30/36)(表1)。重復(fù)對差異性樣品進(jìn)行擴(kuò)增,仍未出現(xiàn)共同陽性樣品。兩檢測方法檢出結(jié)果差異不顯著(P>0.05),說明建立的二溫式PCR檢測方法具有較好的擴(kuò)增特性。

    M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1~8.三步法檢測;9~16.二溫法檢測;濃度分別為3.25 ng/μL、325 pg/μL、32.5 pg/μL、3.25 pg/μL、325 fg/μL、32.5 fg/μL、3.25 fg/μL、0.325 fg/μL

    M.DNA Marker DL 2 000;1-8.The three-step detection;9-16.The two-temperature detection,the concentrations were 3.25 ng/μL,325 pg/μL,32.5 pg/μL,3.25 pg/μL,325 fg/μL,32.5 fg/μL,3.25 fg/μL,0.325 fg/μL,respectively

    圖6靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

    Fig.6The results of the sensitivity test

    M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1~12.對10-4(3.25 pg/μL)、10-5(325 fg/μL)、10-6(32.5 fg/μL)、10-7(3.25 fg/μL)稀釋的3次重復(fù)擴(kuò)增

    M.DNA Marker DL 2 000;1-12.The amplification of 10-4(3.25 pg/μL),10-5(325 fg/μL),10-6(32.5 fg/μL),10-7(3.25 fg/μL) with 3 repeats

    圖7重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

    Fig.7The results of the repeatability test

    3討論

    新孢子蟲病作為多種家畜共患的繁殖障礙性寄生蟲病,給畜牧生產(chǎn)造成了巨大的損失。目前還沒有可用于防治的特效疫苗和有效藥物,準(zhǔn)確、快速的檢測方法結(jié)合嚴(yán)格的隔離、淘汰措施對于該病的防控至關(guān)重要[10]。三步法PCR中退火溫度上升至延伸溫度約需4 s,在此程中即可合成長約240 bp~500 bp的片段。因此在擴(kuò)增100 bp~500 bp的片段序列時可直接省去延伸步驟而直接使用二溫式PCR方法,一般將退火-延伸溫度較三步法退火溫度提高5℃~10℃,以保證反應(yīng)的特異性[11]。

    新孢子蟲Nc2和Nc5基因同被認(rèn)為是診斷犬新孢子蟲的特異性基因?!缎骆咦酉x病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)以Nc5基因設(shè)計(jì)引物,為與之相區(qū)別,本試驗(yàn)根據(jù)Nc2基因設(shè)計(jì)引物,成功擴(kuò)增出266 bp片段,與引物所在基因100%相似。經(jīng)靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證,最終建立了新孢子蟲病二溫式PCR檢測方法。該方法最低檢出量為32.5 fg/μL,是三步法PCR的10-1倍,但反應(yīng)時間縮短了38 min。

    同時應(yīng)用不同基因引物進(jìn)行檢測可有效地降低漏檢率。應(yīng)用二溫式PCR方法和《新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3499—2013)共同對156份牛全血DNA進(jìn)行檢測,檢出率分別為10.90%(17/156)和12.18%(19/156),檢出符合率為83.33%(30/36),與閆雙等[12]報(bào)道的新疆地區(qū)牛新孢子蟲陽性率為13.14%(212/1 613)相當(dāng),高于史茜等[13]報(bào)道的新疆某4個規(guī)模化養(yǎng)牛場陽性率為6.49%(10/154),其差異是由于閆雙等試驗(yàn)樣品和本試驗(yàn)采集樣品的范圍廣,更具地方代表性,史茜等結(jié)果更能具體代表當(dāng)?shù)啬撑龅母腥韭省?/p>

    由此可見,本研究建立的新孢子蟲二溫式PCR檢測方法特異、靈敏、快捷,可用于新孢子蟲病的臨床檢測和流行病學(xué)監(jiān)控。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Dubey J P,Carpenter J L,Speer C A,et al.Newly recognized falal protozoan disease of dogs[J].J Am Vet Med Assoc,1988,192(9):1269-1285.

    [2]Dubey J P.Neosporosis in cattle:biology and economic impact[J].J Am Vet Med Assoc,1999,214(6):1160-1163.

    [3]Gondim L F,Mcallister M M,Pitt W C,et al.Coyotes (Canislatrans) are definitive hosts ofNeosporacaninum[J].Int J Parasitol,2004,34(2):159-161.

    [4]Jenkins M,Baszler T,Bjorkman C,et al.Diagnosis and seroepidemiology ofNeosporacaninumassociated bovine abortion[J].Int J Parasitol,2002,32(2):631-636.

    [5]Gerard C,David K,Todd F,et al.Neosporacaninumserostatus and cling of Holstein cattle[J].Javima,2002,221(9):1165-1168.

    [6]劉群,李博,齊長明,等.奶牛新孢子蟲病血清學(xué)檢測初報(bào)[J].中國獸醫(yī)雜志,2003,39(2):8-9.

    [7]Chahan B,Gaturaga I,Huang X H,et al.Serodiagnosis ofNeosporacaninuminfection in cattle by enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant truncated NcSAG1[J].Vet Parasitol,2003,118:177-185.

    [8]王振寶,劉啟生,哈森,等.牛環(huán)形泰勒蟲病二溫式PCR診斷方法的建立及初步應(yīng)用[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,33(5):59-63.

    [9]Nishikawa Y,Tragoolpua K,Makala L,et al.NeosporacaninumNcSRS2 is transmenbrane protein that contains a glycosylphosphatidylinositol anchor insect cells[J].Vet Parasitol,2002,109:191-201.

    [10]閆雙,陳千林,郭慶勇,等.用重組抗原與商品化試劑盒對比檢測牦牛的新孢子蟲與弓形蟲感染[J].中國動物傳染病學(xué)報(bào),2013,21(1):71-74.

    [11]季新成,王文,牛國輝,等.牛新孢子蟲二溫式PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(8):17-20.

    [12]閆雙,陳亮,巴音查汗.牛新孢子蟲病在新疆流行情況調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012(10):98-100.

    [13]史茜,唐慧芬,牛國輝,等.牛新孢子蟲基因芯片檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,36(9):715-719.

    Establishment and Application of Two-temperature PCR for DetectingNeosporacaninum

    CHEN Qian-lin1,WANG Zhen-bao2,SONG Ying-chun3,LIU Meng-li1,XU Zheng-mao1,CHAHAN Ba-yin1

    (1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China;2.SynthesisTechniqueServiceCenterofYiliEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Yining,Xinjiang,835000,China;3.AnimalDiseaseControlandDiagnosisCenterofBayinguolengMongoliaAutonomousPrefecture,Korla,Xinjiang,841000,China)

    Abstract:According to the conserved sequence of Neospora caninum Nc2 gene,the specific primers were designed,the reaction conditions of Taq DNA polymerase,primer concentration and annealing temperature were optimized by using the uniform design method.The results showed that the amplified fragment was same with the expected length(266 bp);It can't amplify the positive DNA fragments of Toxoplasma gondii et.The cloning and sequencing results revealed that the sequence of the amplified fragment had 100% similarity to the target gene,and the minimum detection quantity was 32.5 fg/μL, which is 10(-1) times of three-step PCR method and the circulation time shortens about 38 minutes;There was no amplified band of 10(-7) diluted positive plasmids while 10(-4),10(-5),10(-6) and 10(-7)samples showed positive results after 3 repeats.156 bovine blood samples were detected and the positive rate was 10.90%(17/156) which had 83.33%(30/36) coincidence rate with "Technical specification of Neospora caninums quarantine"(SN/T 3499—2013).This study demonstrated that the two temperature PCR method could be used in clinical diagnosis and daily monitoring of Neospora caninum,and provide the technical support for monitoring reservoir host.

    Key words:Neospora caninum;Nc2 gene;two-temperature PCR

    文章編號:1007-5038(2016)04-0030-05

    中圖分類號:S852.723

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    作者簡介:陳千林(1991-),男,新疆庫爾勒人,碩士研究生,主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*通訊作者

    基金項(xiàng)目:新疆維吾爾自治區(qū)科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)項(xiàng)目(201454129);庫爾勒市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013051108)

    收稿日期:2015-10-07

    午夜视频国产福利| 青春草国产在线视频| 免费少妇av软件| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品日本国产第一区| 免费看av在线观看网站| 一级av片app| 亚洲不卡免费看| 午夜精品国产一区二区电影| 国产在线一区二区三区精| 欧美高清成人免费视频www| 色94色欧美一区二区| 日日啪夜夜撸| 少妇被粗大猛烈的视频| 极品人妻少妇av视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 尾随美女入室| 伦精品一区二区三区| 中文在线观看免费www的网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲国产色片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久影院123| 只有这里有精品99| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 三级国产精品欧美在线观看| 免费观看av网站的网址| 91久久精品电影网| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 街头女战士在线观看网站| 久久热精品热| 午夜av观看不卡| 亚洲怡红院男人天堂| 久久久久精品久久久久真实原创| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 丝袜在线中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 黑人猛操日本美女一级片| 三级经典国产精品| 日本色播在线视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 中文字幕免费在线视频6| 色5月婷婷丁香| av网站免费在线观看视频| 日韩三级伦理在线观看| 日本欧美国产在线视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 在线天堂最新版资源| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜影院在线不卡| 亚洲精品一二三| 亚洲久久久国产精品| 久久久久久久久久成人| 麻豆成人av视频| 国产成人精品福利久久| h日本视频在线播放| 制服丝袜香蕉在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 国产精品一区二区在线不卡| 91精品伊人久久大香线蕉| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲欧美精品自产自拍| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜福利视频精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 少妇人妻 视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产爽快片一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| 少妇丰满av| 中文字幕av电影在线播放| 免费看av在线观看网站| 五月开心婷婷网| 少妇被粗大猛烈的视频| 伦理电影免费视频| 久久综合国产亚洲精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美精品一区二区大全| 国产av一区二区精品久久| 精品酒店卫生间| 我的老师免费观看完整版| 亚洲av欧美aⅴ国产| 新久久久久国产一级毛片| a级一级毛片免费在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国内揄拍国产精品人妻在线| 夫妻午夜视频| 亚洲国产最新在线播放| 青春草国产在线视频| 丝袜喷水一区| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品456在线播放app| 乱人伦中国视频| 黄色配什么色好看| 国产av码专区亚洲av| 免费人妻精品一区二区三区视频| av免费在线看不卡| 亚洲国产精品一区三区| 一本大道久久a久久精品| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲精品一二三| 全区人妻精品视频| 五月伊人婷婷丁香| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 18禁动态无遮挡网站| 亚洲精品色激情综合| 日本午夜av视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久午夜综合久久蜜桃| 多毛熟女@视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 777米奇影视久久| 91久久精品国产一区二区三区| videossex国产| 国产日韩欧美视频二区| 日日啪夜夜爽| 久久久精品免费免费高清| 日韩电影二区| 桃花免费在线播放| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲美女视频黄频| 国产精品三级大全| 在线观看国产h片| 性色avwww在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 熟女人妻精品中文字幕| 色视频www国产| 国产免费又黄又爽又色| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲电影在线观看av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 夫妻性生交免费视频一级片| 永久免费av网站大全| 欧美bdsm另类| 国产男女内射视频| 久久午夜福利片| 妹子高潮喷水视频| 男女无遮挡免费网站观看| 高清黄色对白视频在线免费看 | 97在线人人人人妻| 亚洲成人av在线免费| 美女主播在线视频| 色视频在线一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 乱人伦中国视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产精品国产三级专区第一集| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久午夜福利片| 99热这里只有精品一区| 亚洲,欧美,日韩| a级毛片在线看网站| 日韩av免费高清视频| 黄色怎么调成土黄色| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产91av在线免费观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久99一区二区三区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲综合色惰| 久久6这里有精品| 最近的中文字幕免费完整| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲性久久影院| 在线观看av片永久免费下载| 精品一区二区免费观看| 天堂8中文在线网| 午夜激情福利司机影院| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产成人精品福利久久| 欧美日韩在线观看h| 亚洲伊人久久精品综合| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产色爽女视频免费观看| 成人免费观看视频高清| 精品人妻熟女av久视频| av不卡在线播放| 简卡轻食公司| 青春草国产在线视频| av专区在线播放| 全区人妻精品视频| 久久精品国产自在天天线| 9色porny在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 久久久a久久爽久久v久久| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 色哟哟·www| 日韩亚洲欧美综合| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 黄色一级大片看看| 国产成人精品福利久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成人漫画全彩无遮挡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 免费大片18禁| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久热精品热| 婷婷色综合www| 97超碰精品成人国产| 亚洲欧洲国产日韩| 男人爽女人下面视频在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲内射少妇av| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产熟女欧美一区二区| 精品一区在线观看国产| 97在线人人人人妻| 久久国产乱子免费精品| 曰老女人黄片| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产欧美在线一区| 特大巨黑吊av在线直播| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲va在线va天堂va国产| 免费看不卡的av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久99热6这里只有精品| 人体艺术视频欧美日本| 中国国产av一级| 国产乱人偷精品视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲美女视频黄频| 欧美丝袜亚洲另类| av.在线天堂| 一级毛片久久久久久久久女| 九九爱精品视频在线观看| 国产欧美亚洲国产| 在线观看三级黄色| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲av中文av极速乱| 大片免费播放器 马上看| 亚洲人成网站在线观看播放| 99热网站在线观看| 极品教师在线视频| 久久久亚洲精品成人影院| 99久久综合免费| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久韩国三级中文字幕| 赤兔流量卡办理| 七月丁香在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久午夜欧美精品| 亚洲国产最新在线播放| www.av在线官网国产| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲美女搞黄在线观看| 全区人妻精品视频| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲av二区三区四区| 精品国产乱码久久久久久小说| 精品久久久久久久久av| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 波野结衣二区三区在线| 日韩大片免费观看网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 美女中出高潮动态图| 久久人妻熟女aⅴ| 国产精品人妻久久久影院| 少妇人妻精品综合一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲综合色惰| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲精品一区蜜桃| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品午夜福利在线看| 亚洲av综合色区一区| 伦理电影大哥的女人| 日韩大片免费观看网站| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美+日韩+精品| 97超视频在线观看视频| 精品一区二区三区视频在线| 欧美人与善性xxx| 国产一区二区在线观看av| 在线 av 中文字幕| 高清视频免费观看一区二区| 少妇被粗大猛烈的视频| 日本欧美国产在线视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产成人91sexporn| 51国产日韩欧美| 久久久国产精品麻豆| 黑人高潮一二区| 久久精品久久久久久久性| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产成人91sexporn| 99热全是精品| 五月开心婷婷网| 777米奇影视久久| 另类精品久久| 欧美三级亚洲精品| av一本久久久久| 亚洲图色成人| 黄色日韩在线| 男女边吃奶边做爰视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日本免费在线观看一区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产成人精品久久久久久| 日韩强制内射视频| 亚洲精品456在线播放app| 不卡视频在线观看欧美| 久久久久久久久大av| 一级黄片播放器| 久久女婷五月综合色啪小说| 日日撸夜夜添| 亚洲国产精品成人久久小说| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 最近的中文字幕免费完整| 熟女av电影| 少妇丰满av| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美日本中文国产一区发布| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品一区二区在线不卡| 免费看日本二区| 黑丝袜美女国产一区| 黑人高潮一二区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 秋霞伦理黄片| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产高清国产精品国产三级| 国产高清三级在线| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲av在线观看美女高潮| 日韩中字成人| 三上悠亚av全集在线观看 | 日韩亚洲欧美综合| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久午夜福利片| 女性生殖器流出的白浆| 六月丁香七月| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲国产最新在线播放| 国产有黄有色有爽视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 不卡视频在线观看欧美| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲av二区三区四区| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲av二区三区四区| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲av二区三区四区| 国产免费视频播放在线视频| .国产精品久久| 国产精品久久久久久av不卡| 少妇高潮的动态图| 中文字幕av电影在线播放| 伊人久久精品亚洲午夜| 黄色毛片三级朝国网站 | 一级毛片我不卡| 黄色日韩在线| 国产在视频线精品| 国产成人精品久久久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美区成人在线视频| 美女内射精品一级片tv| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 毛片一级片免费看久久久久| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久青草综合色| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 天堂8中文在线网| 国产精品99久久久久久久久| 日日爽夜夜爽网站| 免费av不卡在线播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 伊人久久精品亚洲午夜| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产黄片美女视频| 好男人视频免费观看在线| 久久久久久久久久久免费av| 精品久久久精品久久久| 大话2 男鬼变身卡| 精品人妻熟女av久视频| 最新的欧美精品一区二区| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩大片免费观看网站| 国产淫语在线视频| 国产亚洲最大av| 久久亚洲国产成人精品v| 人人澡人人妻人| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩精品有码人妻一区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 国模一区二区三区四区视频| 免费人成在线观看视频色| 欧美日韩在线观看h| 欧美日韩av久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 青青草视频在线视频观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲美女视频黄频| 国产亚洲一区二区精品| 欧美xxⅹ黑人| 91精品伊人久久大香线蕉| 99re6热这里在线精品视频| 一级a做视频免费观看| 中文字幕免费在线视频6| 2022亚洲国产成人精品| 在线 av 中文字幕| 亚洲国产日韩一区二区| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品久久久久久久久免| 欧美三级亚洲精品| 午夜福利视频精品| 99国产精品免费福利视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 97在线人人人人妻| 亚洲欧洲国产日韩| 天堂俺去俺来也www色官网| av天堂中文字幕网| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产在线男女| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久久久网色| 国产成人freesex在线| 国产男人的电影天堂91| 美女视频免费永久观看网站| 男的添女的下面高潮视频| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲久久久国产精品| 亚洲内射少妇av| av在线app专区| 少妇丰满av| 少妇熟女欧美另类| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 9色porny在线观看| 国产色婷婷99| 精品久久久久久电影网| 99热这里只有是精品在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日本爱情动作片www.在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品人妻久久久影院| 赤兔流量卡办理| 精品少妇久久久久久888优播| 五月开心婷婷网| 高清欧美精品videossex| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 日韩亚洲欧美综合| 久久99蜜桃精品久久| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲自偷自拍三级| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品久久久久久av不卡| 国产成人精品无人区| 国产视频内射| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 99热这里只有是精品50| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 丰满少妇做爰视频| av网站免费在线观看视频| 日本黄色片子视频| 美女国产视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产av国产精品国产| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲国产色片| 精华霜和精华液先用哪个| 在线观看人妻少妇| 成人特级av手机在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 一本大道久久a久久精品| 午夜日本视频在线| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 日韩欧美精品免费久久| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲av不卡在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲无线观看免费| 性色avwww在线观看| 男女边摸边吃奶| 国产精品蜜桃在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 最新的欧美精品一区二区| 99热这里只有精品一区| 一边亲一边摸免费视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 婷婷色综合www| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲图色成人| av一本久久久久| 成人免费观看视频高清| 精品人妻熟女av久视频| 最新中文字幕久久久久| 在线观看免费视频网站a站| 久久青草综合色| 国产成人精品久久久久久| 性色av一级| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品少妇内射三级| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 大码成人一级视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 免费观看的影片在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产日韩欧美亚洲二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 制服丝袜香蕉在线| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 性色avwww在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久精品国产a三级三级三级| 丰满乱子伦码专区| 久久国产精品大桥未久av | 国产精品一区二区性色av| 曰老女人黄片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 成年人午夜在线观看视频| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲精品第二区| 一区在线观看完整版| 久久精品国产a三级三级三级| 激情五月婷婷亚洲| av天堂中文字幕网| 麻豆乱淫一区二区| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产精品人妻久久久久久| 99九九在线精品视频 | 18禁动态无遮挡网站| 亚洲av福利一区| 亚洲性久久影院| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 九九爱精品视频在线观看| 多毛熟女@视频| 看十八女毛片水多多多| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲av成人精品一二三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 成年av动漫网址| 国国产精品蜜臀av免费| 大香蕉久久网| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲美女视频黄频| 日韩成人伦理影院| 性色avwww在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| av在线app专区| 天堂8中文在线网| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 又大又黄又爽视频免费| av专区在线播放| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品一区蜜桃| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 三级国产精品欧美在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产白丝娇喘喷水9色精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 精品久久久久久电影网| 91精品一卡2卡3卡4卡| 最近手机中文字幕大全| 国产一区二区三区av在线| 男人添女人高潮全过程视频| 国产精品久久久久久av不卡| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲第一av免费看| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲av中文av极速乱| 丁香六月天网|