基于宏基因組學(xué)的鴨源樣本中坦布蘇病毒檢測(cè)方法的建立

孫　濤,王　超,鄧明俊,鄭小龍,王　群,徐　彪*

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002；2.泰安出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東泰安 250014)

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基于宏基因組學(xué)的鴨源樣本中坦布蘇病毒檢測(cè)方法的建立

孫濤1,王超2,鄧明俊1,鄭小龍1,王群1,徐彪1*

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002；2.泰安出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東泰安 250014)

摘要：利用二代高通量測(cè)序技術(shù)建立檢測(cè)鴨源樣品中坦布蘇病毒的方法。首先將樣品過(guò)濾和經(jīng)核酸酶處理，再利用等溫鏈位移擴(kuò)增(SPIA)技術(shù)快速制備樣品總cDNA，最后經(jīng)磁珠純化和文庫(kù)構(gòu)建后，通過(guò)Ion Torrent進(jìn)行高通量測(cè)序獲得基因組信息。結(jié)果顯示,通過(guò)SPIA擴(kuò)增和核酸文庫(kù)制備的優(yōu)化，可從微量病原樣本中獲得327 pmol/μL的核酸文庫(kù)樣本。Ion Torrent測(cè)序共獲得1 725 436條reads，約6.2 M數(shù)據(jù)，平均109 bp。數(shù)據(jù)拼接并Blast發(fā)現(xiàn),病原樣品的核酸序列可注釋鴨坦布蘇病毒全部基因組數(shù)據(jù)，與首次發(fā)生在我國(guó)的鴨坦布蘇病毒BYD-1株參考序列的同源性為100%。將所測(cè)病毒序列與其他5種黃病毒科成員進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與近3年發(fā)生在我國(guó)的鴨坦布蘇病毒同源性最高，在98%以上。且NS基因進(jìn)化樹(shù)分析與鴨坦布蘇病毒處于同一分支上，符合鴨坦布蘇病毒特征。本研究建立的基于未知病原SPIA擴(kuò)增結(jié)合高通量測(cè)序檢測(cè)方法，可同步獲知坦布蘇病毒基因的核酸信息。

關(guān)鍵詞：宏基因組學(xué)；鴨坦布蘇病毒；二代測(cè)序

新發(fā)病毒性流行病已經(jīng)日益成為畜牧養(yǎng)殖行業(yè)的公共問(wèn)題。受制于常規(guī)檢測(cè)技術(shù)的局限性，傳統(tǒng)的、基于PCR的分子生物學(xué)鑒定方法必須基于已知病毒的基因序列，病原信息常常得不到快速揭示，從而造成了疫情的蔓延和經(jīng)濟(jì)損失。及早發(fā)現(xiàn)、鑒別未知或新發(fā)病原是疾病防控的關(guān)鍵，同時(shí)對(duì)疾病的臨床治療也具有重要的指導(dǎo)意義。2010年，曹貞貞等[1]最先發(fā)現(xiàn)一種導(dǎo)致蛋鴨產(chǎn)蛋大幅下降，后期伴有神經(jīng)癥狀的新型病毒病。因該病剖檢癥狀主要呈現(xiàn)卵泡變性、變形，卵泡膜充血、出血，因此首先命名為鴨出血性卵巢炎(Duck hemorrhagic ovaritis，DHO)。后期隨著該病的基因組信息被逐漸揭示[2-9]，發(fā)現(xiàn)其病原和坦布蘇病毒親緣關(guān)系最近，才正式將該病病原名稱(chēng)統(tǒng)一為“鴨坦布蘇病毒”(Duck Tembusu virus，DTMUV)。

病毒宏基因組學(xué)是研究特定環(huán)境及復(fù)雜樣品的技術(shù)方法[10]，針對(duì)鴨坦布蘇病毒這類(lèi)未知或新發(fā)病原，可消除傳統(tǒng)分子生物學(xué)鑒定的局限，快速獲得未知樣品的基因組信息。本研究即利用病毒宏基因組學(xué)理念結(jié)合二代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行未知鴨源樣品中坦布蘇病毒的檢測(cè)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1送檢樣品病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)樣品為青島某公司送檢，病毒分離未能確定病原，用常規(guī)PCR診斷方法亦未能確定。鴨胚成纖維細(xì)胞、BKH細(xì)胞，山東出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.1.2分子生物學(xué)試劑DNase Ⅰ、RNase A，天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Agencourt○RAMPure○RXP Reagent，Thermo公司產(chǎn)品；Dneasy Kit,Rneasy Mini Kit，QIAGen公司產(chǎn)品；Ovation RNA-Seq System V2基因組擴(kuò)增盒，Nugen公司產(chǎn)品；Ion ShearTMPlus Reagent Kit、Ion X pressTM Barcode X 、Platimun○RPCR SuperMix、Library Amplification Primer Mix、Ion LibraryTaqMan○RqPCR Mix試劑盒，Life Technologies公司產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器Step One Plus熒光PCR儀，購(gòu)自ABI公司；Ion Chef System 核酸前處理儀，Ion Torrent 測(cè)序儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2方法

1.2.1未知樣品的處理將細(xì)胞培養(yǎng)樣品冰浴融化，組織樣品研磨后離心，12 000 r/min離心5 min，取上清用0.22 μm濾膜過(guò)濾，此過(guò)程在超凈工作臺(tái)中完成。然后取濾液加入DNase Ⅰ、RNase A各1.5 μL、10×DNase Ⅰbuffer 40 μL，于37℃水浴3 h，以降解樣品中宿主游離核酸，然后置75℃水浴10 min，滅活DNase Ⅰ。

1.2.2DNA和RNA的提取處理后的樣品均分為2份，200 μL樣品用QIAGen DNA提取試劑盒提取DNA，另外200 μL按Rneasy Mini Kit提取試劑盒操作步驟提取RNA。

1.2.3RNA樣品的反轉(zhuǎn)錄等溫鏈位移擴(kuò)增每份病毒RNA樣品溶解于5 μL的RNase水，參照Nugen公司Ovation RNA-Seq System V2基因組擴(kuò)增試劑盒的使用說(shuō)明。第1步：進(jìn)行第1鏈合成，向反應(yīng)體系中加入第1鏈合成酶0.5 μL，第1鏈合成緩沖液2.5 μL，65℃ 2 min,進(jìn)行引物退火；隨后進(jìn)行第1鏈合成，反應(yīng)條件為:4℃ 1 min;25℃ 10 min,42℃ 10 min, 70℃ 15 min，4℃保溫。第2步：利用Agencourt RNA Clean XP purification 磁珠純化后，進(jìn)行第2鏈合成，反應(yīng)體系中加入第2鏈合成酶0.3 μL ，第2鏈合成緩沖液9.7 μL，反應(yīng)條件為：4℃ 1 min;25℃ 10 min,50℃ 30 min,80℃ 20 min,4℃保溫。第3步：進(jìn)行等溫鏈位移擴(kuò)增。向反應(yīng)體系中加入等溫鏈位移擴(kuò)增引物10 μL，等溫鏈位移擴(kuò)增緩沖液20 μL，SPIA擴(kuò)增酶10 μL，反應(yīng)條件為: 4℃ 1 min,47℃ 60 min,80℃ 20 min, 4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.4核酸文庫(kù)的制備上述樣本全部擴(kuò)增完畢后，用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。分別取100 ng 純化產(chǎn)物，用Ion ShearTMPlus Reagent Kit進(jìn)行酶切打斷5 min，酶切產(chǎn)物加入1.8倍體積AMPure○RXP Beads純化，然后分別加入不同的 Ion X pressTMBarcode接頭，E-Gel膠選擇片段(約400 bp)構(gòu)建文庫(kù)。用Platimun○RPCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，Ion LibraryTaqMan○RqPCR Mix鑒定文庫(kù)質(zhì)量。

1.2.5Ion Torrent 測(cè)序取20 μL的工作文庫(kù)上機(jī)Ion Chef System進(jìn)行油包水PCR和堿裂解法制備單鏈模板，最后將帶有模板的微粒溶液自動(dòng)點(diǎn)樣至314芯片中，上機(jī)Ion torrent PGM進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.6生物信息學(xué)分析上機(jī)測(cè)序后經(jīng)PGM測(cè)序儀自動(dòng)運(yùn)行得到的測(cè)序結(jié)果，解析為Bam的原始文件通過(guò)pathogen analyze軟件進(jìn)行拼接分析。同時(shí)選取GenBank中下載的坦布蘇病毒全基因序列作為參考序列，將測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)Blast比對(duì)到參考序列中，通過(guò)覆蓋參考序列的序列數(shù)量、比例以及參考序列被覆蓋的長(zhǎng)度判斷樣品中是否有對(duì)應(yīng)的病毒。

1.2.7系統(tǒng)進(jìn)化分析與遺傳距離計(jì)算將測(cè)得序列(暫定為QD株)，通過(guò)DNA Star軟件的MegAlign模塊，對(duì)病毒全基因組與GenBank中已發(fā)表的坦布蘇病毒以及其他黃病毒科成員進(jìn)行同源性比對(duì)，并針對(duì)注釋的病毒NS5基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，計(jì)算遺傳距離。從GenBank下載參考序列的毒株(表1)，從GenBank下載NS5基因參考序列(表2)。

表1　從GenBank下載的參考序列毒株及其縮寫(xiě)

表2　從GenBank下載的NS5基因參考序列毒株及其縮寫(xiě)

2結(jié)果

2.1核酸文庫(kù)的鑒定

分別取5 μL 100倍稀釋后的擴(kuò)增樣本，使用Ion LibraryTaqMan○RqPCR Mix熒光定量法進(jìn)行濃度測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋成6.8 pmol/L 0.068 pmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)梯度做2個(gè)平行，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，根據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)與Ct值的相關(guān)性，由SDS軟件2.1得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=-3.305x+17.322，R2=0.995(圖1)。目標(biāo)檢測(cè)文庫(kù)檢測(cè)濃度約為327 pmol/L。

1.6.8 pmol/L標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(xiàn)；2.0.68 pmol/L標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(xiàn) ；3.0.068 pmol/L標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(xiàn)； TB.目標(biāo)檢測(cè)文庫(kù)擴(kuò)增曲線(xiàn)

1.Amplification curve of 6.8 pmol/L standard ；2.Amplification curve of 0.68 pmol/L standard；3.Amplification curve of 0.068 pmol/L standard；TB.Amplification curve of target liabrary

圖1目標(biāo)文庫(kù)及不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)

Fig.1Amplification plots of target library and different dilutions of reference standards

2.2Ion Torrent測(cè)序

測(cè)得6.2 M數(shù)據(jù)，約3 163 352 reads，匹配reads數(shù)為1 725 436(圖2)。所測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)軟件自動(dòng)拼接，同時(shí)在NCBI上進(jìn)行Blast搜索，顯示有48段序列涵蓋坦布蘇病毒全部全基因組序列，與首次發(fā)生在我國(guó)的鴨坦布蘇病毒BYD-1株參考序列[4]的同源性為100%(GenBank 登錄號(hào)為JF312912)(圖3)。

2.3生物信息學(xué)分析

將本試驗(yàn)測(cè)得的坦布蘇病毒QD株全基因序列與其他22株黃病毒科病毒進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該株病毒與黃病毒科中的黃熱病毒(Yellow fever virus)、登革熱病毒(Dengue virus)、伊利烏斯腦炎病毒(Ilheus virus)、西尼羅病毒(West Nile virus)、巴格扎病毒(Bagaza virus)、坦布蘇病毒(Tembusu virus)具有親緣關(guān)系，其中與近3年發(fā)生在我國(guó)的鴨坦布蘇病毒同源性最高，達(dá)98%以上，與黃熱病毒親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4)。

國(guó)際上，通常以黃病毒NS5基因3′端長(zhǎng)約1 kb的區(qū)域同源性作為黃病毒屬的病毒分類(lèi)依據(jù)[11]。據(jù)此，我們將本試驗(yàn)測(cè)得的NS5基因與其他黃病毒病毒采用DNA Star進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與坦布蘇病毒處于同一分支上(圖5)。

圖2　Ion Torrent 測(cè)序儀讀取序列數(shù)

圖3　序列搜索比對(duì)結(jié)果

圖4　QD株與其他GenBank已公布序列的核苷酸同源性比較

3討論

所謂病毒宏基因組學(xué)就是通過(guò)各種手段將某一復(fù)雜樣本中所有病毒同其他宿主及微生物區(qū)分開(kāi)來(lái)，然后將病毒組的核酸文庫(kù)同現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而獲得樣本中整體病毒組的構(gòu)成[10]。這種研究手段避開(kāi)了傳統(tǒng)的依據(jù)已知核酸序列的研究方法，而直接獲取病毒群落的信息，從而獲得了復(fù)雜樣本中更為豐富的病毒組構(gòu)成，為預(yù)防新疾病出現(xiàn)和已知病毒的變異提供了重要的警示作用。Ge X等[12]與楊凡力等[13]就曾在研究中國(guó)蝙蝠帶毒的自然本底時(shí)，應(yīng)用宏基因組學(xué)分析技術(shù)注釋到了36個(gè)病毒科，建立了野生動(dòng)物源人獸共患病的監(jiān)測(cè)方法。韓文等[14]利用宏基因組學(xué)理念，通過(guò)大規(guī)模測(cè)序及序列分析獲取了豬群樣本中未知的6種病毒基因序列。Minakshi P[15]則從印度山羊體內(nèi)鑒定到了16種血清型的藍(lán)舌病毒。本研究通過(guò)建立一套基于病毒宏基因組學(xué)的未知病毒鑒定技術(shù)平臺(tái)，快速發(fā)掘了鴨源樣本中疑似坦布蘇病毒的方法，可便于及時(shí)診斷和快速響應(yīng)。

圖5　NS5基因核苷酸序列比對(duì)圖

在本研究中我們針對(duì)提取的RNA樣本首次采用等溫鏈位移擴(kuò)增技術(shù)，高效擴(kuò)增了RNA類(lèi)病毒樣本的核酸序列，并成功構(gòu)建高質(zhì)量的核酸文庫(kù)。SPIA是一個(gè)強(qiáng)健的等溫鏈位移擴(kuò)增過(guò)程。它用一個(gè)DNA/RNA嵌合SPIA引物，DNA引物和RNA酶抑制劑在一個(gè)同質(zhì)的等溫實(shí)驗(yàn)中可提供效率很高的DNA序列擴(kuò)增過(guò)程。RNA酶抑制劑在DNA/RNA異源雙鏈的第一鏈5′端可降解RNA。DNA酶啟動(dòng)3′端的引物復(fù)制，置換了既有的上游鏈。新合成的鏈5′端RNA部分可再次被RNA酶抑制劑去除。遺棄的獨(dú)特引物位點(diǎn)可提供新一輪的cDNA合成。整個(gè)SPIA過(guò)程由引物結(jié)合，DNA復(fù)制，第一鏈置換和RNA切割地等過(guò)程重復(fù)，可快速積累SPIA cDNA。

劉勝旺等[8]曾對(duì)分離自山東鴨場(chǎng)的病毒Du/CH/LSD/1101282株進(jìn)行全基因組測(cè)序，確證了病毒的基因信息屬坦布蘇病毒，且與巴格扎病毒親緣關(guān)系較近，遺傳距離介于病毒種的水平上。但全基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)較為繁瑣，且需多達(dá)10對(duì)引物的設(shè)計(jì)才最終對(duì)病毒進(jìn)行了確證。在本試驗(yàn)中，我們采用二代高通量測(cè)序，將樣品核酸進(jìn)行短片段文庫(kù)制備，避免了常規(guī)試驗(yàn)中的細(xì)菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)以及單克隆的挑選，短時(shí)間即可獲得大量數(shù)據(jù)，可快速注釋病原體的全部遺傳信息。在本試驗(yàn)中，我們將本次測(cè)得的數(shù)據(jù)與其他黃病毒科成員進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)全基因組的核苷酸同源性比對(duì)與近3年我國(guó)發(fā)生在鴨群中的坦布蘇病毒在98%以上。選取其中的NS5基因進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與坦布蘇病毒處于同一分支上，證實(shí)該株病毒符合鴨坦布蘇病毒特征，屬黃病毒科、黃病毒屬，蚊媒恩塔亞病毒群。

參考文獻(xiàn):

[1]曹貞貞，張存，黃瑜，等.鴨出血性卵巢炎的初步研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2010,46(12):3-6.

[2]Han K,Huang X,Li Y,et al.Complete genome sequence of goose Tembusu virus,isolated from jiangnan white geese in Jiangsu,China[J].Genome Announc,2013,1(2):e0023612.

[3]Huang X,Han K,Zhao D,et al.Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from geese in China[J].Res Vet Sci,2013,94(3):774-780.

[4]Su J,Li S,Hu X,et al.Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus,a new Tembusu-related flavivirus[J].PLoS One,2011,6(3):e18106.

[5]Yun T,Ye W,Ni Z,et al.Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from Pekin ducklings in China[J].Vet Microbiol,2012,157(3-4):311-319.

[6]Zhu W,Chen J,Wei C,et al.Complete genome sequence of duck Tembusu virus, isolated from Muscovy ducks in southern China[J].J Virol,2012,86(23):131319.

[7]李玉峰.一種從鴨新分離的黃病毒研究初報(bào)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,42(6):885-891.

[8]劉勝旺，張玥，劉曉麗，等.一株鴨坦布蘇病毒的分離鑒定及全基因組序列分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,44(3):72-78.

[9]馬秀麗，于可響，高鳳，等.鴨黃病毒BZ株的生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)家禽,2011,33(21):12-14.

[10]Edwards R A,Rohwer F.Viral metagenomics[J].Nat Rev Microbiol,2005,3(6):504-510.

[11]Kuno G.Universal diagnostic RT-PCR protocol for arboviruses[J].J Virol Methods,1998,72(1):27-41.

[12]Ge X,Li Y,Yang X,et al.Metagenomic analysis of viruses from bat fecal samples reveals many novel viruses in insectivorous bats in China[J].J Virol,2012,86(8):4620-4630.

[13]楊凡力，王意銀，鄭文成，等.中國(guó)部分地區(qū)蝙蝠攜帶病毒的宏基因組學(xué)分析[J].生物工程學(xué)報(bào),2013,29(5):586-600.

[14]韓文，羅玉子，趙碧波，等.基于宏基因組學(xué)的豬群樣本病毒探測(cè)方法的建立[J].微生物學(xué)報(bào),2013,53(2):197-203.

[15]Minakshi P,Singh R,Ranjan K,et al.Complete genome sequence of bluetongue virus serotype 16 of goat origin from India[J].J Virol,2012,86(15):8337-8338.

Establishment of Detecting Tembusu Virus Method from Duck Source Samples Based on Metagenomics

SUN Tao1,WANG Chao2, DENG Ming-jun1,ZHENG Xiao-long1, WANG Qun1, XU Biao1

(1.ShandongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau，Qingdao，Shandong，266002,China;2.TaianEntry-exitInspectionandQuarantineBureau，Taian，Shandong，250014，China)

Abstract:To explore the methods of high-throughput sequencing for Tembusu virus from duck source samples based on metagenomics,first of all,interference was removed through filtering and nucleic acid enzyme treatment.Then,total cDNA was prepared by using isothermal strand-displacement amplification (SPIA) technology.The purification was made by using magnetic beads and the nucleotid library building, the cDNA amplicons were sequenced by Ion Torrent,and the genome information was acquired.The results showed that 327 pmol/μL nucleic acid library was prepared from pathogenic samples through SPIA and optimizing preparation of DNA library.1 725 436 reads,about 6.2 M data,were got by Ion Torrent sequencing,and average read was 109 bp.The nucleic acid sequence of pathogen samples can note entire genome data by Blast on NCBI with the pathogen analysis software,and the similarity was 100% compared to the BYD-1 strain reference sequence occurred first time in our country.In this study,the genome of QD strain has high similarity to duck Tembusu virus occurred during nearly three years compared with the other five flaviviruses,and the genetic relationship was up to 98%.Evolutionary tree of NS5 gene analysis showed that this detected strain and duck Tembusu virus were at the same branch,conforming to the Tembusu virus's characteristics.The SPIA amplification combined with high-throughput sequencing method based on the unknown pathogens,genomic information can be synchronized to learn effectively.

Key words:metagenomics;Duck Tembusu virus;next generation sequencing

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0024-06

中圖分類(lèi)號(hào):S852.659.6;S852.657

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：孫濤(1981-)，男，山東萊蕪人，碩士，主要從事動(dòng)物病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(2013IK038)

收稿日期：2015-09-24