2013年云南省H9N2亞型禽流感病毒兩個(gè)進(jìn)化分支毒株抗原性變異分析

石鳳海，胡媛媛，張文東，孔　強(qiáng)，張應(yīng)國(guó), 范泉水,趙煥云*，張富強(qiáng)*

(1.臨滄市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南臨滄 677000;2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650031;3.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南昆明 650201;4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南昆明 650223;5.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心,云南昆明 650032 )

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2013年云南省H9N2亞型禽流感病毒兩個(gè)進(jìn)化分支毒株抗原性變異分析

石鳳海1△，胡媛媛2△，張文東3，孔強(qiáng)4，張應(yīng)國(guó)3, 范泉水5,趙煥云3*，張富強(qiáng)5*

(1.臨滄市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南臨滄 677000;2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650031;3.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南昆明 650201;4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南昆明 650223;5.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心,云南昆明 650032 )

摘要：為明確2013年云南省H9N2亞型禽流感病毒Ⅲ-1和Ⅲ-2小分支間是否存在抗原性差異,以及這種抗原性差異是否與氨基酸位點(diǎn)變異有關(guān)，從2個(gè)小分支中選取7個(gè)毒株與疫苗株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和血清學(xué)交叉比對(duì)試驗(yàn)。結(jié)果表明，2個(gè)小分支HA基因核苷酸序列同源性為86.6%～98.4%，與2000年前疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，Ⅲ-1分支與2000年后疫苗株(ACKLGQ113和ACKDL2010)親緣關(guān)系較近。血清學(xué)交叉比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Ⅲ-1和Ⅲ-2小分支間抗原性存在差別。氨基酸比對(duì)結(jié)果表明，不同進(jìn)化亞分支毒株與疫苗株相比氨基酸存在變異；與已報(bào)道的抗原表位關(guān)鍵性位點(diǎn)相比，Ⅲ-1分支中部分毒株抗原表位關(guān)鍵性位點(diǎn)存在變異，Ⅲ-2分支毒株無(wú)變異，但在其他8個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在特有變異，是否存在未知抗原表位關(guān)鍵性位點(diǎn)，以及其他氨基酸位點(diǎn)變異是否會(huì)輔助性影響抗原變異，還有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒；H9N2亞型；進(jìn)化分支；抗原性變異分析

H9N2亞型禽流感病毒為低致病性禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)，主要引起以家禽呼吸困難、腹瀉、產(chǎn)蛋下降等癥狀為主的疾病，當(dāng)繼發(fā)細(xì)菌感染時(shí)可引起較高的病死率[1-2]。我國(guó)自1994年首次從雞群中分離到H9亞型禽流感病毒以來(lái)[3]，絕大部分省市均有H9N2亞型禽流感病毒的流行，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。1998年后又先后從豬和人體內(nèi)分離到H9N2 亞型禽流感病毒[4]。隨著H9N2亞型禽流感病毒疫苗的廣泛使用，H9N2亞型禽流感在我國(guó)的流行已迅速得到控制，但局部地區(qū)仍有流行，甚至在已免疫的雞群中長(zhǎng)期持續(xù)存在，以溫和性和隱性感染為主。有研究證實(shí)，頻繁的疫苗免疫接種可導(dǎo)致H9N2亞型AIV HA抗原漂移，引起疫苗免疫失敗[5-8]。

已有研究表明[9]，2013年云南H9N2亞型禽流感病毒株HA基因?qū)儆跉W亞分支的類A/Chicken/BeiJing/1/1994亞分支，且又進(jìn)一步劃分為Ⅲ-1和Ⅲ-2兩個(gè)小分支，Ⅲ-1分支為云南省2008年和2009年H9N2亞型病毒株的延續(xù)，Ⅲ-2分支為云南省新出現(xiàn)的進(jìn)化分支；與云南省現(xiàn)用疫苗株相比，HA推導(dǎo)氨基酸序列中存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異；Ⅲ-1與Ⅲ-2分支存在具有一定進(jìn)化(亞)分支特異性變異；部分抗原表位關(guān)鍵性氨基酸存在變異。

為進(jìn)一步了解Ⅲ-1和Ⅲ-2分支間是否存在抗原性差異、具有一定進(jìn)化(亞)分支特性的氨基酸位點(diǎn)變異、抗原表位關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)變異是否會(huì)影響禽流感病毒的抗原性，以及云南省現(xiàn)用疫苗株對(duì)目前流行毒株是否具有良好的保護(hù)性，本研究選取2013年云南省H9N2 AIV Ⅲ-1和Ⅲ-2分支中的7個(gè)毒株與現(xiàn)用疫苗株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，同時(shí)將7個(gè)毒株與某養(yǎng)殖場(chǎng)健康雞群血清進(jìn)行血清學(xué)交叉試驗(yàn)，分析抗原性變異情況，以便為云南省禽流感防控及制苗種毒更新提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株7株H9N2亞型禽流感病毒株(表1)，均為2013年云南省禽流感病毒監(jiān)測(cè)陽(yáng)性毒株，其中ACKPE621113、ACKZT221113、ADKKM681113屬于Ⅲ-1分支，ACKKM300113、ACKDL100513、ACKDp20113、ACKBN380113屬于Ⅲ-2分支[9]。

1.1.2抗原和血清H9N2亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清,購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。14份血清隨機(jī)采自云南省某養(yǎng)殖場(chǎng)健康雞群。

表1　2013年云南省H9N2亞型禽流感病毒

1.2方法

1.2.1抗原制備將7株毒株分別接種到9 d SPF雞胚中，獲取尿囊液，甲醛滅活后作為抗原備用。

1.2.2血清學(xué)交叉試驗(yàn)與抗原性分析1組～8組分別為H9N2標(biāo)準(zhǔn)抗原、ACKPE621113、ACKZT221113、ADKKM681113、ACKKM300113、ACKDL100513、ACKDp20113、ACKBN380113病毒株抗原，1組～8組抗原分別與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和隨機(jī)采集的云南省某養(yǎng)殖場(chǎng)的14份血清進(jìn)行血清學(xué)交叉試驗(yàn)，血清學(xué)交叉試驗(yàn)參照GB/T 18936—2003標(biāo)準(zhǔn)操作。采用JMTJFX簡(jiǎn)明統(tǒng)計(jì)分析10.34對(duì)不同組血清學(xué)交叉試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA6軟件對(duì)7株毒株與疫苗株的HA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，用軟件中的Construct/Test Maximum Likelihood Tree功能構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，參考毒株見(jiàn)表2。

1.2.4氨基酸位點(diǎn)變異分析采用DNAMan軟件對(duì)2個(gè)進(jìn)化小分支毒株與疫苗株進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)比對(duì)，分析各小分支氨基酸位點(diǎn)的一致性及特異性變異、抗原關(guān)鍵性位點(diǎn)氨基酸的變異情況。

表2　序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析中引用的H9N2亞型AIV參考毒株

2結(jié)果

2.1同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

7株H9N2亞型禽流感病毒株及疫苗株的HA基因序列與歐亞分支中的類A/Chicken/BeiJing/I/1994(分支Ⅲ)分支代表毒株ACKBJ194和ADKHKY28097親緣關(guān)系比較近，同源性為90.4%～96.8%，與歐亞分支中的其他2個(gè)分支(類A/Quail/Hong Kong/G1/97(分支Ⅱ)、類A/Duck/Hong Kong/Y439/97(分支Ⅰ))代表毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性分別為85.8%～92.6%、81.0%～84.8%；7株H9N2亞型病毒株HA基因序列同源性為86.6～99.3%，與ACKGDSS94、ACKSD696、ACKSHF98疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性分別為90.1%～90.8%、89.4%～90.2%、89.1%～90.0%；ACKPE621113、ACKZT221113、ADKKM681113毒株與ACKLGQ113和ACKDL2010疫苗株親緣關(guān)系較近，同源性分別為96.1%～96.4%、94.7%～95.5%，ACKKM300113、ACKDL100513、ACKDp20113、ACKBN380113毒株與ACKLGQ113和ACKDL2010疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同源性分別為86.6%～87.3%、87.4%～88.2%。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，2013年云南H9N2亞型病毒株與疫苗株同屬于歐亞譜系中的類A/Chiken/BeiJjing/I/1994分支(分支Ⅲ)，其中ACKPE621113、ACKZT221113、ADKKM681113毒株與ACKLGQ113和ACKDL2010疫苗株同屬Ⅲ-1分支，ACKKM300113、ACKDL100513、ACKDp20113、ACKBN380113屬于Ⅲ-2分支(圖1)。

圖1　2013年云南省H9N2亞型禽流感病毒HA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2血清學(xué)交叉試驗(yàn)與抗原性分析

結(jié)果見(jiàn)表3和表4。前4組的血凝抑制效價(jià)低于后4組。按照P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著的判定標(biāo)準(zhǔn)，第1～4組、第5～8組間抗原性差異不顯著；第1、2組與第5～6組、第4組與第8組間抗原性差異顯著；第3組與第5～8組、第4組與第5～7組間抗原性差異極顯著。

2.3氨基酸位點(diǎn)變異分析

氨基酸序列分析結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

表3　血清學(xué)交叉試驗(yàn)結(jié)果

表4　生物統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

表5結(jié)果顯示，2013年云南7份H9N2亞型病毒株HA氨基酸序列與ACKGDSS94、ACKSD696、ACKSHF983疫苗株存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，其中HA在G90(E)、G92(R)、S183(N)、T213(A)、V224(L)、Q234(L)、N282(K)、V318(I)、M469(V)、K501(Q)位點(diǎn)存在一致變異，云南省Ⅲ-1分支毒株和ACKLGQ113、ACKDL2010疫苗株與ACKSD696疫苗株相比在N63(S)、M107(L)、R180(Q)、G181(E)、D216(E)、V253(I)、S283(R)、N285(S)、V287(T)、V320(I)、A334(S)、R505(K)位點(diǎn)存在一致變異，云南?、?1分支毒株和ACKLGQ113與ACKSD696疫苗株相比在S127(R)、A198(V)、Q235(M) 位點(diǎn)存在一致變異， ADKKM681113、ACKPE621113毒株與疫苗株ACKLGQ113、ACKDL2010和ACKSD696相比在L89(W)、Q130(R)、Q164(K)、T204(A)、G270(R)、A451(S) 位點(diǎn)存在一致變異，Ⅲ-2與ACKSD696疫苗株和Ⅲ-1分支相比對(duì)在H66(R)、L78(I)、L88(P)、T138(S)、S269(L)、N420(D)、E477(D)、D484(N) 位點(diǎn)存在一致變異(表5)。Ⅲ-1分支ADKKM681113 、ACKPE621113毒株在S143(T)、D153(G)、N201(D)抗原關(guān)鍵性位點(diǎn)存在變異，Ⅲ-2分支毒株在已報(bào)道的抗原關(guān)鍵性位點(diǎn)未發(fā)生變異[10](表6)。

表6　2013年云南省禽流感H9N2亞型病毒抗原

3討論

劉紅旗等[5]連續(xù)3年對(duì)某雞場(chǎng)AIV感染雞群進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)1998年的疫苗株對(duì)2000年毒株的保護(hù)力不及對(duì)1999年毒株的保護(hù)力。Suarez D L等[8]提出禽流感病毒的變異會(huì)引起疫苗免疫的失敗。本試驗(yàn)同源性分析結(jié)果表明，2013年云南省禽流感H9N2亞型毒株HA基因序列與2000年以前疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，云南?、?1毒株與2000年以后疫苗株(ACKLGQ113、ACKDL2010)親緣關(guān)系較近，同屬于Ⅲ-1分支，云南省新出現(xiàn)Ⅲ-2分支與5個(gè)疫苗株均不在同一分支，提示云南省H9N2亞型禽流感病毒已發(fā)生變異，需要密切關(guān)注當(dāng)前疫苗的免疫保護(hù)情況。 HI交叉試驗(yàn)生物統(tǒng)計(jì)分析表明，2013年云南?、?1分支毒株與Ⅲ-2分支毒株間存在顯著或極顯著差異，表明Ⅲ-1與Ⅲ-2分支間存在抗原性差異。

針對(duì)2013年云南省H9N2亞型禽流感毒株和疫苗株HA氨基酸位點(diǎn)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，2013年云南省H9N2亞型禽流感毒株與2000年以前疫苗株相比，有10個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生氨基酸替代，Ⅲ-1 分支毒株與2000年后疫苗株有多個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在一致性氨基酸替代，但部分毒株( ADKKM681113 、 ACKPE621113 )有6個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在特有的氨基酸替代，Ⅲ-2分支毒株與Ⅲ-1分支和疫苗株相比對(duì)，有8個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在特有的氨基酸替代，這種替代具有一定的進(jìn)化(亞)分支特異性。2013年云南省毒株與已報(bào)道的HA蛋白抗原表位關(guān)鍵性氨基酸位點(diǎn)相比較，Ⅲ-1分支中部分毒株(ADKKM681113 、ACKPE621113)抗原關(guān)鍵性位點(diǎn)存在變異；Ⅲ-2分支毒株與疫苗株一致，但在其他8個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在特有的氨基酸替代。提示是否存在未知抗原表位關(guān)鍵性位點(diǎn)，以及其他氨基酸位點(diǎn)變異是否會(huì)輔助性影響抗原變異，還有待于進(jìn)一步研究。

血清學(xué)交叉試驗(yàn)結(jié)果顯示Ⅲ-1分支的血清抗體滴度明顯低于Ⅲ-2分支的血清抗體滴度。推測(cè)所采用的血清抗體非疫苗株誘導(dǎo)產(chǎn)生，有可能是變異株誘導(dǎo)產(chǎn)生，但也不排除養(yǎng)殖場(chǎng)采用其他疫苗株免疫。

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Antigenic Variation Analysis of Two Evolutionary Branches of H9N2 Subtype Avian Influenza Viruses from Yunnan Province in 2013

SHI Feng-hai1,HU Yuan-yuan2,ZHANG Wen-dong3, KONG Qiang4,ZHANG Ying-guo3,FAN Quan-shui5, ZHAO Huan-yun3, ZHANG Fu-qiang5

(1.CentreforAnimalDiseasePreventionandControl,LincangCity,Lincang,Yunnan,677000,China;2.YunnanVocationalandTechnicalCollegeofAgriculture,Kunming,Yunnan,650031,China;3.CentreforAnimalDiseasePreventionandControl,YunnanProvince,Kunming,Yunnan,650201,China;4.YunnanAgricultureUniversity,Kunming,Yunnan,650223,China;5.CentreforDiseasePreventionandControl,ChengDuMilitaryRegion,Kunming,Yunnan,650032,China)

Abstract:In order to investigate the antigenic differences between Ⅲ-1 and Ⅲ-2 of the H9N2 subtype AIV in Yunnan province in 2013,and whether the antigenic difference is related to the amino acid mutation,7 virus strains and vaccine strains were analyzed by phylogenetic analysis and serological cross test.The results showed that:the homologies of HA gene of the two subgroup strains were 86.6 % to 98.4%, the relationship was far with the vaccine strains before 2000,Ⅲ-1 strains were near with the vaccine strains (ACKLGQ113 and ACKDL2010)after 2000.The HI cross test results by statistics analysis showed that the antigenicity differences exist between Ⅲ-1 and Ⅲ-2 subgroups.Amino acid comparative analysis result showed that variations in different subgroup strains exist;compared with the antigenic epitope sites reported,the variation existed in parts of Ⅲ-1 strains and in Ⅲ-2 strains is no change,but there are unique variations in eight other amino acid sites of Ⅲ-2 strains,whether there is any unknown antigen epitope sites,or the other ancillary amino acid sites whether can affect antigen variation,have yet to be further studied.

Key words:Avian influenza virus;H9N2 subtype;different evolutionary branch;antigenic variation analysis

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0006-06

中圖分類號(hào):S852.695.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：石鳳海(1968-)，男，云南臨滄人，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防治工作。胡媛媛(1977-)，女，吉林梅河口人，講師，主要從事分子病毒學(xué)研究。△同等貢獻(xiàn)作者。*通訊作者

基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012CH002)；國(guó)家公益性行業(yè)專項(xiàng)(201103008)；軍隊(duì)科技計(jì)劃項(xiàng)目(CWS12J075、13BJYZ37、A12005)

收稿日期：2015-09-11