水稻雄性不育突變體gamyb 5的鑒定與基因定位

楊正福張迎信孫廉平張沛沛軒丹丹劉嶺，3胡霞李紫荷占小登吳瑋勛曹立勇，＊程式華，＊

（1中國水稻研究所／國家水稻改良中心／浙江省超級稻研究重點實驗室，杭州311401；2沈陽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，沈陽110866；3河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，鄭州450002；＃共同第一作者；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：caoliyong＠caas.cn，shcheng＠m(xù)ail.hz.zj.cn）

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水稻雄性不育突變體gamyb 5的鑒定與基因定位

楊正福1，＃張迎信1，＃孫廉平1，2張沛沛1軒丹丹1劉嶺1，3胡霞1李紫荷1占小登1吳瑋勛1曹立勇1，＊程式華1，＊

（1中國水稻研究所／國家水稻改良中心／浙江省超級稻研究重點實驗室，杭州311401；2沈陽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，沈陽110866；3河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，鄭州450002；＃共同第一作者；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：caoliyong＠caas.cn，shcheng＠m(xù)ail.hz.zj.cn）

楊正福，張迎信，孫廉平，等.水稻雄性不育突變體gamyb5的鑒定與基因定位.中國水稻科學，2016，30（2）：143－151.

摘 要：在(60)Co－γ射線輻射誘變秈稻中恢8015的突變體庫內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個無花粉型雄性不育突變體gamyb5。gamyb5的株型、株高、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀與野生型中恢8015無差異，而其花藥細長且呈白色半透明狀，花藥中無花粉粒。花藥半薄切片觀察結果表明，gamyb5的小孢子母細胞減數(shù)分裂異常，沒有形成正常的四分體和小孢子，并且絨氈層異常伸長，細胞程序性死亡延遲。對以gamyb5為母本，與野生型中恢8015和廣親和粳稻品種02428分別配制的雜交組合遺傳分析表明，gamyb5突變性狀受一個隱性核基因控制。利用gamyb5和02428雜交的F2定位群體，最終將突變基因精細定位于第1染色體長臂的ZF－29和ZF－31兩個標記之間，物理距離約16.9kb。對該區(qū)域內(nèi)2個完整的開放閱讀框測序分析發(fā)現(xiàn)，編碼受赤霉素誘導的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因LOC＿Os01g0812000的第2外顯子存在8個堿基的缺失，導致翻譯提前終止。qRT－PCR檢測到影響花藥發(fā)育的調(diào)控因子UDT1、TDR、CYP703A3和CYP704B2的表達量在突變體中比野生型中極顯著降低。進一步證明GAMYB在花藥減數(shù)分裂和絨氈層細胞程序性死亡過程中起關鍵作用。

關鍵詞：水稻；雄性不育；基因定位；gamyb5

水稻雄性生殖發(fā)育是一個復雜的生物學過程，也是水稻繁衍后代和產(chǎn)量形成的關鍵過程。首先，雄蕊原基的三層細胞經(jīng)過數(shù)輪細胞分裂和分化，形成由四層體細胞包圍著花粉母細胞的花藥結構。這四層體細胞由外到內(nèi)依次為表皮層、內(nèi)皮層、中間層和絨氈層［1－6］。其次花粉母細胞經(jīng)過減數(shù)和有絲分裂最終形成三核花粉粒。最終花藥開裂散粉，至此整個雄性生殖發(fā)育過程完成。

水稻因其經(jīng)濟上的重要性以及較小的基因組，成為了分子生物學和功能基因組學研究的單子葉模式植物。目前，已克隆了超過20個水稻隱性核雄性不育基因［7］。根據(jù)不育基因的功能和表達時期的差異，可將水稻隱性核雄性不育基因大致分為調(diào)控小孢子母細胞發(fā)育、減數(shù)分裂、絨氈層發(fā)育、小孢子和花粉外壁發(fā)育以及花藥開裂等相關的不育基因。MSP1（Multiple Sporocyte 1）是水稻中第1個克隆的早期調(diào)控小孢子細胞發(fā)育的基因，它編碼富含亮氨酸的受體蛋白激酶。msp1突變體產(chǎn)生過量的雌雄孢子母細胞，花粉囊細胞壁和絨氈層發(fā)育紊亂，小孢子母細胞發(fā)育停留在減數(shù)分裂Ⅰ期，而大孢子母細胞的發(fā)育不受影響，最終導致花粉徹底敗育［8］。PAIR（Pairing Aberration In Rice）系列基因PAIR1、PAIR2和PAIR3參與減數(shù)分裂中同源染色體聯(lián)會配對［9－11］。ZEP1（Zeaxanthin Epoxidase1）［12］、MEL1［13］、PSS1［14］都是調(diào)控水稻減數(shù)分裂的基因。已克隆的調(diào)控水稻花藥絨氈層發(fā)育的育性基因TDR（Tapetum Degeneration Retardation）［15］、UDT1（Undeveloped Tapetum1）［16］、GAMYB［17］、PTC1（Persistent Tapetal Cell1）［18］和API5（Apoptosis Inhibitor5）［19］等轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控花藥絨氈層的PCD過程和花粉粒的形成過程。還有一類基因與小孢子花粉壁蠟質(zhì)角質(zhì)等物質(zhì)形成有關，該類基因突變致使花粉囊和花粉外壁發(fā)育受阻，導致花粉敗育。例如：WDA1（Wax－Deficient Anther1）［20］和DPW（Defective Pollen Wall）突變體花粉囊蠟質(zhì)顯著減少，花粉粒皺縮退化，導致花粉敗育［21］。CYP704B2［22］和CYP703A3［23］都屬于細胞色素P450基因家族，在脂肪酸的羥基化過程中起重要作用，表明脂肪酸ω－羥基化在植物雄配子體發(fā)育和孢子體發(fā)育過程中的角質(zhì)合成和花粉粒外壁形成中發(fā)揮重要作用。AID1（Anther Indehiscence1Gene 1）控制水稻花藥的開裂和花粉的育性。aid1突變體中花藥不開裂、花粉發(fā)育異常，引起雄性不育［24］。OsGAMYB在大麥、黃瓜、擬南芥中的同源基因已克隆。GAMYB是大麥糊粉層中赤霉素依賴的α淀粉酶轉(zhuǎn)錄正調(diào)控因子。在水稻中，GAMYB除了影響糊粉層和花粉囊發(fā)育過程中淀粉酶的表達，還調(diào)控絨氈層降解的PCD過程和花粉發(fā)育過程，是水稻花粉發(fā)育早期所必需的轉(zhuǎn)錄因子。但水稻雄配子體發(fā)育過程和調(diào)控機制并未被完全探明，對控制gamyb5突變體雄性不育基因的定位與克隆有助于更全面地水稻雄配子體發(fā)育的分子機制，為雄性不育株系進行育種應用提供理論基礎和基因資源［25］。

本研究通過60Co－γ輻射誘變秈稻品種中恢8015，從其后代中分離鑒定出一個無花粉型雄性不育突變體gamyb5，對其進行表型鑒定和基因定位等研究，并篩選出候選基因，為進一步研究該基因功能和探究其育種應用潛力提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

秈型水稻恢復系中恢8015（ZH8015）經(jīng)60Co－γ輻射誘變，在其后代中鑒定出一個無花粉型雄性不育突變體gamyb5，通過挖稻樁的方式進行繁殖。所有親本材料于2013年夏種植于中國水稻研究所實驗基地，種植與管理同大田生產(chǎn)。

1.2 遺傳分析及定位群體的構建

以突變體gamyb5為母本，分別以野生型中恢8015和廣親和常規(guī)粳稻品種02428為父本，配制雜交組合；觀察BC1F1和F1的表型，分單株收獲種子。在BC1F2和F2群體統(tǒng)計無花粉型與正常野生型的分離比例，用于遺傳分析和基因定位。所有材料2014年種植于中國水稻研究所杭州富陽實驗基地和海南陵水基地，種植與管理同大田生產(chǎn)。

1.3 花粉育性調(diào)查

抽穗期當日開花前，取野生型和突變體的穎花并套自交袋，每株3個重復，掛牌標記，用1%I2－KI染色鏡檢，拍照并計算典敗、圓敗、染敗、正常花粉粒比率。成熟期摘取自交袋室內(nèi)考種，計算結實率。

1.4 gamyb5突變體花藥的半薄切片觀察

取野生型和突變型不同發(fā)育時期的小花，于FAA固定液（V38%甲醛∶V冰乙酸∶V50%乙醇＝5∶5∶90）中固定，利用真空泵緩慢抽氣，近真空狀放置，緩慢放氣至樣品全部沉底，換用新的FAA，固定24h；經(jīng)梯度酒精脫水后于Technovit7100樹脂預滲透液中靜置2h，再于樹脂滲透液中靜置2h；后于包埋板中聚合，60℃恒溫箱中烘烤4d左右。Leica RM2265半薄切片機上橫切花藥，切片厚度為2μm，甲苯胺藍染色后用Leica DM2000光學顯微鏡觀察拍照。

表1 精細定位和測序引物Table 1.Makers used for fine mapping and sequencing.

1.5 DNA的提取和基因定位

用簡易DNA提取法［26］分單株提取組合gamyb5／02428的F2中突變型單株DNA。利用本實驗室保存的515對SSR標記［27］和167對InDel標記［28］檢測中恢8015和02428之間的多態(tài)性，選取平均分布于水稻12條染色體上133對多態(tài)引物對8株突變型單株進行染色體連鎖分析及初步定位。

根據(jù)Gramene（http：／／www.gramene.org）中公布的粳稻日本晴和秈稻93－11的全基因組序列，用DNASTAR軟件對比初定位區(qū)間內(nèi)的基因組序列，尋找插入／缺失（InDel）位點，利用Primer Premiers 5.0軟件設計新的InDel分子標記，對突變基因進行精細定位（表1）。所用引物由杭州擎科梓熙生物技術有限公司合成。

PCR擴增采用北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司的10μL反應體系：模板DNA 10μL，10× PCR緩沖液1μL，Primer（20μmol／L）1μL，dNTP 0.2μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 6.7μL；PCR程序如下：94℃下預變性4min；94℃下變性30s，58℃下退火30s，72℃下延伸45s，共30個循環(huán)；最后72℃下延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.1%AgNO3染色、甲醛和NaOH顯色。

1.6 候選基因分析

從水稻基因組注釋計劃數(shù)據(jù)庫（http：／／rapdb. dna.affrc.go.jp）中查閱位于精細定位區(qū)間內(nèi)的所有開放閱讀框（ORF），并分析可能的候選基因。根據(jù)候選基因的全長基因組DNA序列，設計測序引物（由上英濰捷基貿(mào)易有限公司合成），分別對突變體gamyb5和野生型中恢8015的候選基因進行PCR擴增并測序，PCR擴增采用高保真DNA聚合酶KOD－Plus－Neo，反應體系及反應條件參照說明書。PCR產(chǎn)物送往杭州擎科梓熙生物技術有限公司測序，測序結果由Contig Express軟件拼接，并使用DNASTAR中的MegAlign進行序列比對，確定突變位點。

1.7 實時熒光定量PCR分析

用TOYOBO公司包含去基因組酶的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（First Strand cDNA Synthesis Kit），提取10 cm長花序時的花藥總RNA。以Oligo（dT）18為反轉(zhuǎn)引物進行第1鏈cDNA合成，反應體系及反應條件參照說明書。利用實時熒光定量PCR分析調(diào)控花藥育性的關鍵基因MSP1、TDR、UDT1、CYP703A3、CYP704B2以及突變基因GAMYB在野生型和突變體中的表達量。內(nèi)參基因為RUBQ （GenBank登錄號為NM＿001052515）。實時熒光定量PCR體系（20μL）包括蒸餾水6.4μL、2× SYBR qPCR Mix 10μL、上下游引物（10μmol／L）各0.8μL、cDNA模板2μL，每個樣品3個重復。PCR擴增程序為95℃下30s；95℃下5s，58℃下30s，72℃下15s，40個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 突變體表型分析

突變體gamyb5及其野生型中恢8015在株高、分蘗等株型性狀和穗部表型上無明顯差異（圖1－A～C），但是野生型的花藥飽滿呈黃色，而突變體的花藥瘦弱呈白色（圖1－D）?；ǚ坨R檢結果顯示，野生型中恢8015的花粉粒全部被1%I2－KI染成深色，育性正常，而突變體gamyb5花藥經(jīng)染色壓片，并無花粉粒釋放出來，完全敗育。

A－中恢8015和突變體gamyb5的植株；B－中恢8015和突變體gamyb5的穗部表型；C－中恢8015和突變體gamyb5的穎花形態(tài)；D－中恢8015和突變體gamyb5的花藥表型。E－中恢8015和突變體gamyb5的花粉育性。A，Plant of Zhonghui 8015and the gamyb5 mutant at the heading stage；B，Panicle of Zhonghui 8015and the gamyb5 mutant；C，Spikelet of the wild type Zhonghui 8015and gamyb5；D，Anther of Zhonghui 8015and gamyb5 mutant；E，Pollen fertility of Zhonghui 8015and gamyb5.圖1 野生型中恢8015（WT）與突變體gamyb5抽穗期的表型比較Fig.1.Phenotypic comparison of wild type Zhonghui 8015（WT）and gamyb5.

2.2 突變體遺傳分析

以gamyb5突變體為母本，廣親和粳稻品種02428和野生型中恢8015為父本，配制雜交組合，其F1植株花粉育性和小穗育性正常。分別統(tǒng)計BC1F2和F2群體中的野生型和突變型植株數(shù)，經(jīng)卡方檢驗，均符合3∶1的分離比值（表2），同時還統(tǒng)計了野生型中恢8015和02428雜交F1結實率，在其分離群體中并沒有發(fā)現(xiàn)無花粉型雄性不育植株，這表明gamyb5突變性狀受核隱性單基因控制。

2.3 目的基因的初定位和精細定位

表2 突變體gamyb5的遺傳分析Table 2.Genetic analysis of the gamyb5 mutant.

為定位gamyb5雄性不育基因，選取平均分布于12條染色體上的133對多態(tài)引物對8株突變型單株進行染色體連鎖分析及初步定位。連鎖分析發(fā)現(xiàn)第1染色體上RD0114和InDel15兩個SSR標記與gamyb5連鎖。參考Gramene網(wǎng)站（http：／／www.gramene.org／）上公布的日本晴和93－11全基因組序列，進一步在RD0114和InDel15之間設計InDel標記（表2）。最終將目的基因定位在ZF－29 和ZF－31標記之間，物理距離約16.9kb（圖2）。

A－突變基因的初步定位；B－突變基因的精細定位；C－精細基因定位區(qū)間中的預測基因；D－候選基因LOC＿Os01g0812000的結構及其在突變體中的突變位點（8個堿基缺失）。A，Preliminary mapping of gamyb5；B，F(xiàn)ine mapping of gamyb5；C，Prediction of the candidate gene within the fine－mapped region；D，The structure of candidate gene LOC＿Os01g0812000and the mutation site in gamyb5 mutant（8bases deleted）.圖2 突變基因的圖位克隆Fig.2.Positional cloning of the gamyb5 mutated gene.

2.4 候選基因的克隆及序列分析

根據(jù)水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫（Rice Genome Annotation Project）提供的水稻基因組注釋序列，在精細定位的16.9kb的區(qū)間內(nèi)，有兩個注釋基因（圖2－C）。其中，LOC＿Os01g0812025是非編碼蛋白轉(zhuǎn)錄本，LOC＿Os01g0812000編碼受赤霉素誘導的MYB轉(zhuǎn)錄因子，在糊粉層、花序頂部區(qū)域、雄蕊原基和花藥絨氈層細胞高水平表達，但在營養(yǎng)生長器官中以及伸長的莖中低表達［29］。水稻OsGAMYB由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成（圖2－D），基因全長4.287kb，編碼區(qū)長度為1.662kb，編碼的MYB轉(zhuǎn)錄因子由553個氨基酸組成。將中恢8015和突變體gamyb5中的OsGAMYB基因進行PCR擴增和測序。測序結果顯示gamyb5突變體中的OsGAMYB從ATG開始的第446個堿基起，存在8個堿基缺失（圖2－D），最終導致翻譯提前終止?；诖耍琯amyb5的候選基因很可能就是OsGAMYB。

2.5 花藥半薄切片分析

通過花藥半薄橫切來觀察野生型和突變型在花藥發(fā)育過程中的差異。根據(jù)張大兵等［4］將花藥發(fā)育劃分為14個階段，在前7個階段，突變體gamyb5和野生型的花藥細胞形態(tài)并沒有顯著差異（圖3－A，G），此時小孢子母細胞開始減數(shù)分裂。在第8階段，野生型小孢子母細胞經(jīng)過連續(xù)的兩次分裂，分別形成了二分體（圖3－B）和四分體。在花藥發(fā)育的第9階段，四分體的胼胝質(zhì)壁降解，小孢子被釋放在花粉囊腔中，同時中間層細胞被壓縮成帶狀，并降解（圖3－C），此時絨氈層細胞的DNA開始出現(xiàn)片段化，開始其PCD過程，但是在細胞學水平上還看不出明顯的降解痕跡。在第10階段，小孢子液泡化并呈圓形，此時絨氈層細胞呈帶狀，PCD程度很高，各種細胞器開始降解（圖3－D）。在第11階段，液泡化的小孢子經(jīng)歷一次不對稱的有絲分裂，形成一個生殖細胞和一個營養(yǎng)細胞（圖3－E）。此后，在第12階段，生殖細胞再經(jīng)歷一次有絲分裂，形成兩個精核，至此由兩個精核和一個營養(yǎng)核組成的成熟花粉粒發(fā)育成熟。然而，在突變體gamyb5中，小孢子母細胞經(jīng)歷了異常的減數(shù)分裂和細胞分裂，沒有形成有功能的二價體（圖3－H）。此外，在gamyb5中，從第9階段開始，絨氈層開始不正常伸長，并且中間層并未降解（圖3－I），在第12階段，野生型中已形成成熟的花粉粒，而在gamyb5中，絨氈層仍在異常伸長，幾乎占據(jù)了整個花粉囊腔，但是沒有形成花粉粒（圖3－L）。

A到F為野生型，G到L為突變體gamyb5。A和G為花藥發(fā)育第7階段時的橫切；B和H為第8a階段時花藥橫切；C和I為第9階段時花藥橫切；D和J為第10階段時花藥橫切；E和K為第11階段時花藥橫切；F和L為第12階段時花藥橫切。Ep－表皮層；En－內(nèi)皮層；ML－中層；T－絨氈層；Ms－小孢子母細胞；Dy－二分體；Msp－小孢子；BP－二孢花粉；MP－成熟花粉。標尺為20μm。A to E，Wild type；G to L，The gamyb5 mutant.A and G，Cross－section of anthers at the stage 7；B and H，Cross－section of anthers at the stage 8；C and I，Cross－section of anthers at the stage 9；D and J，Cross－section of anthers at the stage 10；E and K，Cross－section of anthers at the stage 11；F and L，Cross－section of anthers at the stage 12.Ep，Epidermis；En，Endothecium；ML，Middle layer；T，Tapetum；Ms，Microsporocyte；Dy，Dyad cell；Msp，Microspore；BP，Biceullar pollen；MP，Mature pollen.Bars＝20μm.圖3 gamyb5突變體和中恢8015野生型不同發(fā)育時期花藥半薄橫切觀察Fig.3.Transverse section analyses of the wild type and gamyb5 anthers in various of developmental stages.

2.6 花藥發(fā)育相關基因的表達分析

利用實時定量PCR比較了gamyb5與野生型中隱性核雄性不育相關基因的表達量。這類基因包括編碼LRR類受體激酶的MSP1基因，編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的TDR、UDT1基因，細胞色素P450家族基因CYP703A3、CYP704B2，以及本研究中的目的基因GAMYB。如圖4所示，與野生型相比，除MSP1基因外，突變體gamyb5的TDR、UDT1、CYP703A3、CYP704B2以及GAMYB基因的表達量均顯著降低，說明GAMYB基因突變，導致這些基因表達量下調(diào)，即正向調(diào)控這些基因。

3 討論

本研究中的gamyb5突變體表現(xiàn)出花藥瘦弱呈白色透明，經(jīng)I2－KI染色壓片后，藥室中并未觀察到花粉粒，完全敗育?；ㄋ幇氡∏衅@示，突變體gamyb5減數(shù)分裂異常，沒有形成有功能的四分體和小孢子。從花藥發(fā)育的第9階段起，絨氈層細胞異常伸長，中層并未降解，絨氈層也沒有進入PCD過程，絨氈層占據(jù)了整個花藥腔室最終導致小孢子發(fā)育夭亡，形成無花粉型雄性不育。

遺傳分析和基因定位表明，gamyb5不育基因是一個單隱性核基因，位于第1染色體長臂的ZF－29和ZF－31兩個標記之間，物理距離約16.9kb。經(jīng)過測序分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域中編碼受赤霉素誘導的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因LOC＿Os01g0812000的第2外顯子有8個堿基缺失，最終導致翻譯提前終止，由此導致該基因功能失活。該突變體與之前報道的gamyb－1、gamyb－2、gamyb－3［29］和gamyb－4［17］等位，前3個突變體都是TOS17轉(zhuǎn)座子插入到日本晴中形成的突變體，gamyb－4由輻射誘變所得。gamyb－1、gamyb－3轉(zhuǎn)座子插入到了OsGAMYB的第2外顯子中，gamyb－2轉(zhuǎn)座子插入到了第3外顯子中；gamyb－4在第2外顯子中由單堿基C缺失引起編碼框改變，轉(zhuǎn)錄提前終止。而gamyb5的突變位點在第2外顯子近MYB結構域端，有8個堿基缺失，最終導致翻譯提前終止。并且它們的遺傳背景也不相同，前四個等位突變體都是來自粳稻品種，而gamyb5是由秈稻品種中恢8015經(jīng)60Co－γ射線輻射誘變得到。在表型上，gamyb－1、gamyb－2和gamyb－3表型比較強，既有花藥皺縮不育，也有內(nèi)外稃白化畸形，甚至雌雄蕊都不育的強突變體［29］；gamyb－4的花藥白色，瘦小，沒有花粉粒，完全不育［17］。而gamyb5的花藥瘦弱，呈白色透明，花藥長度并沒有發(fā)生變化，花粉徹底敗育。雖然突變體gamyb5與gamyb－1、gamyb－2、gamyb－3和gamyb－4相比，表型變化較小，但敗育徹底。這種差異很可能是由于TOS17轉(zhuǎn)座子插入會引起比較大的表型變化；其次gamyb5的突變位點更接近MYB結構域，影響其空間結構，致使突變更加徹底，但由于是在秈稻遺傳背景下，花藥表型突變較小。

＊＊在P＝0.01水平上差異顯著。＊＊significant at P＝0.01.圖4 實時熒光定量PCR分析野生型與突變體中水稻隱性核雄性不育相關基因的表達Fig.4.Expression analysis of male sterility－associated genes of the wild type and the mutant.

GAMYB含有高度保守的MYB結構域和3個保守域［30］。最早在大麥中報道GAMYB受赤霉素誘導，在糊粉層中正向調(diào)控α－淀粉酶的表達，在花藥發(fā)育、雄蕊生長、花原基誘導和種子萌發(fā)等植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用［31－33］。Aya等報道GAMYB在絨氈層PCD、花粉外壁以及烏氏體形成中起重要作用［34］。UDT1在花藥發(fā)育的第6階段到第10階段在絨氈層中高表達［16］，TDR主要在花藥發(fā)育的減數(shù)分裂和小孢子形成時期在絨氈層中表達［15］。我們通過RT－qPCR分析，在gamyb5中，除了MSP1表達量沒有顯著性差異外，TDR、UTD1、CYP703A3、CYP704B2以及GAMYB的表達量均極顯著降低。已有報道MSP1調(diào)控GAMYB和UDT1的表達［35］，GAMYB可能與UDT1獨立表達，調(diào)控花藥發(fā)育，并且共同正調(diào)控TDR的表達［17］，而在gamyb5中，UDT1的表達量顯著降低，也許GAMYB對UDT1的表達存在某種調(diào)節(jié)。GAMYB和TDR可以直接調(diào)控CYP703A3的表達，CYP703A3突變并不影響絨氈層的細胞程序性死亡，但對花粉壁和角質(zhì)的形成起關鍵作用。它催化C12∶0脂肪酸羥基化，形成7－OH－C12∶0脂肪酸［23，34，36］。該物質(zhì)作為脂肪酸合成的中間產(chǎn)物，最終通過脂肪酸合成途徑延長碳鏈并在CYP704B2的作用下發(fā)生脂肪酸ω－羥基化，參與花粉外壁和花藥角質(zhì)的形成［22，37－41］。本研究中，控制gamyb5突變性狀基因是1個隱性核基因，是已報道的OsGAMYB的等位基因。GAMYB表達量降低，引起下游調(diào)控育性基因TDR、CYP703A3、CYP704B2表達量下調(diào)，導致絨氈層異常伸長，花粉壁形成受阻，最終導致突變體gamyb5突變表型的出現(xiàn)。進一步證明了GAMYB在水稻花藥小孢子發(fā)育和花粉壁形成中起關鍵作用。

謝辭：感謝上海交通大學植物發(fā)育生物學研究室張大兵教授、梁婉琪研究員以及汪潔老師對本實驗的大力幫助。

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Identification and Gene Mapping of Male Sterile Mutant gamyb 5in Rice

YANGZheng－fu1，＃，ZHANGYing－xin1，＃，SUNLian－ping1，2，ZHANGPei－pei1，XUANDan－dan1，LIULing1，3，HU Xia1，LI Zi－h(huán)e1，ZHANXiao－deng1，WU Wei－xun1，CAOLi－yong1，＊，CHENGShi－h(huán)ua1，＊
（1National Center for Rice Improvement／Key Laboratory for Zhejiang Super Rice Research，China National Rice Research Institute，Hangzhou 311401，China；2 College of Agronomy，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；3 College of Agronomy，He′nan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；＃These authors contributed equally to this work；＊Corresponding author，E－mail：caoliyong＠caas.cn；shcheng＠m(xù)ail.hz.zj.cn）

YANG Zhengfu，ZHANG Yingxin，SUN Lianping，et al.Identification and gene mapping of male sterile mutant gamyb5 in rice.Chin J Rice Sci，2016，30（2）：143－151.

Abstract：The gamyb5，apollen－free male sterile mutant was identified from the mutant library of(60)Co－γ－treated indica cultivar Zhonghui 8015.There was no significant difference in agronomic traits such as plant type，plant height and tiller number between gamyb5 and the wild－type.But gamyb5 exhibited slender and white anthers without mature pollen grains.Observation results of anther cross－sections exhibited that the microspore mother cells failed to form functional tetrads and microspores in gamyb5.Moreover，tapetal cells of gamyb5 abnormally enlarged and the tapetum programmed cell death（PCD）was delayed.gamyb5，as the pollen acceptor，was crossed with the wild type Zhonghui 8015and a japonica cultivar 02428，respectively.Genetic analysis of all hybridization populations indicated that gamyb5 was controlled by a single recessive nuclear gene which was mapped on the long arm of chromosome 1.With developed SSR，Indel markers and F2mapping population of gamyb5／02428，the gene was fine mapped to a region of 16－kb on the long arm of chromosome 1between markers ZF－29and ZF－31.Sequence analysis of the two open reading frames in this region revealed that the LOC＿Os01g0812000，which encodes a gibberellin－induced MYB transcription factor，had an 8nucleotides bases deletion in the second extron probably responsible for the male sterility phenotype.Additionally，real－time fluorescent quantitative PCR analysis showed that the expression level of the important regulators UDT1，TDR，CYP703A3 and CYP704B2 in anther decreased significantly in gamyb5.Together，these results suggest GAMYBplays key roles in anther meiosis and tapetum PCD.

Key words：rice；male sterility；gene mapping；gamyb5

中圖分類號：Q343.5；S511.032

文獻標識碼：A

文章編號：1001－7216（2016）02－0143－09

基金項目：農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科技專項（20140302，20150308）；國家轉(zhuǎn)基因重大專項（2014ZX08001－002）；浙江省自然科學基金資助項目（Q13C130009）；中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程超級稻育種創(chuàng)新團隊、水稻雜種優(yōu)勢機理研究創(chuàng)新團隊項目（CAAS－ASTIP－2013－CNRRI）；國家自然科學基金資助項目（31501290）。

收稿日期：2015－10－19；修改稿收到日期：2015－12－11。