水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族響應(yīng)外源一氧化氮的表達(dá)譜分析

孟姣王海華，2，3，＊向建華蔣丹彭喜旭，3賀歡歡

（1湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南湘潭411201；2重金屬污染土壤生態(tài)修復(fù)與安全利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南湘潭411201；3園藝作物病蟲害防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南湘潭411201；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：hhwang＠hnust.edu.cn）

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水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族響應(yīng)外源一氧化氮的表達(dá)譜分析

孟姣1王海華1，2，3，＊向建華1蔣丹1彭喜旭1，3賀歡歡1

（1湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南湘潭411201；2重金屬污染土壤生態(tài)修復(fù)與安全利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南湘潭411201；3園藝作物病蟲害防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南湘潭411201；＊通訊聯(lián)系人，E－mail：hhwang＠hnust.edu.cn）

孟姣，王海華，向建華，等.水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族響應(yīng)外源一氧化氮的表達(dá)譜分析.中國水稻科學(xué)，2016，30（2）：111－120.

摘 要：一氧化氮（nitric oxide，NO）信號分子與WRKY轉(zhuǎn)錄因子均參與植物抗逆、發(fā)育與代謝等許多生理過程。采用Agilent水稻全基因組cDNA芯片分析了NO處理后1、6和12h水稻幼苗WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)譜，鑒定出在1個(gè)時(shí)間點(diǎn)有兩倍或兩倍以上表達(dá)變化的WRKY基因32個(gè)，主要分布在WRKY的Ⅰ和Ⅱ組，其中75%的Ⅱa和45.6%的Ⅱd亞組成員為差異表達(dá)基因；鑒定出至少在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)有兩倍或兩倍以上表達(dá)變化的WRKY基因15個(gè)，均為早期（1h）應(yīng)答，且多數(shù)（64.2%）持續(xù)上調(diào)；基因功能預(yù)測分析表明，這些基因主要參與生物學(xué)過程中的細(xì)胞過程、代謝過程和刺激響應(yīng)，以及分子功能中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性和結(jié)合；代謝通路分析表明，WRKY24涉及植物與病原菌相互作用代謝通路。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片雜交結(jié)果基本一致，印證了芯片雜交結(jié)果的有效性。上述發(fā)現(xiàn)提示，NO信號可能參與了WRKY轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的生物學(xué)調(diào)控功能，并為這些基因的進(jìn)一步功能分析奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；一氧化氮；基因表達(dá)譜

植物在正常生長條件下的發(fā)育與代謝以及在環(huán)境脅迫條件下的應(yīng)答均涉及一系列相關(guān)基因在空間和時(shí)間上的差異表達(dá)與調(diào)控。轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，體現(xiàn)了效率和靈活的原則，因此，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在植物基因表達(dá)調(diào)控中占據(jù)中心位置。轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子中的順式元件特異結(jié)合，從而激活或抑制基因的表達(dá)，在植物的發(fā)育、代謝以及環(huán)境適應(yīng)等諸多生理過程中扮演重要的角色。全基因組基因鑒定表明，擬南芥和水稻基因組分別有超過2100和2300個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，而且相當(dāng)大比例的轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)橹参锼赜校?］。轉(zhuǎn)錄因子基因在全基因組尺度上的cDNA微陣列表達(dá)分析和突變體的遺傳分析都證明了它們在植物基因表達(dá)調(diào)控中的重要性。

WRKY蛋白在高等植物中構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子超家族［2］。它們最典型的結(jié)構(gòu)特征是含有1～2個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域：由大約60個(gè)氨基酸組成，其N端的七肽WRKYGQK十分保守，C端為鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)所含WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指類型，WRKY蛋白可分成三個(gè)組別。第Ⅰ組含兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指類型為C－X4－5－C－X22－23－H－X－H；第Ⅱ和Ⅲ組只含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指分別為C－X4－5－C－X22－23－H－X－H和C－X7－C－X23－H－X－C。WRKY蛋白C端的WRKY結(jié)構(gòu)域具DNA結(jié)合活性，而N端的WRKY結(jié)構(gòu)域可能介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，或具有輔助DNA結(jié)合的活性。WRKY蛋白絕大部分均與W盒［（T）（T）TGAC （C／T）］順式元件結(jié)合［2］，從側(cè)面反映了WRKY域的保守性。WRKY保守結(jié)構(gòu)域外的氨基酸順序分歧較大，這與不同的WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有不同的生物學(xué)功能相符。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子最顯著的功能是調(diào)節(jié)植物抗病反應(yīng)［3］，并在植物抗高溫／低溫、高鹽、干旱、滲透和營養(yǎng)饑餓等非生物逆境以及發(fā)育和代謝中具有重要的調(diào)節(jié)功能［4－5］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子對植物生理過程的調(diào)節(jié)作用與水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和脫落酸（ABA）等激素介導(dǎo)的信號途徑密切相關(guān)。例如，擬南芥WRKY70（AtWRKY70）和水稻W(wǎng)RKY13（Os－WRKY13）位于SA和JA抗病信號途徑的交叉點(diǎn)，通過激活前者而抑制后者，從而調(diào)控植物抗病反應(yīng)［6－7］。我們已證明，OsWRKY4作為JA信號途徑中的正調(diào)節(jié)子，介導(dǎo)水稻對紋枯病的抗性［8］。突變體的遺傳分析表明，AtWRKY40、AtWRKY18和 AtWRKY60的敲除突變體均在種子萌發(fā)過程中表現(xiàn)出ABA超敏表型，三者協(xié)同在ABA信號傳遞中起負(fù)調(diào)控作用［9］。

全基因組表達(dá)譜分析有助于初步推測基因家族成員的生物學(xué)功能。Ryu等［10］運(yùn)用RT－PCR和Northern雜交研究了水稻W(wǎng)RKY基因家族在稻瘟病菌接種以及SA和JA處理下的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在所檢測的45個(gè)WRKY基因中有15個(gè)表達(dá)上調(diào)，Os－WRKY45和OsWRKY62的表達(dá)受SA誘導(dǎo)，Os－WRKY10、OsWRKY82和OsWRKY85的表達(dá)受JA誘導(dǎo)，而OsWRKY30和OsWRKY83既受SA又受JA誘導(dǎo)。Ramamoorthy等［11］運(yùn)用RT－PCR在全基因組范圍研究了水稻W(wǎng)RKY基因在寒冷、干旱和鹽脅迫以及SA、JA、ABA等5種激素處理下的表達(dá)譜，結(jié)果表明，共有54個(gè)WRKY基因的表達(dá)發(fā)生了顯著差異，其中13個(gè)基因的表達(dá)僅受非生物脅迫的影響，13個(gè)基因的表達(dá)僅受激素的影響，而剩余的28個(gè)基因的表達(dá)同時(shí)受非生物脅迫和激素的調(diào)節(jié)，提示W(wǎng)RKY調(diào)節(jié)非生物脅迫反應(yīng)和激素介導(dǎo)的信號傳遞之間存在交互作用。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一種具有高度反應(yīng)活性、膜透性的氣態(tài)小分子。作為信號激素廣泛參與植物發(fā)育過程，包括促進(jìn)種子萌發(fā)、氣孔關(guān)閉、不定根的發(fā)生和打破種子休眠等［12］。同時(shí)，NO具有緩解植物生物與非生物脅迫的作用，如病原、鹽、滲透、熱和金屬脅迫等［13－14］。NO如何影響植物WRKY的表達(dá)以及是否參與該家族對生理的調(diào)節(jié)作用鮮有報(bào)道，然而仍有線索表明水稻W(wǎng)RKY基因受NO的調(diào)控。cDNA微陣列雜交分析表明，At－WRKY15、AtWRKY25、AtWRKY40和At－WRKY53在NO處理下顯著上調(diào)表達(dá)［15］。At－WRKY27在擬南芥對細(xì)菌萎蔫病菌（Ralstonia solanacearum）抗性反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。Atwrky27突變體對NO供體硝普鈉（含有活性亞硝基配體，溶液狀態(tài)下可釋放有活性的NO）的處理十分敏感。表達(dá)譜分析表明，WRKY27負(fù)調(diào)控氮代謝相關(guān)基因和NO合成相關(guān)基因的表達(dá)［16］。然而，從全基因組范圍探討NO對水稻W(wǎng)RKY基因表達(dá)的影響未見報(bào)道。

為此，我們采用水稻全基因組cDNA微陣列（Agilent，4×44k）對硝普鈉處理下水稻W(wǎng)RKY基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，鑒定了受NO調(diào)節(jié)的WRKY基因（包括差異表達(dá)基因和響應(yīng)基因），運(yùn)用生物信息學(xué)方法對NO響應(yīng)的WRKY基因進(jìn)行了GO分析和代謝通路分析，部分WRKY的表達(dá)得到了qRT－PCR的驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 水稻材料培養(yǎng)與硝普鈉處理

將水稻日本晴（Oryza sativa L.japonica cv.Nipponbare）播種在添加木村B營養(yǎng)液的蛭石基質(zhì)上，在人工氣候室中培養(yǎng)至3葉1心期，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)100μmol／（m2·s），晝夜周期14h／10h，28℃／22℃，相對濕度約85%。用100μmol／L硝普鈉溶液（含0.1%吐溫80）對水稻進(jìn)行葉面噴施；為了保證處理充分，另在培養(yǎng)液中添加相同濃度的硝普鈉（不含吐溫80），分別在處理0（T0，對照）、1（T1）、6 （T6）和12h（T12）后取葉片，用錫箔紙包裹置于液氮中，－80℃下保存。

1.2 葉綠素含量測定

葉綠素提取與含量測定采用分光光度法和Arnon公式計(jì)算［17］。

1.3 RNA提取和純化

總RNA抽提采用TRIZOL試劑，根據(jù)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行，經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100電泳質(zhì)檢合格后，用RNeasy mini kit和RNase－Free DNase Set純化。

1.4 芯片雜交和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

采用Agilent rice oligo microarray（4×44k）芯片。該芯片代表了42 489個(gè)水稻基因或轉(zhuǎn)錄本，所有注解均可在RAP－DB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢。芯片雜交和雜交信號處理委托上海伯豪生物技術(shù)公司完成，實(shí)驗(yàn)方法參照Agilent單色微陣列雜交操作手冊。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行兩次獨(dú)立的微陣列雜交。從Feature Extraction Software獲得的微陣列雜交信號導(dǎo)入GeneSpring GX軟件（Agilent Technologies）。數(shù)據(jù)用P、A、M（分別表示正常、缺失和邊緣化的雜交信號）標(biāo)記，隨后用Quantile算法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并基于所有樣本的信號中值進(jìn)行基線處理。

1.5 數(shù)據(jù)篩選、聚類和功能分類

將標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SAS系統(tǒng)，獲得數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)化信號值經(jīng)Log2處理，計(jì)算基因在處理后不同時(shí)間點(diǎn)（Tn）與T0間的差異表達(dá)倍數(shù)（FC）：FC＝MeanTn／MeanT0。將在某一時(shí)間點(diǎn)上具有兩倍或兩倍以上表達(dá)變化的基因定義為差異表達(dá)基因（DEGs）；將在3個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)上至少在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)有兩倍或兩倍以上表達(dá)變化的基因定義為NO響應(yīng)基因。

用維恩圖鑒定出NO響應(yīng)基因后，用MeV 4.0軟件獲得各組重復(fù)樣本的聚類熱圖。根據(jù)RAP－DB數(shù)據(jù)庫提供的注釋文檔轉(zhuǎn)換格式后，利用agriGO對NO響應(yīng)基因進(jìn)行GO分析，用SAS的分子注釋功能得到通路分析圖，最后對NO響應(yīng)的WRKY基因進(jìn)行表達(dá)趨勢聚類分析。

1.6 qRT－PCR分析

隨機(jī)挑選8個(gè)WRKY基因，利用qRT－PCR對其表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因特異性引物（表1），擴(kuò)增產(chǎn)物大小在150bp左右。水稻Actin 1（Os03g0718100）作為內(nèi)參基因。

cDNA合成之前用DNaseⅠ消除基因組DNA污染。用FastQuant RT Kit（with gDNase）合成cDNA第一鏈。qRT－PCR在Bio－Rad CFX96PCR System上進(jìn)行，反應(yīng)體系包括10μmol／L的正反引物各0.6μL，2×SuperReal PreMix Plus 10μL，cDNA模板6μL，RNase－free ddH2O補(bǔ)至20μL。

表1 候選基因的qRT－PCR引物Table 1.Primers of the candidate genes for qRT－PCR.

反應(yīng)程序如下：95℃下15 min；95℃下10s，60℃下30s，40個(gè)循環(huán)。設(shè)陰性對照，三次技術(shù)重復(fù)和兩次生物學(xué)重復(fù)。結(jié)果釆用相對定量的方法（2－△△CT）計(jì)算基因的表達(dá)變化倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微陣列數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

將標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)各組數(shù)據(jù)導(dǎo)入SAS系統(tǒng)，用Correlation Analysis分析微陣列雜交實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性，重復(fù)樣本數(shù)據(jù)間的相關(guān)性系數(shù)均大于0.98（結(jié)果未顯示），說明實(shí)驗(yàn)具有較好的重復(fù)性，可用于后續(xù)分析。

2.2 NO處理下各時(shí)間點(diǎn)水稻葉片葉綠素含量測定

為了保證基因轉(zhuǎn)錄只發(fā)生中等程度的變化和獲得特異的基因表達(dá)譜，我們對NO供體硝普鈉的使用濃度進(jìn)行了前期的摸索，發(fā)現(xiàn)100μmol／L硝普鈉處理未對水稻幼苗葉綠素含量（圖1）和形態(tài)產(chǎn)生明顯的影響。

2.3 NO處理下WRKY基因的差異表達(dá)分析

手工搜索發(fā)現(xiàn)芯片共有WRKY探針112個(gè)，代表71個(gè)WRKY基因，它們在各時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)倍數(shù)見在線輔助性表S1（http：／／www.ricesci.cn／CN／article／showSupportInfo.do？id＝2580）。國際上多個(gè)獨(dú)立的研究小組致力于水稻W(wǎng)RKY功能的研究，先后出現(xiàn)了幾種不同的WRKY命名系統(tǒng)，給水稻W(wǎng)RKY的研究與交流帶來了一些混亂。為此，國際水稻W(wǎng)RKY工作組提出了統(tǒng)一的WRKY命名規(guī)則［18］。我們對芯片中71個(gè)WRKY基因中不符合規(guī)則的編號進(jìn)行修正。數(shù)據(jù)篩選結(jié)果表明，在3個(gè)NO處理時(shí)間點(diǎn)的某一時(shí)間點(diǎn)發(fā)生兩倍或兩倍以上表達(dá)變化的WRKY探針42個(gè)，基因32個(gè)（表2）。在處理1h時(shí)上調(diào)表達(dá)WRKY基因數(shù)為24個(gè)，下調(diào)9個(gè)；在6h時(shí)上調(diào)表達(dá)WRKY基因數(shù)為18個(gè)，下調(diào)表達(dá)15個(gè)；在12h時(shí)上調(diào)表達(dá)的WRKY基因數(shù)為26個(gè)，下調(diào)表達(dá)7個(gè)（圖2）。

T0、T1、T6、T12分別表示NO處理0、1、6和12h。下同。NO treatments for 0，1，6and 12hare indicated as T0，T1，T6and T12，respectively.The same as below.圖1 NO處理不同時(shí)間后水稻葉片葉綠素含量Fig.1.Chlorophyll contents in rice leaves after NO treatment for different time.

水稻粳稻基因組中鑒定的WRKY基因家族成員超過100個(gè)，分成Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組，其中第Ⅱ組又細(xì)分為a～d四個(gè)亞組［19］。芯片雜交結(jié)果表明，差異表達(dá)的WRKY基因在Ⅰ和Ⅱ組中的比例接近，分別為35.3%和36.7%，而占水稻W(wǎng)RKY基因家族最多的Ⅲ組的比例較低（25.0%）。Ⅱa亞組包含4個(gè)基因，其中3個(gè)為差異表達(dá)基因；將近一半（5／11）的Ⅱd亞組為差異表達(dá)基因（表3）。

用Venny分析鑒定了在3個(gè)NO處理時(shí)間點(diǎn)上至少在2個(gè)時(shí)間點(diǎn)有兩倍及兩倍以上表達(dá)變化的WRKY基因，即NO響應(yīng)的WRKY基因。結(jié)果表明，NO響應(yīng)的WRKY探針20個(gè)，代表15個(gè)基因（圖3－A）。將基因的差異表達(dá)倍數(shù)取Log2后導(dǎo)入MEV軟件，得到聚類熱圖（圖3－B）。

2.4 NO響應(yīng)的WRKY基因的GO分析和通路分析

圖2 NO處理后不同時(shí)間后差異表達(dá)的水稻W(wǎng)RKY基因Fig.2.Differentially expressed rice WRKY genes after NO treatments for different time.

Gene Ontology是一種生物本體語言，提供了三層結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)定義方式，即分子功能（molecular function）、生物過程（biological process）和細(xì)胞組成（cellular component）三個(gè)部分。根據(jù)RAP－DB數(shù)據(jù)庫所提供的注釋文檔將基因名稱轉(zhuǎn)換格式后，借助在線工具agriGO（http：／／bioinfo.cau.edu.cn／agriGO／）進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明，注釋的15個(gè)NO響應(yīng)的WRKY基因主要富集在生物過程中的細(xì)胞過程（cellular process，GO：0009987）、代謝過程（metabolic process，GO：0008152）和刺激應(yīng)答（response to stimulus，GO：0050896），以及分子功能中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子活性（transcription regulator activity，GO：0030528）和結(jié)合（binding，GO：0005488）（圖4）。

表2 NO處理下水稻W(wǎng)RKY差異表達(dá)基因的芯片分析Table 2.Microarray analysis of differentially expressed WRKYgenes in rice under NO treatment.

將NO響應(yīng)的WRKY基因?qū)隨AS系統(tǒng)，通過分子注釋發(fā)現(xiàn)OsWRKY24（Os01g0826400）參與植物與病原互作通路（詳見輔助性圖S1，http：／／www.ricesci.cn／CN／article／showSupportInfo.do？id＝2580）。

2.5 NO響應(yīng)的WRKY基因的表達(dá)聚類分析

基于NO處理過程中全基因組水平的基因表達(dá)變化的復(fù)雜性，對基因差異表達(dá)倍數(shù)取Log2后，對15個(gè)NO響應(yīng)的WRKY基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行聚類。結(jié)果表明，這些基因分為5個(gè)具有各自表達(dá)規(guī)律的類別（圖5）。類別1表示持續(xù)上調(diào)，有9個(gè)基因（OsWRKY1、OsWRKY11、OsWRKY12、Os－WRKY15、OsWRKY21、OsWRKY23、OsWRKY28、OsWRKY39和OsWRKY42）；類別2表示持續(xù)下調(diào)，有1個(gè)基因（OsWRKY17）；類別3表示先上調(diào)后下調(diào)，有1個(gè)基因（OsWRKY8）；類別4表示上調(diào)－下調(diào)－上調(diào)，有3個(gè)基因（OsWRKY113、OsWRKY69 和OsWRKY24）；類別5表示先下調(diào)后上調(diào)，有1個(gè)基因（OsWRKY3）。

表3 NO處理下水稻W(wǎng)RKY差異表達(dá)基因在各組中的分布Table 3.Group distribution of differentially expressed WRKYgenes of rice responsive to nitric oxide.

2.6 基因表達(dá)水平的qRT－PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)的可靠性，利用qRTPCR檢測了同—批材料中隨機(jī)挑選的6個(gè)WRKY基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，除個(gè)別WRKY基因的個(gè)別處理外（如OsWRKY24和OsWRKY69的T6），qRT－PCR所獲得的基因表達(dá)水平的變化與微陣列數(shù)據(jù)基本一致（圖6），反映了微陣列數(shù)據(jù)的可靠性。

3 討論

面對各種環(huán)境脅迫，植物進(jìn)化出復(fù)雜而精巧的適應(yīng)機(jī)制，涉及信號感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和相關(guān)基因表達(dá)的再編程。其中，較為普遍的策略是通過轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)下游靶蛋白的表達(dá)，進(jìn)而在生長發(fā)育與逆境適應(yīng)之間建立暫時(shí)的新的代謝平衡。因此，轉(zhuǎn)錄因子作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的終端事件——基因表達(dá)的調(diào)控者，在植物的適應(yīng)機(jī)制中扮演非常重要的角色。在高等植物中，越來越多的證據(jù)表明，WRKY參與了各種脅迫反應(yīng)、發(fā)育和代謝等生理過程［3－5］，而WRKY對植物某些生理過程的調(diào)節(jié)作用往往與SA、JA、ABA和生長素介導(dǎo)的信號途徑相互聯(lián)系在一起。全基因組表達(dá)譜分析證實(shí)了上述觀點(diǎn)。例如，Dong等［20］用Northern雜交研究了擬南芥WRKY基因家族在植物抗病反應(yīng)中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)7 2個(gè)WRKY基因中有4 3個(gè)受SA或病原細(xì)菌的誘導(dǎo)，6個(gè)受抑制。Kalde等［21］報(bào)道，第Ⅲ組的大多數(shù)成員既受SA又受病原誘導(dǎo)。同樣，在水稻中，Ryu等［10］和Ramamoorthy等［11］采用RT－PCR和Northern雜交對WRKY基因的表達(dá)譜進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了一些響應(yīng)生物或非生物逆境、SA、JA和ABA等激素信號的WRKY基因。

圖4 NO響應(yīng)的水稻W(wǎng)RKY基因的GO分析Fig.4.GO analysis on the NO－responsive rice WRKYgenes.

Log2FC－Log2處理后的基因表達(dá)變化倍數(shù)。Log2FC indicates Log2transformed expression fold change.圖5 NO響應(yīng)的水稻W(wǎng)RKY基因的表達(dá)模式Fig.5.Expression patterns of the NO－responsive rice WRKYgenes.

作為一種高通量、靈敏的基因表達(dá)檢測手段，基于mRNA表達(dá)的基因芯片技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于植物在正常生長條件下的組織特異性、發(fā)育階段特異性以及在各種逆境下的基因表達(dá)譜研究；結(jié)合生物信息學(xué)方法，可以對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO、代謝通路、表達(dá)聚類、共表達(dá)（coexpression）以及啟動子順式元件分析，相對于RT－PCR、Northern雜交、cDNA－AFLP等傳統(tǒng)的基因表達(dá)分析手段具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。基因表達(dá)分析為揭示基因功能提供重要信息。基因在哪種條件下表達(dá)，預(yù)示該基因可能在該條件下發(fā)揮作用。NO作為植物體內(nèi)重要的信使分子，被證明廣泛參與植物的生長發(fā)育、代謝以及環(huán)境脅迫適應(yīng)等生理過程［12－14］。本研究用Agilent水稻芯片從全基因組角度系統(tǒng)分析了水稻W(wǎng)RKY基因家族在NO處理下的表達(dá)譜。結(jié)果表明，NO處理下水稻W(wǎng)RKY基因家族中45.1%（32／71）為差異表達(dá)基因，21.1%（15／71）為NO響應(yīng)基因。注釋的15個(gè)NO響應(yīng)的WRKY基因主要富集在生物過程中的細(xì)胞過程、代謝過程和刺激應(yīng)答，以及分子功能中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子活性和結(jié)合，這與WRKY蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子相互印證?；赾DNA微陣列分析，Palmieri等［15］發(fā)現(xiàn)，至少有4個(gè)擬南芥WRKY基因的表達(dá)受NO調(diào)控，其中3個(gè)直系同源（ortholog）基因的表達(dá)在本研究中亦受NO調(diào)控（At－WRKY15與OsWRKY119；AtWRKY40與Os－WRKY28、OsWRKY71；AtWRKY53與OsWRKY113），證明了本研究的可靠性。啟動子分析表明，在NO響應(yīng)基因的啟動子區(qū)域中有8個(gè)類別的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率比芯片中所含的28 447個(gè)對照基因至少高出15%，其中包含WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)［15］。這些發(fā)現(xiàn)提示NO信號途徑可能參與了WRKY調(diào)節(jié)的生理過程。NO處理下水稻W(wǎng)RKY的差異表達(dá)基因比例比擬南芥高，可能與植物種類和NO供體及其處理方式不同有關(guān)。在Palmieri等［15］對擬南芥響應(yīng)NO的基因表達(dá)譜研究中，使用的是氣態(tài)NO，而本實(shí)驗(yàn)采用是硝普鈉，且同時(shí)對水稻幼苗進(jìn)行了葉面噴施和灌根處理。

Log2FC－Log2處理后的基因表達(dá)變化倍數(shù)。Log2FC indicates Log2transformed expression fold change.圖6 NO響應(yīng)的水稻W(wǎng)RKY基因表達(dá)水平的qRT－PCR驗(yàn)證Fig.6.Expression verification of NO－responsive rice WRKYgenes by qRT－PCR.

我們的表達(dá)譜分析結(jié)果中也存在著在進(jìn)化樹中兩兩相聚的成員（旁系同源，paralog）基因都趨向響應(yīng)NO信號的現(xiàn)象（OsWRKY56與OsWRKY104； OsWRKY28與OsWRKY71；OsWRKY11與Os－WRKY8；OsWRKY23與OsWRKY72），這就暗示它們在功能上也可能具有相似性，為進(jìn)一步探究水稻W(wǎng)RKY基因家族成員的功能提供了便利。有趣的是，水稻W(wǎng)RKYⅡa亞組包含4個(gè)成員，其中3個(gè)（OsWRKY28、OsWRKY62和OsWRKY71）屬于差異表達(dá)基因。WRKYⅡa亞組的4個(gè)基因均受SA、JA和稻瘟病菌侵染誘導(dǎo)，OsWRKY28和Os－WRKY71屬于稻瘟病菌侵染早期誘導(dǎo)型，Os－WRKY62和OsWRKY76屬于晚期誘導(dǎo)型［22］。然而，它們在水稻抗病反應(yīng)中的作用完全不同。Os－WRKY28、WRKY62和WRKY76是水稻對稻瘟病或白葉枯病的負(fù)調(diào)因子；而OsWRKY71是水稻對白葉枯病的正調(diào)因子［22－25］。WRKYⅡd與鈣調(diào)蛋白（CaM）相互作用［26］，NO與Ca2＋信號系統(tǒng)交聯(lián)，調(diào)控植物細(xì)胞諸多生理過程［27］。將近一半（45.6%，5／11）的水稻W(wǎng)RKYⅡd亞組基因?yàn)镹O差異表達(dá)基因。因此，今后在進(jìn)一步研究水稻W(wǎng)RKYⅡa和Ⅱd亞組成員的生物學(xué)功能時(shí)，要關(guān)注NO在其中發(fā)揮的作用，及其與SA、JA和Ca等其他信號之間的交互影響。

NO為植物應(yīng)激反應(yīng)的早期信號分子［12］。水稻W(wǎng)RKY基因家族中的15個(gè)NO響應(yīng)基因的表達(dá)聚為5個(gè)不同的類別，這些聚類均在NO處理早期（1h）表現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異，其中類別1、類別3和類別4的OsWRKY1、OsWRKY8、OsWRKY11、OsWRKY12、OsWRKY15、OsWRKY21、Os－WRKY23、OsWRKY24、OsWRKY28、OsWRKY39、OsWRKY42、OsWRKY69和OsWRKY113表現(xiàn)為早期上調(diào)；類別2的OsWRKY17表現(xiàn)為早期下調(diào)。WRKY基因被NO早期誘導(dǎo)或抑制符合WRKY作為轉(zhuǎn)錄因子的分子特征。在這些NO響應(yīng)的WRKY基因中，部分基因的生物學(xué)功能得以不同程度的解析，它們主要參與抗病或?qū)Ψ巧锬婢车捻憫?yīng)。例如，OsWRKY12為Liu等［28］報(bào)道的Os－WRKY03，作為轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)節(jié)水稻對白葉枯病的抗性。OsWRKY23是植物抗病和衰老過程的調(diào)節(jié)子，超表達(dá)該基因的擬南芥植株增強(qiáng)了對丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）的抗性，同時(shí)加速了黑暗誘導(dǎo)葉片衰老進(jìn)程［29］。OsWRKY8參與抵抗?jié)B透脅迫［30］。OsWRKY42能通過抑制JA信號相關(guān)基因負(fù)調(diào)控水稻對稻瘟病菌的響應(yīng)，與OsWRKY45－2、OsWRKY13組成一個(gè)順次轉(zhuǎn)錄調(diào)控級聯(lián)，WRKY45－2轉(zhuǎn)錄激活WRKY13，WRKY13能直接抑制WRKY42［31］。最近，我們的研究表明，OsWRKY1和OsWRKY17的同源基因OsWRKY4正調(diào)控水稻對紋枯病的抗性［8］。水稻糊粉層細(xì)胞中的OsWRKY24的表達(dá)受脫落酸（ABA）誘導(dǎo)，但在赤霉素（GA）處理下穩(wěn)定表達(dá)；瞬時(shí)表達(dá)分析表明OsWRKY24能有效抑制ABA和GA信號途徑，提示它作為兩條信號通路的共同抑制子，參與調(diào)控種子萌發(fā)及其萌發(fā)后的生長過程［32］。然而，本研究對NO響應(yīng)的水稻W(wǎng)RKY基因的代謝通路分析表明，OsWRKY24參與植物與病原互作通路，提示它可能在抗病防御中起作用。另外，cDNA代表性差異分析表明，水稻根部組織中OsWRKY17受缺鐵脅迫誘導(dǎo)［33］。OsWRKY21受模擬酸雨（pH5.6）誘導(dǎo)，基因芯片雜交結(jié)合qRT－PCR驗(yàn)證的結(jié)果表明，超表達(dá)水稻植株中1個(gè)過氧化物酶基因、2個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因和4個(gè)細(xì)胞色素P450基因表達(dá)上調(diào)，提示OsWRKY21可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境以及降解有害物質(zhì)來增強(qiáng)水稻對酸雨的抗性［34］。雖然上述研究未曾探究NO信號在這些WRKY基因功能中的作用，考慮到NO在植物抗逆和發(fā)育中的廣泛功能以及NO與SA、活性氧、ABA等其他信號分子之間的交互作用，結(jié)合本研究的結(jié)果，可以推測NO信號可能參與上述WRKY基因在植物抗病、抗非生物脅迫、衰老和代謝中的調(diào)節(jié)效應(yīng)；同時(shí)提示，要進(jìn)一步深掘這些基因的功能，必須考慮NO信號的潛在作用。據(jù)我們所知，仍未有從全基因組角度對水稻W(wǎng)RKY基因家族在NO處理下的表達(dá)譜分析。有關(guān)NO響應(yīng)的水稻W(wǎng)RKY的功能有待下一步研究，它們的共表達(dá)基因及其啟動子區(qū)域順式元件的富集分析也值得期待。

在線輔助性信息：在線輔助性表S1和圖S1見中國水稻科學(xué)網(wǎng)站（http：／／www.ricesci.cn／CN／artide／showSupportInfo.do？id＝2580）。

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Expression Profiles of Rice WRKY Transcription Factor Gene Family Responsive to Exogenous Nitric Oxide Application

MENGJiao1，WANG Hai－h(huán)ua1，2，3，＊，XIANGJian－h(huán)ua1，JIANGDan1，PENGXi－xu1，3，HE Huan－h(huán)uan1
（1School of Life Science，Hunan University of Science and Technology，Xiangtan 411201，China；2 Key Laboratory of Ecological Remediation and Safe Utilization of Heavy Metal－polluted Soils，College of Hunan Province，Xiangtan 411201，China；3 Key Laboratory of Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops in Hunan Province，Xiangtan 411201，China；＊Corresponding author，E－mail：hhwang＠hnust.edu.cn）

MENG Jiao，WANG Haihua，XIANG Jianhua，et al.Expression profiles of rice WRKY transcription factor gene family responsive to exogenous nitric oxide application.Chin J Rice Sci，2016，30（2）：111－120.

Abstract：Signal molecule nitric oxide（NO）and WRKY transcription factors are involved in many physiological processes，such as defense against stresses，development and metabolism in plants.In the present study，we investigated the expression patterns of WRKY transcription factor gene family in rice seedlings at 1，6and 12after exogenous NO treatments using Agilent rice cDNA oligo microarray.Totally，32differently expressed WRKYgenes，whose expression levels increased or decreased by at least two－fold at one time point compared with the control（T0），were identified.These WRKYgenes were mainly distributed over GroupsⅠandⅡ，among which 75%ofⅡa and 45.6%ofⅡd subgroup members were differently expressed upon the NO treatments.Moreover，15identified NO－responsive WRKYgenes，whose expression level changed by more than two－fold at least two time points among the three time points compared with the control，exhibited an earlier（1h）response to the NO treatments，and most of them（64.2%）were continually up－regulated.Prediction of gene function revealed that the NO－responsive WRKY genes were mainly involved in cellular process，metabolic process and response to stimulus of biological process，and transcription regulator activity and binding of molecular function.The analysis of metabolic pathways showed that WRKY24was involved in plant－pathogen interaction pathway.The results of microarray hybridization were largely consistent with those of quantitative real－time PCR，verifying the validity of microarray hybridization.These findings suggest that NO signaling might be involved in the regulatory functions of WRKY transcription factors，and provide a basis for further functional research for these differentially expressed WRKYgenes.

Key words：rice（Oryza sativa）；WRKY transcription factor；nitric oxide；gene expression profile

中圖分類號：Q755；S511.01

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001－7216（2016）02－0111－10

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31171803，31301617）；湖南省教育廳一般資助項(xiàng)目（14C0453）；湖南科技大學(xué)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（S140031）。

收稿日期：2015－09－16；修改稿收到日期：2015－11－30。