硼酸、肉桂油及亞磷酸鉀對采后病原菌Fusarium oxysporum生長發(fā)育的影響

周佳一， 劉雅紅， 王婭妮， 戚琴芹， 汪 瑩， 賴童飛， 周 婷

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)研究杭州市重點實驗室，浙江 杭州 310036)

硼酸、肉桂油及亞磷酸鉀對采后病原菌Fusariumoxysporum生長發(fā)育的影響

周佳一， 劉雅紅， 王婭妮， 戚琴芹， 汪 瑩， 賴童飛， 周 婷

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)研究杭州市重點實驗室，浙江 杭州 310036)

為尋找針對果蔬鐮刀菌枯萎病主要致病菌Fusariumoxysporum的有效防治方法，從腐爛的番茄(Solanumlycopersicum)中分離主要致病菌之一，經(jīng)核糖體RNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)鑒定后，利用硼酸、肉桂油、亞磷酸鉀處理病菌，確定最低抑菌濃度，并通過生理、生化指標以及果實接種實驗，研究3種抑菌物質(zhì)與病原菌發(fā)育及致病力的關(guān)系.結(jié)果表明：分離的病原菌為F.oxysporum；3種物質(zhì)的抑菌效果均與濃度成正比；在最低抑菌濃度下，可以顯著抑制F.oxysporum的孢子萌發(fā)，延緩芽管伸長及菌絲擴展速度，降低病原菌生物量積累，引起病原菌糖吸收障礙，并對F.oxysporum引起的番茄腐爛有明顯的防治作用，其中肉桂油的防治效果尤為突出.

尖孢鐮刀菌；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)；抑菌物質(zhì)；貯藏保鮮

0 引 言

近年來，一些能夠用于果蔬采后病害防治的無毒或低毒的無機化學(xué)物質(zhì)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，并展現(xiàn)出一定的應(yīng)用前景.例如硼酸(Boric acid)能抑制灰霉菌(Botrytiscinerea)誘發(fā)的葡萄灰霉病[4]、鏈核盤菌(Monilinialaxa)誘發(fā)的桃褐腐病[5]、膠胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)誘發(fā)的芒果炭疽病[6]，促進生防菌羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)對紅棗果實中青霉的抑制效果[7]；肉桂油(Cinnamon oil)對黃曲霉(Aspergillusflavus)、擴展青霉(Penicilliumexpansum)、黑根霉(Rhizopusnigricans)、串珠鐮刀菌(Fusariumverticillioides)有很好的抑制效果[8-12]；亞磷酸鹽(Phosphite)能夠有效防治樟疫霉(Phytophthoracinnamomi)引起的山龍眼根腐病[13]、惡疫霉(Phytophthoracactorum)引起的草莓革狀腐病[14]、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)引起的馬鈴薯根腐病[15]以及P.expansum引起的蘋果青霉病[16]，提高馬鈴薯對致病疫霉(Phytophthorainfestans)的抗性[17].

因此，本研究從腐爛的番茄中分離致病菌F.oxysporum，利用rDNA-ITS法確定其遺傳背景，并通過相關(guān)生理、生化指標測定以及果實接種實驗，評估了硼酸、肉桂油、亞磷酸鉀3種抑菌物質(zhì)對F.oxysporum發(fā)育及致病力的影響，實驗結(jié)果將為果蔬采后病原菌的防治提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株及主要試劑

實驗所用病原菌F.oxysporum分離自自然發(fā)病的番茄(Solanumlycopersicum).硼酸、肉桂油、亞磷酸、氫氧化鉀購自美國Sigma公司，PCR所需試劑購自日本TAKARA公司，其他主要試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNeasy Plant Mini Kit(Cat. No. 69106)及Gel Extraction Kit(Cat. No. 28706)購自德國Qiagen公司，番茄果實購自當?shù)厥袌?

1.2 病原菌的分離及rDNA-ITS法鑒定

利用75%的無水乙醇對發(fā)病番茄果實進行消毒，風(fēng)干后在病斑邊緣去除果皮，切取面積為0.1 cm2左右的果肉置于PDA(Potato Dextrose Agar)培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)72 h后，在菌落邊緣分離菌種，轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)，觀察、拍照.用含有0.05% Tween-20的無菌水收集孢子，培養(yǎng)12 h后收集菌絲，使用DNeasy Plant Mini Kit提取病原菌基因組.利用真菌ITS通用引物(ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)進行PCR擴增.利用Gel Extraction Kit回收擴增產(chǎn)物后送往上海桑尼生物科技有限公司測序，結(jié)果在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.cgi中進行同源性分析.

1.3 抑菌物質(zhì)最低抑菌濃度的篩選及對F.oxysporum芽管伸長的影響

老陳的酒量不可小覷，我喝得暈頭轉(zhuǎn)向，他還在那里談笑風(fēng)生。見我軟成一灘泥，老陳把我背上了四樓。他那身板，不愧是當過偵察兵的，一把年紀了還那么硬朗。把我擱床上后，老陳問我，喝水嗎？我說，不喝。老陳說，你要喝水的話，就告訴我一聲。我說，陳師傅，你回去吧，我沒事的。老陳說，不行，你喝多了，身邊沒個人怎么行。我走了，不放心的。我醉得不行，不一會就打著呼嚕睡著了。我不記得夜里醒過沒有，喝過水沒。第二天早晨，我醒來，卻見老陳正躺在沙發(fā)上打瞌睡。

收集培養(yǎng)兩周的F.oxysporum孢子，加入到含有100 mL PDB(Potato Dextrose Broth)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，調(diào)節(jié)孢子終濃度為1.0×106spores/mL，分別加入硼酸(最終質(zhì)量濃度為0、2、4、6 g/L)、肉桂油(最終質(zhì)量分數(shù)為0、0.01%、0.02%、0.03%)、亞磷酸鉀(終濃度為0、10、15、20 mmol/L)，其中亞磷酸鉀由KOH與H3PO3配制，終溶液中K2O:P2O5的摩爾比為28:26[18].在25 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別在3、4、5、6、7 h后用光學(xué)顯微鏡統(tǒng)計孢子萌發(fā)率，確定3種物質(zhì)的最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)，本文指相同培養(yǎng)時間內(nèi)，空白組孢子萌發(fā)率≥85%時，處理組孢子萌發(fā)率≤10%時的抑菌物質(zhì)濃度.并分別在培養(yǎng)6、7、8、9、10 h后，測量F.oxysporum芽管的長度.每種處理隨機統(tǒng)計300個孢子的萌發(fā)率及芽管長度，重復(fù)3次，整個實驗重復(fù)兩次.

1.4 抑菌物質(zhì)對F.oxysporum菌絲生物量積累及總糖吸收率的影響

將培養(yǎng)2周的F.oxysporum孢子懸浮液等量加入到含有100 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，調(diào)節(jié)孢子終濃度為1.0×106spores/mL.培養(yǎng)基中分別含有硼酸(4 g/L)、肉桂油(0.02%)、亞磷酸鉀(15 mmol/L)，空白PDB作為對照.25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，分別收集上清液和沉淀.沉淀在65 ℃烘箱中烘干至恒重(約2 h)后稱重.上清液利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)對培養(yǎng)基總糖含量進行定量分析[19].簡述如下：取5 mL待測樣品，加入4 mL 6 mol/L HCl溶液，沸水浴中水解0.5 h，冷卻后定容至50 mL，然后用6 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0后用濾紙過濾，濾液用蒸餾水定容至100 mL.取出1 mL濾液，加入1 mL DNS試劑混勻后，在沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加入蒸餾水8 mL，利用分光光度計(UV-160，Shimadzu)測定A540光吸收值，通過葡萄糖標準曲線的對比，獲得樣品中可溶性糖濃度C.總糖吸收率=(C培養(yǎng)前-C培養(yǎng)后)/C培養(yǎng)前×100%，每種處理重復(fù)3次.

1.5 抑菌物質(zhì)對F.oxysporum菌落擴展的影響

將100 μL 1.0×106spores/mL的F.oxysporum孢子懸浮液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，用打孔器獲取直徑為0.5 cm的菌餅，放置在含15 mL PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中央，培養(yǎng)基中分別含有硼酸(4 g/L)、肉桂油(0.02%)、亞磷酸鉀(15 mmol/L)，空白PDA作為對照.25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d后測量菌落直徑(每種處理6次重復(fù)).

1.6 抑菌物質(zhì)對F.oxysporum侵染番茄果實的影響

在含有硼酸(4 g/L)、肉桂油(0.02%)、亞磷酸鉀(15 mmol/L)以及空白的PDB中加入F.oxysporum孢子，終濃度為1.0×106spores/mL.25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h后，收集孢子，無菌水漂洗兩次后稀釋至1×104spores/mL備用.接種果實為當?shù)厥袌鲑徺I的番茄，成熟度基本一致、無明顯機械損傷.在2%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min后清水漂洗，自然風(fēng)干.每個處理取30個果實，用滅過菌的接種針在果實中部刺0.3 mm深的傷口，接種10 μL上述制備的病原菌孢子懸浮液，果實保存在95%相對濕度、25 ℃環(huán)境中，分別在2、4、6、8、10 d測量病斑直徑，統(tǒng)計最終發(fā)病率.

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗中數(shù)據(jù)為3個或3個以上樣本平均值，利用SPSS 11.5軟件進行分析.比較兩個以上數(shù)據(jù)時，采用單因素方差分析，且先對平均數(shù)進行Levene’s等方差性分析.若這些數(shù)據(jù)等方差，則用Duncan’s檢驗進行多重比較；若這些數(shù)據(jù)不滿足等方差，則用Dunnett’s T3檢驗進行多重比較.P<0.05時為差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合遺傳背景分析確定分離的病原菌為F.oxysporum

真核生物基因組中5.8 S、18 S、28 S rDNA基因組成一個轉(zhuǎn)錄單元，三者高度保守，其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)( Internal transcribed spacer, ITS).該間隔區(qū)進化相對迅速且具多態(tài)性，能夠快速、準確地反映生物親緣關(guān)系與分類情況[20].本研究從番茄上分離的病原菌經(jīng)回接實驗表明F.oxysporum為主要致病真菌(圖 1A)，致病性強，針刺接種后發(fā)病率達到100%.利用ITS4和ITS5通用引物擴增病原菌rDNA-ITS區(qū)域序列，獲得550 bp左右的PCR產(chǎn)物(圖 1D左)，回收測序(圖 1D右)后進行Megablast同源性分析.結(jié)果表明，分離菌株與F.oxysporum品系HWG2(1)、YTG3(1)、DTJ1(1)、PSU-ES157、PSU-ES115的相關(guān)序列匹配率均達到了100%.同時，在PDA平板上，菌落呈突起絮狀，隨著培養(yǎng)時間的增加，逐漸由白色轉(zhuǎn)為粉色，最后變?yōu)榘导t色(圖 1B)；顯微鏡下，小型分生孢子無色，單胞，卵形，而大型分生孢子多胞，鐮刀型，略有彎曲，兩端稍尖，與鐮刀菌屬的形態(tài)特征一致(圖 1C)，因此確定所分離的病原菌為F.oxysporum.

A：F. oxysporum侵染番茄果實癥狀；B：F. oxysporum菌落形態(tài)；C：F. oxysporum菌絲形態(tài)；D：ITS通用引物擴增產(chǎn)物(左)及測序結(jié)果(右).圖1 Fusarium oxysporum的形態(tài)特征及rDNA-ITS分子特征Fig. 1 The phenotype and rDNA-ITS molecular character of Fusarium oxysporum

2.2 通過孢子萌發(fā)率確定外源抑菌物質(zhì)最低抑菌濃度

利用不同濃度的硼酸、肉桂油以及亞磷酸鉀處理F.oxysporum孢子，結(jié)果表明3種物質(zhì)的抑菌效果與濃度正向相關(guān)，低濃度時幾種物質(zhì)對孢子的萌發(fā)影響較小，當硼酸、肉桂油以及亞磷酸鉀濃度達到2 g/L、0.01%和10 mmol/L時，已經(jīng)表現(xiàn)出對F.oxysporum孢子發(fā)育的抑制作用，孢子萌發(fā)率明顯下降；隨著濃度的逐漸增加，抑菌效果進一步加強，當硼酸、肉桂油以及亞磷酸鉀濃度達到4 g/L、0.02%和15 mmol/L時，對照孢子培養(yǎng)7 h后，萌發(fā)率已超過85%，而處理孢子的萌發(fā)率均低于10%，因此，將4 g/L、0.02%和15 mmol/L確定為硼酸、肉桂油和亞磷酸鉀對F.oxysporum的最低抑菌濃度(表 1).

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差，不同的小寫字母代表顯著性差異P<0.05.

2.3 外源抑菌物質(zhì)抑制F.oxysporum芽管伸長及菌落擴展

通過顯微鏡觀察，外源抑菌物質(zhì)處理的F.oxysporum孢子，體積顯著低于對照.但隨著培養(yǎng)時間的延長，部分孢子還會繼續(xù)完成膨大以及芽管伸長的過程.培養(yǎng)6 h后，硼酸及亞磷酸鉀處理的孢子芽管長度與對照組差異不顯著，肉桂油處理的孢子芽管長度最短；培養(yǎng)8 h后，各處理組孢子的芽管長度均顯著低于對照組；培養(yǎng)10 h后，硼酸、肉桂油以及亞磷酸鉀處理的孢子芽管長度之間無明顯差異，且均不足對照的30%.結(jié)果表明，3種抑菌物質(zhì)處理后，F(xiàn).oxysporum芽管伸長速度顯著低于對照，肉桂油抑制效果相對好于硼酸和亞磷酸鉀(表 2).

表2 不同抑菌物質(zhì)對F. oxysporum芽管伸長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差，不同的小寫字母代表顯著性差異P﹤0.05，MIC代表最低抑菌濃度.

與對照相比，F(xiàn).oxysporum在含有外源抑菌物質(zhì)的PDA培養(yǎng)基上生長緩慢.培養(yǎng)2 d后，菌落在含亞磷酸鉀的PDA上直徑已顯著小于對照，而在含有硼酸和肉桂油的PDA上，尚無明顯的菌落形成；隨著培養(yǎng)時間的增加，在含有不同抑菌物質(zhì)PDA上的菌落差異逐漸增加，培養(yǎng)6 d后，在含有硼酸、肉桂油以及亞磷酸鉀的PDA培養(yǎng)基上，菌落直徑均值分別約為對照的28%、17%以及44%.肉桂油的抑制效果最好，亞磷酸鉀的抑制效果相對較低(表 3).

表3 不同抑菌物質(zhì)對F. oxysporum菌落擴展的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差，不同的小寫字母代表顯著性差異P<0.05，MIC代表最低抑菌濃度.

2.4 外源抑菌物質(zhì)抑制F.oxysporum菌絲生物量積累并引起F.oxysporum糖吸收下降

菌絲生物量的積累是病原菌的生長速度及狀態(tài)的重要指標，而作為異養(yǎng)微生物碳源的主要來源，培養(yǎng)基中的總糖變化反映著病原菌能量及物質(zhì)代謝的狀況.在含有外源抑菌物質(zhì)的PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后，菌絲生物量與對照相比明顯減少，培養(yǎng)84 h后，硼酸及亞磷酸鉀的抑制效果基本相同，肉桂油處理后的菌絲生物量最少，僅為對照的13%(圖 2A).總糖吸收率檢測結(jié)果與生物量積累趨勢基本一致，外源抑菌物質(zhì)處理后，均表現(xiàn)出明顯的下降，其中硼酸和肉桂油對F.oxysporum的糖吸收影響較大(圖 2B).

圖2 不同抑菌物質(zhì)對F. oxysporum菌絲量及總糖吸收的影響Fig. 2 Effects of antifungal substances with minimal inhibitory concentration on mycelia production andabsorption of total carbohydrate

2.5 外源抑菌物質(zhì)對F.oxysporum引起的番茄腐爛具有明顯的防治效果

硼酸、肉桂油及亞磷酸鉀對F.oxysporum誘發(fā)的番茄腐爛都有一定的防治效果.接種3 d后，對照果實的發(fā)病率即達到了100%，而外源物質(zhì)處理后的接種果實的最終發(fā)病率減少了16%～28%.同時，硼酸和肉桂油對接種果實的病斑直徑也有明顯的抑制作用，接種10 d后，病斑直徑分別為對照的42%和55%(表 4).

表4 不同抑菌物質(zhì)對侵染果實的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差，不同的小寫字母代表顯著性差異P﹤0.05，MIC代表最低抑菌濃度.

3 討 論

硼酸曾被美國國家環(huán)境保護局(U.S. Environmental Protection Agency)當作控制蟑螂、白蟻、跳蚤和其他害蟲的殺蟲劑，目前已經(jīng)有多篇硼酸應(yīng)用于果實采后病害防治的報道，其抑菌機理可能是通過引起病原菌細胞內(nèi)活性氧代謝紊亂，破壞線粒體的功能，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化損傷，抑制病原菌細胞外水解酶的分泌[6-21].Qin等的研究表明[4]，硼酸能夠直接破壞病原菌的質(zhì)膜，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏，本研究中硼酸同樣對F.oxysporum具有出色的抑制作用，但在實際應(yīng)用中，硼酸能夠引起皮膚刺激，其生物安全性有待進一步的評估.肉桂油為樟科植物肉桂(Cinnamomumcassia)的干燥枝、葉經(jīng)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油，在食品、香精香料、醫(yī)藥等方面有廣泛應(yīng)用.植物精油的成分復(fù)雜，肉桂油的主要抑菌活性成分為肉桂醛，由于本身為天然產(chǎn)物，使用安全，用量少，具有很大的應(yīng)用前景.亞磷酸鹽已廣泛地用于疫霉菌(Phytophthora)的防治[22]，氫氧化鉀和亞磷酸反應(yīng)的中間產(chǎn)物亞磷酸二氫鉀(KH2PO3)和亞磷酸氫二鉀(K2HPO3)是多種殺菌劑及肥料的活性成分.Thao等認為亞磷酸鹽不但直接作用于病原菌，還與刺激宿主的防御反應(yīng)有關(guān)[23]，但亞磷酸鹽確切的抑菌機制尚不明確.

在此基礎(chǔ)上，本文評估了硼酸、肉桂油和亞磷酸鉀3種頗具應(yīng)用前景的抑菌物質(zhì)對F.oxysporum發(fā)育及致病力的影響.結(jié)果表明3種抑菌物質(zhì)均能有效抑制F.oxysporum孢子的萌發(fā)及芽管伸長；硼酸和肉桂油對F.oxysporum的菌落擴展及菌絲量積累的抑制效果優(yōu)于亞磷酸鉀；在番茄接種試驗中，肉桂油對F.oxysporum誘導(dǎo)的番茄腐爛的防治效果最好.研究結(jié)果為F.oxysporum的綜合防治拓展了思路.未來將著眼于3種抑菌物質(zhì)對F.oxysporum具體抑菌機制研究及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，兩種或多種抑菌物質(zhì)的交互使用也有很大的研究空間.

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Effects of Boric Acid, Cinnamon Oil and Potassium Phosphite on the Development of Postharvest DiseaseFusariumOxysporum

ZHOU Jiayi, LIU Yahong, WANG Yani, QI Qinqin, WANG Ying, LAI Tongfei, ZHOU Ting

(Hangzhou Key Laboratory for Safety of Agricultural Products, College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University,Hangzhou 310036, China)

Fusariumoxysporumis a kind of fungal pathogen that causesFusariumwilt, so that searching effective control methods has the vital practical significance. In this study, one of main pathogens from naturally infected tomato (Solanumlycopersicum) is isolated and identified by internal transcribed spacer sequences of ribosomal DNA (rDNA-ITS). Then minimum inhibitory concentrations (MICs) of boric acid, cinnamon oil and potassium phosphiteare confirmed. The relationship between three exogenous antifungal substances and fungal growth or pathogenicity is evaluated via the assessment of physiological, biochemical indexes and inoculation experiment of fruits. The results indicate that the isolated pathogen isFusariumoxysporum. The antibacterial effect of the 3 substances is proportional to the concentration.Under the minimum concentration,the spore germination can be inhibited, germ tube elongation and mycelium extension rate can be reduced, biomass accumulation can be decreased, sugar malabsorption ofF.oxysporumwill be caused, and the fruit rot of tomato caused byF.oxysporumcan be controlled, especially in the control of cinnamon oil.

Fusariumoxysporum; internal transcribed spacer; antifungal substance; preservation

2015-07-02

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動暨新苗人才計劃項目(2014R421028)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410346016)；杭州市農(nóng)業(yè)科研攻關(guān)項目(20140432B02)；杭州師范大學(xué)本科生創(chuàng)新能力提升工程項目(CX2015098).

周 婷(1983—)，女，講師，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工技術(shù)研究. E-mail: zt20100061@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2016.02.007

S436.412

A

1674-232X(2016)02-0149-07