新型膽堿衍生物的合成及其體外抗瘧活性

王 芳, 趙 青, 程慧芳, 張淑秋

(山西醫(yī)科大學 藥學院，山西 太原 030001)

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新型膽堿衍生物的合成及其體外抗瘧活性

王 芳, 趙 青, 程慧芳, 張淑秋*

(山西醫(yī)科大學 藥學院，山西 太原 030001)

以N,N-二甲基乙醇胺和N,N-二乙基乙醇胺為初始原料，分別與不同碳鏈長度的溴代烷烴回流反應合成了6個新型的季銨鹽型膽堿衍生物(3a～3f)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV-Vis，1H NMR和HR-MS表征。初步抗瘧活性測試結(jié)果表明：3a～3f對惡性瘧原蟲3D7的增殖均有一定的體外抑制活性，(1-羥基)二乙基正丁基溴化銨(3f)的活性最強[IC50(68.1±6.5) nmol·L-1]，但低于青蒿素[IC50(5.7±1.54) nmol·L-1]。

乙醇胺； 溴代烷； 季銨鹽； 膽堿衍生物； 體外抗瘧活性

瘧疾作為全球最突出的公共衛(wèi)生問題一直備受關注，而抗瘧藥物耐藥性的出現(xiàn)則是近年來亟待解決的重要問題，研究新型抗瘧藥物具有重要的臨床意義[1-2]。

研究[3]發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲侵染宿主紅細胞之后，為實現(xiàn)其快速生長繁殖所需的營養(yǎng)需要，會在感染紅細胞膜上產(chǎn)生特異性代謝途徑，誘導其表面產(chǎn)生紅細胞膽堿轉(zhuǎn)運體(erythrocyte choline carriers, ECCs)[4-6]，以主動識別和攝取宿主血清中的膽堿(主要是磷脂酰膽堿)，作為合成細胞膜磷脂的原料。正常哺乳動物成熟紅細胞很少或幾乎沒有磷脂合成能力，因此，若以感染紅細胞內(nèi)磷脂代謝作為抗瘧藥的靶點，可望實現(xiàn)對紅內(nèi)期瘧原蟲的靶向性，而避免對正常紅細胞的毒性。

Peyrottes等[7]報道一些膽堿衍生物可通過ECCs特異性地蓄積于瘧原蟲感染紅細胞內(nèi)，阻斷磷脂酰膽堿的合成，表現(xiàn)出顯著的抗瘧活性。Marie等[8]報道一些膽堿衍生物對于惡性瘧原蟲的增殖有抑制作用，且其中季銨鹽型膽堿衍生物的抗瘧活性明顯高于伯、仲、叔胺類膽堿衍生物。

本文以N,N-二甲基乙醇胺(1a)和N,N-二乙基乙醇胺(1d)為初始原料，分別與不同碳鏈長度的溴代烷烴(2a～2c)回流反應合成了6個新型的季銨鹽型膽堿衍生物(3a～3f， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV-Vis，1H NMR和HR-MS表征。并以青蒿素為陽性對照考察了其對惡性瘧原蟲3D7生長繁殖的抑制作用。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance 600型超導核磁共振儀(氘代氯仿為溶劑，TMS為內(nèi)標)；LTQ Orbitrap型高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀；Thermo Scientific 311型CO2培養(yǎng)箱；Variskan Flash型全波長多功能酶標儀。

N,N-二甲基乙醇胺，N,N-二乙基乙醇胺，溴乙烷，溴丙烷和溴丁烷，阿拉丁試劑有限公司；丙酮、無水乙醇、甲醛和氫氧化鈉，天津北辰方正試劑廠；十六烷基三甲基溴化銨、四苯硼鈉和達旦黃，國藥化學試劑有限公司；青蒿素，重慶華方武陵山制藥有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、次黃嘌呤、山梨醇和皂苷(Saponin)，美國Sigma 公司；富脂牛血清白蛋白(Albumax Ⅱ)和RPMI 1640，美國Gibco公司；SYBR GreenⅠ和二甲基亞砜(DMSO)，北京Biotiopped 公司；人O型紅細胞和AB型血漿，山西省太原市紅十字血液中心；惡性瘧原蟲3D7株，昆明醫(yī)科大學楊照青教授惠贈。

1.2 3a～3f的合成通法

在反應瓶中依次加入取1 0.1 mol和無水乙醇100 mL，攪拌使其溶解；逐滴加入2 0.12 mol，加畢，于室溫反應30 min；回流反應24 h。趁熱抽濾，濾液旋蒸除溶得無色稠狀液體，加丙酮35 mL溶解，冷卻至室溫，于-20 ℃靜置2 h，抽濾得白色針狀晶體，重復上述操作3次得白色固體3a～3f，產(chǎn)率70%～80%。

(1-羥基)二甲基乙基溴化銨(3a)： 白色針狀固體，純度91.0 %；1H NMRδ： 1.47(t,J=6.8 Hz, 3H, CH3), 3.37(s, 6H, NCH3), 3.68～3.76(m, 4H, CH2N), 4.02(s, 2H, OCH2); HR-MSm/z： Calcd for C6H16NOBr{[M-Br]+}118.122 6, found 118.122 4。

(1-羥基)二甲基正丙基溴化銨(3b)： 白色針狀固體，純度84.3%；1H NMRδ： 1.06(t,J=7.3 Hz, 3H, CH3), 1.82～1.86(m, 2H, CH2), 3.38(s, 6H, NCH3), 3.52～3.54(m, 2H, NCH2), 3.74～3.78(m, 2H, CH2N), 4.16(s， 2H， OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C7H18NOBr{[M-Br]+} 132.138 3, found 132.137 8。

(1-羥基)二甲基正丁基溴化銨(3c)： 白色針狀固體，純度98.7%；1H NMRδ： 1.01(t,J=7.3 Hz, 3H, CH3), 1.41～1.48(m, 2H, CH2), 1.74～1.80(m, 2H, CH2), 3.39(s, 6H, NCH3), 3.58～3.62(m, 2H, NCH2), 3.76(m, 2H, CH2N), 4.14(s, 2H, OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C8H20NOBr{[M-Br]+} 146.153 9, found 146.153 7。

(1-羥基)三乙基溴化銨(3d)： 白色針狀固體，純度93.4 %；1H NMRδ： 1.39(t,J=6.8 Hz, 9H, CH3), 3.52～3.60(m, 8H, NCH2), 4.15(s, 2H, OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C8H20NOBr{[M-Br]+} 146.153 9; found 146.153 7。

(1-羥基)二乙基正丙基溴化銨(3e)： 白色針狀固體，純度92.9%；1H NMRδ： 1.05(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3), 1.39(t, 6H, NCCH3), 1.74～1.82(m, 2H, CH2), 3.32～3.37(m, 2H, NCH2), 3.54～3.60(m, 6H, NCH2), 4.10(s, 2H, OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C9H22NOBr{[M-Br]+} 160.169 6, found 160.179 5。

(1-羥基)二乙基正丁基溴化銨(3f)： 白色針狀固體，純度81.6%；1H NMRδ： 1.02(t,J=7.0 Hz, 3H, CH3), 1.40(s, 6H, NCCH3), 1.42～1.48(m, 2H, CH2), 1.71(s, 2H, CH2), 3.35～3.40(m, 2H, NCH2), 3.57(s, 6H, NCH2), 4.11(s, 2H, OCH2)； HR-MSm/z： Calcd for C10H24NOBr{[M-Br]+} 174.185 2, found 174.185 0。

1.3 純度測定

采用四苯硼鈉返滴定法[9]對3a～3f的純度進行測定。稱取0.1 g待測化合物置于100 mL錐形瓶中，用100 mL去離子水溶解；依次加入0.1 mol·L-1四苯硼鈉標準溶液3 mL，甲醛5 mL，質(zhì)量分數(shù)為20%的NaOH溶液200 μL和質(zhì)量分數(shù)為0.1%的達旦黃指示劑200 μL，搖勻，用0.5 mmol·L-1十六烷基三甲基溴化銨溶液滴定至終點(溶液由淡黃色變?yōu)榈凵?，計算各季銨鹽型膽堿衍生物純度。

1.4 3a～3f對惡性瘧原蟲3D7的抑制試驗

將3a～3f分別用DMSO溶解并制成10倍濃度梯度(1～105μmol·L-1)藥液，采用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋1 000倍(1～105nmol·L-1)。采取100%壓積的新鮮紅細胞(RBC)對惡性瘧原蟲3D7培養(yǎng)標本進行稀釋，控制瘧原蟲感染率為0.3%～0.5%，并用RPMI 1640培養(yǎng)基將感染了惡性瘧原蟲的紅細胞壓積調(diào)至2%。 96孔測定板每孔加入20 μL含藥培養(yǎng)液和80 μL惡性瘧原蟲3D7培養(yǎng)物，分別設置陰性對照組(20 μL含0.1% DMSO的培養(yǎng)基和80 μL 壓積為2%且瘧原蟲感染率為0.3%～0.5%的紅細胞)和陽性對照組(20 μL相應濃度梯度的ART DMSO溶液和80 μL壓積為2%且瘧原蟲感染率為0.3%～0.5%的紅細胞)，每種膽堿衍生物設6個濃度，每個濃度設3個復孔，每組試驗進行3次。用SYBR GreenⅠ微量熒光法[10-11]測定3a～3f對瘧原蟲增殖的抑制作用，并計算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成與表征

在3a～3f的合成中，與溴代正丁烷不同，溴乙烷和溴代正丙烷均為對溫度和光線極為敏感的小分子烷烴，易揮發(fā)，故以這兩種溴代烷烴為原料合成膽堿衍生物時，溴乙烷室溫避光，溴代正丙烷于60 ℃避光，且反應時間應適當延長(約48 h)。

3a～3f屬于離子型的化合物，與初始原料叔胺相比，水溶性增大，故選擇丙酮作溶劑進行重結(jié)晶，以除去未反應完全的叔胺。旋蒸除去溶劑得黏稠狀液體，溶解于35 mL丙酮中，適當加熱使其完全溶解，攪拌均勻，冷卻至室溫，于-20 ℃靜置2 h得目標化合物的白色針狀晶體。

考慮到長鏈烷烴的空間位阻效應可能導致膽堿衍生物不能很好的被DCC識別，故本試驗合成6種短鏈小分子季銨鹽型膽堿衍生物3a～3f，它們均具有良好的溶解性，易溶于乙醇和水等溶劑。該反應條件溫和，操作簡單，環(huán)境污染小，且各膽堿衍生物產(chǎn)率均大于70%，純度大于80%。

UV-Vis測定結(jié)果表明:3a～3f的最大吸收波長從408 nm紅移至485 nm，證明了3a～3f中季銨離子的存在。

3a～3f的HR-MS分析結(jié)果顯示其精確質(zhì)量分數(shù)[M-Br]+(m/z)實測值與理論值誤差值均小于5×10-6，且不飽和度、元素組成等均與其結(jié)構(gòu)式相符，說明3a～3f為Scheme 1預期產(chǎn)物。

2.2 體外抗瘧活性

3a～3f對瘧原蟲增殖的IC50分別為5.74±1.54, 732±45.9, 529±38.1, 385±27.3, 369±29.6, 318±21和68.1±6.5 nmol·L-1。采用兩獨立樣本T檢驗將3a～3f的IC50與對照組進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3a～3f的IC50與陽性對照組相比均不同程度的升高(P<0.05)。不同濃度的短鏈烷烴取代膽堿衍生物作用72 h后對惡性瘧原蟲3D7的抑制作用與陰性對照組相比均升高(P<0.05)。各濃度的短鏈烷烴取代膽堿衍生物對3D7的抑制作用均隨濃度的增加而增強，表現(xiàn)出不同程度的劑量依賴性。3a～3f對3D7增殖的平均抑制率變化趨勢見圖1。

濃度/nmol·L-1

研究結(jié)果表明：3a～3f對惡性瘧原蟲3D4的增殖均具有不同程度的抑制作用，且對瘧原蟲增殖的抑制率隨劑量的增高而不同程度地增強。比較IC50發(fā)現(xiàn)，3d～3f對惡性瘧原蟲3D7增殖的抑制作用較強，這可能是由于N+上取代基為乙基時，更容易被惡性瘧原蟲感染紅細胞上ECCs識別而攝取。在一定范圍內(nèi)，隨著R3碳鏈長度增加，目標化合物對惡性瘧原蟲3D7增殖的抑制作用逐漸增強，可能是由于碳鏈加長，化合物脂溶性增加，與瘧原蟲感染的紅細胞細胞膜的作用增強。因此，該研究結(jié)果為季銨鹽型膽堿衍生物抗瘧活性構(gòu)效關系的深入研究以及通過結(jié)構(gòu)改造合成具有更高抗瘧活性的季銨鹽型膽堿衍生物提供了一定的試驗基礎。

3 結(jié)論

以N,N-二甲基乙醇胺和N,N-二乙基乙醇胺為初始原料合成了6種新型季銨鹽型膽堿衍生物(3a～3f)。初步抗瘧活性考察結(jié)果表明：3a～3f對惡性瘧原蟲3D7的增殖均具有一定的抑制作用，其中(1-羥基)二乙基正丁基溴化銨(3f)的抑制作用最為突出，推測其抗瘧活性可能與N+上的取代基類型有關，進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和深入研究有待進行。

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Synthesis of Novel Choline Derivatives and TheirinvitroAntimalarial Activities

WANG Fang, ZHAO Qing, CHEN Hui-fang, ZHANG Shu-qiu*

(College of Pharmacy, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China)

Six novel choline derivatives of quaternary ammonium salts(3a～3f) were synthesized by reaction ofN,N-dimethyl ethanolamine orN,N-diethyl ethanolamine with brominated alkanes of different carbon chain length under reflux condition. The structures were characterized by UV-Vis，1H NMR and HR-MS. The antimalarial activities test showed that 3a～3f demonstrated different degrees of inhibiting effect on the growth ofplasmodiumfalciparum3D7invitro, and (1-hydroxy) diethyln-butyl ammonium bromide(3f) exhibited the strongest antimalarial activity with IC50of (68.1±6.5) nmol·L-1, but lower than Artemisinin[IC50(5.7±1.54) nmol·L-1].

ethanolamine; brominated alkane; quaternary ammonium salt; choline derivative;invitroantimalarial activity

2015-12-28

國家自然科學基金資助項目(81373364)

王芳(1990-)，女，漢族，山西呂梁人，碩士研究生，主要從事新劑型與藥代動力學研究。 E-mail: 466049469@qq.com

張淑秋，博士，教授， Tel. 0351-4690955, E-mail: shuqiu.zhang@126.com

O623.73

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.04.15415