新型吲唑類化合物的合成及其抗腫瘤活性

周云鵬, 何 暢, 宋端正, 陳 燁, 劉 舉, 張秋實, 王 洋

(遼寧大學(xué) 藥學(xué)院 遼寧省新藥研發(fā)重點實驗室，遼寧 沈陽 110036)

·研究論文·

新型吲唑類化合物的合成及其抗腫瘤活性

周云鵬, 何 暢, 宋端正, 陳 燁, 劉 舉, 張秋實, 王 洋*

(遼寧大學(xué) 藥學(xué)院 遼寧省新藥研發(fā)重點實驗室，遼寧 沈陽 110036)

以2,6-二氟苯腈與嗎啉反應(yīng)制得2-氟-6-嗎啉-苯腈(1)； 1與水合肼在N-甲基吡咯烷酮中通過環(huán)合反應(yīng)制得3-氨基-4-嗎啉-1H-吲唑(2)； 2與不同羧酸經(jīng)縮合反應(yīng)合成了8個新型吲唑類化合物(4a～4h)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR， IR和HR-ESI-MS表征。抗腫瘤活性測試結(jié)果表明：3,4,5-三甲氧基-氮-(4-嗎啉-1H吲唑-3-基)苯甲酰胺(4a)的抗腫瘤活性最好,對K-562, SMMC7721和T-47D腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用，IC50分別為0.056 μmol·L-1， 0.062 μmol·L-1和0.078 μmol·L-1。

2,6-二氟苯腈； 吲唑衍生物； 合成； 抗腫瘤活性

吲唑衍生物是一類重要的雜環(huán)化合物，因其具有廣泛的生物活性，已成為藥學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[1-4]。2004年，Liou等[5]報道了具有抗腫瘤活性的考布他汀(CA-4)通過抑制微管蛋白聚集，造成腫瘤細(xì)胞的壞死。CA-4對包括很多耐藥瘤株在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞均有強大的細(xì)胞毒作用，尤其是其具有腫瘤血管生成抑制作用。2007年，Duan等[6]報道作為考布他汀類似結(jié)構(gòu)的吲唑衍生物具有明顯的抗癌活性，IC50為13 nmol·L-1(H460，人類大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株)，并明確報道了3-位取代吲唑為微管蛋白抑制劑的藥理作用；同年，Tung等[7]通過對5,6-二元稠環(huán)化合物的研究發(fā)現(xiàn)3-苯甲酰吲唑AA具有較好的活性,其對胃癌MKN45細(xì)胞的IC50為95 nmol·L-1，對口腔鱗狀細(xì)胞癌KB細(xì)胞的IC50為70 nmol·L-1，但是沒有進(jìn)行深入研究該類化合物的構(gòu)效關(guān)系。血管內(nèi)皮因子生長抑制劑帕唑替尼[8]和阿西替尼[9]等吲唑母核類抗腫瘤藥物具有選擇性強和副作用小等優(yōu)勢而具有廣闊的應(yīng)用前景，因此，深入研究吲唑衍生物使其具有高選擇性、低毒性的抗腫瘤活性具有十分重要的現(xiàn)實意義。

Scheme 1

本文以2,6-二氟苯腈與嗎啉反應(yīng)制得2-氟-6-嗎啉-苯腈(1)； 1與水合肼在N-甲基吡咯烷酮中通過環(huán)合反應(yīng)制得3-氨基-4-嗎啉-1H-吲唑(2)； 2與不同羧酸(3a～3h)通過縮合反應(yīng)合成8個新型吲唑類化合物(4a～4h, Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR， IR和HR-ESI-MS表征。并對其抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4A型顯微熔點儀(溫度未校正)；ARX-600型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Spectrum One型紅外光譜儀(KBr壓片)；LCQ Advantage MAX 10型離子肼質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 1的合成[10]

在反應(yīng)瓶中依次加入2,6-二氟苯腈20.0 g(144 mmol)，無水碳酸鉀40.0 g(289 mmol)和DMSO 300 mL，攪拌下于90 ℃緩慢滴加嗎啉13.2 g(152 mmol)，滴畢，反應(yīng)3 h。冷卻至室溫，倒入冰水中(析出白色晶體)，過濾，濾餅干燥得白色固體1 18.0 g，產(chǎn)率90%， m.p.69～70 ℃。

(2) 2的合成[11]

在反應(yīng)瓶中依次加入1 15.0 g(73 mmol)和無水N-甲基吡咯烷酮(NMP)15 mL，攪拌使其溶解；升溫至70 ℃，滴入98%水合肼40 mL(730 mmol)，滴畢，反應(yīng)23 h。攪拌下傾入冰水溶液(析出白色固體)，過濾，濾餅干燥得2 14.5 g，產(chǎn)率97%， m.p.207～208 ℃；1H NMR(CDCl3)δ: 7.25(m, 1H), 6.7(d,J=4.2 Hz, 1H), 6.6(d,J=3.6 Hz, 1H), 5.5(s, 2H), 3.9(m, 4H), 3.1(m, 4H)； IRν: 3 475, 3 374, 3 272, 2 950, 2 854, 2 836, 1 603, 1 526, 1 509, 1 452, 1 236, 1 108 cm-1; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C11H14N4O{[M+H]+}218.122 4, found 218.122 5。

(3) 4a～4h的合成(以4d為例)

在反應(yīng)瓶中依次加入2 0.68 g(3.58 mmol)， 3,4,5-三甲氧基苯甲酸(3d)0.99 g(4.65 mmol)， 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCI)1.03 g(5.37 mmol)， 4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.44 g(3.58 mmol)， 1-羥基苯并三唑(HOBt)0.48 g(3.58 mmol)和干燥DMF 10 mL，攪拌下于室溫反應(yīng)4 h。加水100 mL，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，濃縮至1/3，冷卻析晶得白色針狀結(jié)晶4d 1.31 g。

用類似方法合成4a～4c, 4e～4h。

4a: 產(chǎn)率89.11%；1H NMRδ: 7.93(d,J=4.2 Hz 1H, ArH), 7.46(dd,J=4.2 Hz, 1H, ArH), 6.98(d,J=3.6 Hz, 1H, ArH), 5.98(s, 2H, NH), 3.84(t,J=4.5 Hz, 4H, Morpholine-H), 3.48(m, 2H, Piperazine-H), 3.43(t,J=4.8 Hz, 2H, Piperazine-H), 3.18(t,J=6.5 Hz, 2H, Piperazine-H), 2.99(t,J=4.4 Hz, 4H, Morpholine-H), 2.71(t,J=6.9 Hz, 2H, Piperazine-H), 2.33(t,J=5.0 Hz, 2H, CH2), 2.24(t,J=4.8 Hz, 2H, CH2), 2.19(s, 3H, CH3)；13C NMRδ： 172.8, 167.2, 155.3, 148.6, 142.5, 132.7, 120.9, 108.4, 97.4, 68.7, 54.9, 50.1, 49.8, 47.2, 32.3, 30.0； IRν: 3 405, 2 947, 2 856, 1 692, 1 625, 1 593, 1 548, 1 496, 1 475 cm-1； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C20H28N6O3{[M+H]+}400.220 8, found 400.220 6。

4b: 產(chǎn)率87.68%；1H NMRδ: 7.94(d,J=3.9 Hz, 1H, ArH), 7.47(t,J=8.1 Hz, 1H, ArH), 7.27(d,J=4.4 Hz, 2H, ArH), 6.99(d,J=3.9 Hz, 1H, ArH), 6.88(d,J=4.4 Hz, 1H, ArH), 6.05(s, 2H, NH), 4.24(s, 2H, CH2), 3.84(t,J=4.7 Hz, 4H, Morpholine-H), 3.73(s, 3H, CH3O), 2.99(t,J=4.1 Hz, 4H, Morpholine-H)；13C NMRδ: 172.1, 160.5, 153.1, 144.4, 137.4, 130.6, 128.1, 126.3, 114.0, 110.8, 105.6, 94.3, 65.3, 54.9, 55.0, 44.8； IRν: 3 427, 2 959, 2 847, 2 828, 1 681, 1 606，1 548， 1 509, 1 240, 1 114 cm-1; HR-ESI-MSm/z: Calcd for C20H22N4O3{[M+H]+}366.171 0, found 366.171 3。

4c: 產(chǎn)率89.31%；1H NMR(CDCl3)δ: 8.15(d,J=3.9 Hz, 1H, ArH), 7.46(t,J=8.0 Hz, 1H, ArH), 6.93(d,J=3.6 Hz, 1H, ArH), 6.81(m, 3H, ArH), 5.00(s, 2H, NH), 3.91(t,J=4.2 Hz, 4H, Morpholine-H), 3.86(m, 6H, CH3O), 3.33(m, 2H, Morpholine-H), 3.10(m,J=2.6 Hz, 2H, Morpholine-H), 3.07(m,J=8.1 Hz, 4H, CH2)；13C NMRδ： 176.5, 154.9, 149.2, 149.0, 144.4, 138.8, 136.4, 129.4, 123.5, 113.6, 114.1, 109.2, 107.1, 94.4, 67.1, 55.9, 53.3, 36.6, 32.5； IRν: 3 453, 3 346, 2 967, 2 842, 1 688, 1 615, 1 516, 1 451, 1 268, 1 113 cm-1； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C22H26N4O4{[M+H]+}410.200 1, found 410.200 3。

4d: 產(chǎn)率92.17%；1H NMRδ: 8.09(d,J=3.9 Hz, 1H, ArH), 7.54(t,J=7.8 Hz, 1H, ArH), 7.35(s, 2H, ArH), 7.06(d,J=3.9 Hz, 1H, ArH), 6.05(s, 2H, NH), 3.84(s, 9H, CH3O), 3.75(s, 4H, Morpholine-H), 3.01(s, 4H, Morpholine-H)；13C NMRδ： 166.5, 155.5, 154.6, 141.6, 141.4, 137.4, 126.7, 125.0, 107.8, 105.6, 104.8, 94.2, 66.8, 61.2, 56.3, 54.1； IRν: 3 427, 2 950, 2 816, 1 667, 1 622, 1 585, 1 505, 1 237, 1 126, 1 114 cm-1； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C21H24N4O5{[M+H]+}412.169 4, found 412.169 5。

4e: 產(chǎn)率90.23%；1H NMR(CDCl3)δ: 8.25(d,J=4.2 Hz, 1H, ArH), 8.01(d,J=3.9 Hz, 2H, ArH), 7.51(t,J=8.0 Hz, 1H, ArH), 7.42(m, 2H, ArH), 7.00(d,J=3.8 Hz, 1H, ArH), 5.02(s, 2H, NH), 4.05(m, 4H, CH2O), 3.92(t,J=4.1 Hz, 4H, Morpholine-H), 3.26(s, 1H, CH2), 3.19(s, 1H, CH2), 3.11(t,J=4.4 Hz, 4H, Morpholine-H), 1.28(t,J=7.5 Hz, 6H, CH3)；13C NMRδ： 163.1, 153.7, 140.4, 135.4, 135.1, 130.7, 128.6, 126.5, 126.3, 106.8, 104.0, 93.8, 66.3, 61.8, 53.3, 37.7, 15.9； IRν: 3 400, 3 282, 1 650, 1 608, 1 546, 1 514, 1 263, 1 237, 1 121 cm-1； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C23H29N4O5P{[M+H]+}472.192 5, found 472.192 5。

4f: 產(chǎn)率88.65%；1H NMR(CDCl3)δ: 8.10(d,J=4.1 Hz, 2H, ArH), 7.42(t,J=8.4 Hz, 1H, ArH), 7.18(t,J=8.3 Hz, 1H, ArH), 6.96(m, 2H, ArH)， 6.31(dd,J=2.1 Hz, 8.4 Hz, 1H, ArH), 5.04(s, 2H, NH), 3.90(t,J=4.1 Hz, 4H, Morpholine-H), 3.78(s, 3H, CH3), 3.48(t,J=5.4 Hz, 2H, CH2), 3.08(m, 4H, Morpholine-H), 2.86(m, 2H, CH2)；13C NMRδ： 177.8, 171.7, 159.1, 154.7 141.8, 136.4, 131.2, 125.9, 123.6, 115.5, 109.2, 105.0, 93.8, 67.1, 54.6, 54.1, 31.3； IRν: 3 418, 3 325, 2 937, 2 837, 1 678, 1 617, 1 596, 1 540, 1 242, 1 110 cm-1； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C22H25N5O4{[M+H]+}424.192 4, found 424.192 6。

4g: 產(chǎn)率87.55%；1H NMR(CDCl3)δ: 9.11(d,J=1.4 Hz, 1H, Pyridine-H), 8.35(dd,J=2.4 Hz, 8.4 Hz, 1H, ArH), 8.25(d,J=4.1 Hz, 1H, Pyridine-H), 7.55(t,J=8.1 Hz, 1H, ArH), 7.45(d,J=4.2 Hz, 1H, ArH), 7.04(d,J=4.1 Hz, 1H, Pyridine-H), 5.08(s, 2H, NH),3.93(t,J=1.8 Hz, 4H, Morpholine-H), 3.11(t,J=4.5 Hz, 4H, Morpholine-H)；13C NMRδ: 163.6, 156.1, 151.1, 148.9, 143.8, 137.1, 137.5, 125.3, 123.8, 110.8, 106.0, 94.2, 66.7, 55.3； IRν: 3 399, 3 316, 1 661, 1 610, 1 576, 1 546, 1 457, 1 432, 1 238, 1 114 cm-1； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C17H16N5O2Cl{[M+H]+}357.103 7, found 357.103 6。

表1 4a～4h的體外抗腫瘤活性

4h: 產(chǎn)率91.15%；1H NMR(CDCl3)δ: 8.27(d,J=4.2 Hz, 1H, CH=CH), 7.87(q,J=11.4 Hz, 2H, ArH), 7.49(t,J=8.1 Hz, 1H, ArH), 7.31(m, 2H, ArH), 7.20(s,J=3.9 Hz, 1H, ArH), 6.97(d,J=3.9 Hz, 1H, CH=CH), 5.06(s, 2H, NH), 3.90(t,J=6.0 Hz, 4H, Morpholine-H), 3.87(s, 3H, CH3O), 3.17(t,J=4.5 Hz, 4H, Morpholine-H)；13C NMRδ: 166.7, 161.7, 155.1, 143.6, 143.1, 138.4, 135.0, 130.2, 126.7, 122.2, 118.2, 115.1, 1138, 109.2, 105.5, 96.0, 67.3, 57.0, 53.5； IRν: 3 394, 2 962, 2 850, 1 677, 1 624, 1 604, 1 577, 1 414, 1 257, 1 105 cm-1； HR-ESI-MSm/z: Calcd for C21H22N4O3{[M+H]+}378.172 0, found 378.172 1。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗腫瘤活性

采用MTT法, 以紫杉醇(Taxol)為陽性對照藥，K562， SMMC7721， A549和T-47D細(xì)胞為受試細(xì)胞，對4a～4h進(jìn)行抗腫瘤活性測試，結(jié)果見表1。由表1可見，4a～4h的活性順序為：4a>4e>4f>4b>4g>4h>4c>4d。 4a的抗腫瘤活性最好,對K-562, SMMC7721和T-47D腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用，IC50分別為0.056 μmol·L-1， 0.062 μmol·L-1和0.078 μmol·L-1。由表1可推知簡單構(gòu)效關(guān)系：R含極性較大基團如嗎啉基時，化合物活性增強，反之取代基極性降低時活性有所下降； R上苯環(huán)4-位磷酯基活性優(yōu)于甲氧取代基；R上苯環(huán)取代基與酰胺鍵間碳鏈縮短有助于活性提高。

2.2 溶解度與安全性實驗

由4a～4h的溶解度與安全性實驗測試得知，4a水溶性較好，其水中溶解度為5.23 mg·mL-1， 4d溶解性較差，水中溶解度為10.11 mg·L-1， 4e具有較好的安全性，其小鼠LD50為279.94 mg·kg-1， 95%的可信限為232.65～328.49 mg· kg-1。

以2,6-二氟苯腈為起始原料，合成了8個新型吲唑類化合物(4a～4h)。該合成方法工藝簡單、產(chǎn)率高且產(chǎn)物易于結(jié)晶，無需柱層析分離。體外抗腫瘤活性研究結(jié)果表明：4a～4h均有一定的抗腫瘤活性，對慢粒白血病細(xì)胞K562、肝癌細(xì)胞SMMC7721均有效，有一定廣譜抗腫瘤活性。

該研究結(jié)果對吲唑類抗腫瘤藥物研發(fā)具有一定參考價值。

[1] 黃兆琦. DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶與細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報,2002,15(6):539-541.

[2] Jakupec M A， Reisner E， Eichinger A，etal. Redox-active antineoplastic ruthenium complexes with indazole:Correlation of in vitro potency and reduction potential[J].J Med Chem,2005,48(8):2831-2837．

[3] 張菊, 朱孝峰, 劉宗潮. 酪氨酸激酶小分子抑制劑在腫瘤治療中的研究[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2003,30(3):199-201.

[4] Wong T W， Lee F Y， Yu C，etal. Preclinical antitumor activity of BMS-599626,a pan-HER Kinase inhibitor that inhibits HER1/HER2 homodimer and heterodimer signaling[J].Clin Cancer Res,2006,12(20):6186-6193．

[5] Liou J P， Chang Y L， Kuo F M，etal. Concise synthesis and structure-activity relationships of combretastatin A-4 analogues,1-aroylin doles and 3-aroylindoles,as novel classes of potent antitubulin agents[J].J Med Chem,2004,47(17):4247-4257．

[6] Duan J X， Cai X， Meng F，etal. Potent antitubulin tumor cell cytotoxins based on 3-aroyl indazoles[J].J Med Chem,2007,50(5):1001-1006．

[7] Tung Y S， Coumar M S， Wu Y S，etal. Scaffold-hopping strategy:Synthesis and biological evaluation of 5,6-fused bicyclic heteroaromatics to identify orally bioavailable anticancer agents[J].J Med Chem,2011,54(8):3076-3080.

[8] Atta-ur-Rahman， Malik S， Hasan S S，etal. Nigellidine——A new indazole alkaloid from the seeds of Nigella sativa[J].Tetrahedron Lett,1995,36(12):1993-1996．

[9] Schmidt A. Biologicallyactive mesomeric betaines and alkaloids,derived from 3-hydroxypyridine, pyridin-N-oxide,nicotinic acid and picolinic acid:Three types of conjugation and their consequences curr[J].J Org Chem,2004,8(8):653-670．

[10] Kamenecka T， Jiang R， Song X,etal. Substituted pyrimidinyl-amines as protein kinase inhibitors:US 8 530 480[P].2013.

[11] Kruger A W, Rozema M J, Chu-Kung A,etal. The Discovery and development of a safe,practical synthesis of ABT-869[J].Organic Process Research & Development,2009,13(6):1419-1425．

Synthesis and Antitumor Activities of Novel Indazole Derivatives

ZHOU Yun-peng, HE Chang, SONG Duan-zheng,CHEN Ye, LIU Ju, ZHANG Qiu-shi, WANG Yang*

(New Drug Research and Development Key Laboratory of Liaoning Province,College of Pharmacy, Liaoning Uninversity, Shenyang 110036, China)

2-Fluoro-6-morpholinobenzonitrile(1) was prepared by reaction of 2,6-difluorobenzonitrile with morpholine. 4-Morpholino-1H-indazol-3-amine(2) was synthesized by cyclization of 1 with hydrazine. 2 was coupled with various carboxylic acids to afford eight novel indazole derivatives(4a～4h). The structures were characterized by1H NMR， IR and HR-ESI-MS. The antitumor activities were investigated. The results showed that 4-(4-methylpiperazin-1-yl)-N-(4-morpholino-1H-indazol-3-yl)-4-oxobutanamide(4a) exhibited potent antitumor activities against K-562, SMMC7721 and T-47D tumor cell lines with IC50of 0.056 μmol·L-1, 0.062 μmol·L-1and 0.086 μmol·L-1, respectively.

2,6-difluorobenzonitrile; indazole derivative; synthesis; anti-tumor activity

2016-01-13

周云鵬(1974-)，男，漢族，遼寧遼陽人，實驗師，主要從事藥物和有機合成研究。 E-mail: 13390115162@163.com

王洋，副研究員， E-mail： Ldwangyang@163.com

O626; O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.04.16019