HPLC測定不同產(chǎn)地粉萆薢中原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷含量

邵巖巖 肖瀟 吳玲芳 朱丹 楊光輝 張曉雪 張?zhí)m珍

摘要：目的 采用高效液相色譜法（HPLC）測定不同產(chǎn)地粉萆薢中原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷含量。方法 采用Agilent C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長208 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果 原薯蕷皂苷在1.73～8.64 μg（r=0.999 1）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為101.98%（RSD=1.53%）；薯蕷皂苷在1.03～8.20 μg（r=0.999 6）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為101.60%（RSD=2.41%）。10個不同產(chǎn)地粉萆薢中原薯蕷皂苷含量在0.89%～2.24%之間，薯蕷皂苷含量在0.75%～3.22%之間。結(jié)論 該方法操作簡便，定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為粉萆薢藥材質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：粉萆薢；中藥產(chǎn)地；原薯蕷皂苷；薯蕷皂苷；高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）05-0104-03

Content Determination of Protodioscin and Diosgenin in Dioscoreae Hypoglaucae Rhizoma from Different Habitats by HPLC SHAO Yan-yan， XIAO Xiao， WU Ling-fang， ZHU Dan， YANG Guang-hui， ZHANG Xiao-xue， ZHANG Lan-zhen （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

Abstract： Objective To establish an HPLC method for the content determination of protodioscin and diosgenin in Dioscoreae Hypoglaucae Rhizoma from different habitats. Methods The chromatographic separation was performed on an Agilent C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm） with mobile phase of acetonitrile-water solution with gradient elution at the flow rate of 0.8 mL/min； the detection wavelength was 208 nm； the column temperature was 30 ℃； the injection volume was 20 μL. Results Protodioscin showed a good linear relationship among the range of 1.73–8.64 ?g （r=0.999 6）， with the average recovery of 101.98% （RSD=1.53%）； Diosgenin showed a good linear relationship among the range of 1.03–8.20 μg （r=0.999 1）， with the average recovery of 101.60% （RSD=2.41%）. The contents of protodioscin and diosgenin in Dioscoreae Hypoglaucae Rhizoma from 10 different habitats were in the range of 0.89%–2.24% and 0.75%–3.22%， respectively. Conclusion The method is simple， accurate and with repeatability， which can be used as quality control method of Dioscoreae Hypoglaucae Rhizoma.

Key words： Dioscoreae Hypoglaucae Rhizoma； place of production （TCD）； protodioscin； diosgenin； HPLC

粉萆薢為薯蕷科植物粉背薯蕷Dioscorea hypoglauca Palibin的干燥根莖，具有利濕祛濁、祛風(fēng)通痹功效，用于淋病白濁、白帶過多，濕熱瘡毒、腰膝疼痛及風(fēng)濕頑痹和小便不利等病癥[1]。粉萆薢主要分布于浙江臨安、淳安、龍泉，湖南滬溪、沅陵、安化及四川、安徽、江西等地。現(xiàn)代藥理研究表明，粉萆薢具有降壓、抗炎、抗菌、提高免疫、抗腫瘤、殺軟體動物等功效[2]。粉萆薢主要含有皂苷、甾體、二芳基庚烷、木脂素、有機(jī)酸及脂類等化學(xué)成分，其中甾體皂苷類化合物是其主要藥效成分。薯蕷皂苷有抗腫瘤、改善心血管、調(diào)節(jié)免疫、抗血小板聚集、抗炎、

降血糖、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松作用，原薯蕷皂苷有較好的抗腫瘤作用[4-9]，為粉萆薢的主要藥效物質(zhì)。

2015年版《中華人民共和國藥典》尚無粉萆薢的含量測定方法，目前文獻(xiàn)報(bào)道的粉萆薢含量測定有藥材中總皂苷的含量測定[3]和薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元的含量測定[10-11]。為了進(jìn)一步完善粉萆薢的質(zhì)量控制方法，本試驗(yàn)建立粉萆薢中原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷的高效相色譜（HPLC）含量測定方法，并測定和比較不同產(chǎn)地粉萆薢藥材中原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷的含量，為粉萆薢的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 1525高效液相色譜儀（美國Waters公司），Agilent C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent公司），Sartorious BT 25S電子天平（德國Sartorious公司），KQ-500 DE超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）。

原薯蕷皂苷對照品（購于南京春秋生物有限公司，批號200015，純度>98%）。薯蕷皂苷對照品，自制，經(jīng)1H NMR、13C NMR、MS鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC歸一化法檢測，純度>98%。10個產(chǎn)地藥材購于祁州香草堂、亳州中藥堂、安國中藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系張貴君老師鑒定為薯蕷科植物粉背薯蕷Dioscorea hypoglauca Palibin的干燥根莖，樣品保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)系。乙腈（Fisher公司，色譜純），娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 ①原薯蕷皂苷對照品溶液：精密稱取原薯蕷皂苷對照品4.32 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用水溶解并稀釋到刻度，搖勻，備用。②薯蕷皂苷對照品溶液：精密稱取薯蕷皂苷對照品4.10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取粉萆薢粉末（過60目篩）約300 mg，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz）60 min，過濾，減壓回收溶劑，殘?jiān)?0%乙醇定容至25 mL棕色量瓶中。用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，備用。

2.2 色譜條件

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取原薯蕷皂苷對照品溶液（濃度為0.432 mg/mL）4、8、12、16、20 μL，薯蕷皂苷對照品溶液（濃度為0.410 mg/mL）2.5、5.0、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測定峰面積。以對照品量（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程分別為：原薯蕷皂苷Y=111 214X-23 782，r=0.999 1；薯蕷皂苷Y=143 558X+1721.9，r=0.999 6。原薯蕷皂苷與薯蕷皂苷量分別在1.73～8.64 μg和1.03～8.20 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷的色譜峰峰面積，分別計(jì)算原薯蕷皂苷與薯蕷皂苷的峰面積，結(jié)果RSD分別為2.35%、1.61%，表明方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液20 μL，分別于制備后0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣測定，計(jì)算原薯蕷皂苷與薯蕷皂苷峰面積的RSD分別為1.08%、1.14%，結(jié)果表明供試品溶液中原薯蕷皂苷與薯蕷皂苷在室溫條件下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取粉萆薢藥材（廣西玉林，過60目篩）粉末6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，制得6份供試品溶液，取20 μL注入高效液相色譜儀，測定含量。6份樣品中原薯蕷皂苷與薯蕷皂苷的含量平均值分別為1.98%、2.01%，RSD分別為2.04%、1.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取粉萆薢（已知原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷含量分別為1.98%、2.01%）粉末6份，每份約150 mg，精密稱定，分別精密加入原薯蕷皂苷對照品溶液（含原薯蕷皂苷1.8 mg/mL）、薯蕷皂苷對照品溶液（含薯蕷皂苷2.0 mg/mL）各1.5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.8 含量測定

取10個不同產(chǎn)地粉萆薢藥材粉末300 mg各3份，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，并用外標(biāo)法計(jì)算樣品中原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷的含量。10個不同產(chǎn)地粉萆薢藥材中原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷含量相差較大。薯蕷皂苷含量以湖南沅陵最高，為3.22%；浙江臨安最低，為0.75%。原薯蕷皂苷含量以湖北荊州最高，為2.24%；江西宜春最低，為0.89%。二者含量之和由高到低產(chǎn)地依次為：湖南沅陵>湖北荊州>浙江龍泉>安徽亳州>廣西玉林>廣西南寧>廣東廣州>浙江臨安>湖北宜昌>江西宜春。結(jié)果見表2。

3 討論

本試驗(yàn)考察了波長203、208、210 nm的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在203 nm處噪音干擾較大、210 nm處靈敏度較低，而在208 nm處原薯蕷皂苷與薯蕷皂苷均有吸收且分離良好，且在此波長下同時測定2個成分雜質(zhì)干擾少、靈敏度高，因此選擇208 nm 作為檢測波長。

本試驗(yàn)考察了乙腈-水、乙腈-0.2%冰醋酸水、乙腈-0.1%磷酸水等不同比例的流動相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果表明乙腈-水梯度洗脫的色譜峰峰形好，保留時間適中，靈明度高，可達(dá)到較好的分離效果。

由于原薯蕷皂苷在甲醇中不穩(wěn)定，其C-22-OH容易被甲基化，轉(zhuǎn)變成甲基原薯蕷皂苷，故不選用甲醇做溶劑和流動相。本試驗(yàn)提取溶劑考察了30%、50%、70%、95%乙醇溶劑的提取效率，結(jié)果顯示70%乙醇提取效率較高。

因原薯蕷皂苷為原皂苷類，在受熱的情況下容易水解，失去26-位的葡萄糖基，F(xiàn)-環(huán)環(huán)合得到相應(yīng)的次級皂苷類，為避免加熱，所以選擇超聲提取法。提取溶劑用量考察了10、30、50 mL，提取時間考察了20、40、60、80 min，結(jié)果表明30 mL的70%乙醇超聲提取60 min可提取完全。

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