電針對(duì)單純性肥胖大鼠胰島素抵抗及下丘腦刺鼠基因相關(guān)蛋白、神經(jīng)肽Y的影響

劉霞 何軍鋒 屈婭婷 劉志君 蒲慶陽(yáng) 郭勝童 杜佳 蔣鵬飛

摘要：目的 觀察電針對(duì)飲食誘導(dǎo)的單純性肥胖大鼠體質(zhì)量、胰島素抵抗及下丘腦刺鼠基因相關(guān)蛋白（AGRP）、神經(jīng)肽Y（NPY）基因表達(dá)的影響，探討電針治療肥胖癥的相關(guān)機(jī)制。方法 50只SD雄性大鼠隨機(jī)分為低脂組10只和高脂組40只，高脂組大鼠造模成功后，隨機(jī)分為模型組、電針組、西藥組，每組10只。電針組電針“后三里”和“曲池”，每日1次，每次20 min，連續(xù)28 d；西藥組予奧利司他灌胃，低脂組和模型組不做治療。每日記錄大鼠體質(zhì)量，檢測(cè)空腹血糖和胰島素，RT-qPCR檢測(cè)下丘腦AGRP和NPY基因表達(dá)水平，HE染色觀察脂肪組織和肝臟形態(tài)。結(jié)果 治療后電針組和西藥組體質(zhì)量、胰島素抵抗指數(shù)、AGRP、NPY、脂肪細(xì)胞直徑均低于模型組（P<0.05），2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。電針組和西藥組肝臟脂變情況均得到改善。結(jié)論 電針通過改善胰島素抵抗，抑制NPY和AGRP神經(jīng)元的表達(dá)，達(dá)到控制體質(zhì)量增長(zhǎng)的目的。

關(guān)鍵詞：電針；單純性肥胖大鼠；體質(zhì)量；胰島素抵抗；刺鼠基因相關(guān)蛋白；神經(jīng)肽Y；大鼠

中圖分類號(hào)：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）05-0057-04

Effects of Electro-acupuncture on Insulin Resistance and Hypothalamic Agouti Gene-related Protein and Neuropeptide Y in Obesity Rats LIU Xia1， HE Jun-feng1，2，3， QU Ya-ting4， LIU Zhi-jun1， PU Qing-yang4， GUO Sheng-tong1， DU Jia1， JIANG Peng-fei1 （1. Institute of TCM Diagnostic， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Liuyang Hospital of Chinese Medicine， Liuyang City， Liuyang 410300， China； 3. Evidence Based Oriental Medicine， Sioux Falls 57106， USA； 4. Xiangxing College of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To observe the effects of electro-acupuncture （EA） on body weight， insulin resistance， hypothalamic agouti gene-related protein （AGRP） and neuropeptide Y （NPY） in diet induced obesity （DIO） rats； To discuss its mechanism for DIO. Methods Fifty SD male rats were randomly divided into low fat diet groups （LFD） and high fat diet group. After the DIO models were established， the successful model rats were randomly divided into model group， EA group and Orlistat （OLST） group. EA was applied to “Zusanli” （ST36） and “Quchi” （LI11） for 20 minutes. The treatment was done once a day for 28 days. OLST was treated with orlistat by gavage. LFD and model did not receive treatment. Body weight was recorded every day. FPG and FINS were detected. The expressions of AGRP and NPY were detected by RT-QPCR. Morphological changes of adipocyte and liver were examined by HE staining. Results The body weight， HOMA-IR， AGRP， NPY and diameter of adipocyte of EA group and OLST group were significantly lower than model group （P<0.05）， difference between EA group and OLST group. The states of hepatic steatosis were improved in EA group and OLST group. Conclusion EA has the effects on weight loss by inhibiting the expressions of AGRP and NPY by improving IR.

Key words： electro-acupuncture； diet induced obesity rats； body weight； insulin resistance； agouti gene-related protein； neuropeptide Y； rats

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81373717）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金項(xiàng)目（12K084）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科開放基金項(xiàng)目（2013ZYZD13）

通訊作者：何軍鋒，E-mail：59421149@qq.com

肥胖癥與糖尿病、高血壓、高血脂等疾病密切相關(guān)，現(xiàn)已成為全球醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)。電針因安全無(wú)毒副反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于肥胖癥的治療，但其具體作用機(jī)制尚未完全明了。刺鼠基因相關(guān)蛋白（AGRP）和神經(jīng)肽Y（NPY）是重要的食欲調(diào)節(jié)因子，有增強(qiáng)食欲、促進(jìn)攝食的作用，胰島素則可以作用于下丘腦而抑制食欲，促進(jìn)產(chǎn)熱，該作用主要通過AGRP/NPY介導(dǎo)[1]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察電針對(duì)飲食誘導(dǎo)的單純性肥胖（DIO）大鼠空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）和下丘腦AGRP、NPY基因表達(dá)的影響，探討電針治療肥胖癥的相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及飼料

SPF級(jí)4周齡SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量約100 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)43004700012177。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，控制室溫為20～22 ℃，濕度30%～40%，自由飲水，晝夜交替12 h/12 h。低脂、高脂飼料，美國(guó)Research Diet公司。

1.2 藥物

奧利司他膠囊，重慶植恩藥業(yè)有限公司，批號(hào)20140412。

1.3 主要試劑與儀器

血糖試劑盒，羅氏公司，批號(hào)601404-01；125I胰島素放射免疫分析試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所研制，批號(hào)201503；Trizol，美國(guó) Invitrogen生命技術(shù)公司；SYBR Green qPCR Mix，日本TOYOBO公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas公司。華佗牌SDZ-V電針儀，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；華佗牌無(wú)菌針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，0.25 mm×13 mm；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；7300熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI；RM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)，德國(guó)徠卡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為低脂組10只和高脂組40只，分別喂飼低脂和高脂飼料。以高脂組大鼠體質(zhì)量超過低脂組大鼠平均體質(zhì)量20%為成模標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 分組及治療

將造模成功的DIO大鼠30只隨機(jī)分為3組，一組不做任何治療為模型組，一組予以電針治療為電針組，一組予以?shī)W利司他灌胃為西藥組，每組10只。將電針組大鼠放入自制固定器中，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[2]常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位定位，取雙側(cè)“后三里”和“曲池”，一次性使用無(wú)菌針灸針分別刺入7 mm和4 mm，然后接通電針儀，采用頻率10 Hz、強(qiáng)度1.5 mA、連續(xù)波，每次治療20 min，每日1次，連續(xù)28 d。西藥組予奧利司他灌胃，成人每日臨床用量為360 mg/d，按體表面積等效劑量換算比率，大鼠按1 mL/100 g計(jì)算灌胃量，每日灌胃1次，連續(xù)28 d。低脂組和模型組不予任何治療。治療期間，為保證實(shí)驗(yàn)前后可比性，低脂組予低脂飼料喂養(yǎng)，模型組、電針組和西藥組仍予高脂飼料喂養(yǎng)。每日觀察記錄各組大鼠體質(zhì)量、攝食飲水量、大小便情況等。

2.3 取材

28 d后，各組大鼠禁食過夜，次日予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min離心10 min，分離血清待測(cè)。取腎周脂肪、肝臟右外葉，10%福爾馬林固定。在冰上迅速取出下丘腦，置于液氮中，-80 ℃冰箱保存。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用血糖試劑盒和125I胰島素放射免疫分析試劑盒分別檢測(cè)FPG和FINS含量。

2.4.2 病理觀察 HE染色，經(jīng)脫水透明、浸蠟包埋、切片和貼片、脫蠟染色、脫水透明和中性樹膠封固等，鏡下觀察脂肪組織和肝臟標(biāo)本并拍照。

2.4.3 RT-qPCR檢測(cè) ①引物設(shè)計(jì)。從NCBI中下載基因序列，引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.0軟件，引物序列分別為：NPY f- GTGTTTGGGCATTCTGGCTG，NPY r-GTGGGACAGGCAGACTGGTT，引物長(zhǎng)度320 bp；AGRP f-TAGGCAAGGATCAACAAGCAA，AGRP r- TAGACCTGAGAACTCTGGGAA，引物長(zhǎng)度161 bp；β-actin f-CCCATCTATGAGGGTTACGC，β-actin r- TTTAATGTCACGCACGATTTC，引物長(zhǎng)度118 bp。②總RNA提?。好?00 mg下丘腦標(biāo)本加入1 mL Trizol液氮研磨，根據(jù)試劑盒提取樣品總RNA，并測(cè)定RNA的純度和濃度。③cDNA第一鏈的合成。0.5 ?L OligodT（0.5 ?g/?L）和5.5 ?L Total RNA加入PCR小管中，補(bǔ)充DEPC處理水至12 ?L；混勻后離心，65 ℃溫浴5 min，立即置于冰上。按比例配制反應(yīng)體系（冰上進(jìn)行）：5×Reaction Buffer 2 ?L，RNase Inhibitor 0.5 ?L，10 mmol/L dNTPs 1 ?L，Reverse Transcriptase 0.5 ?L，混勻，短暫離心。上述體系在42 ℃反應(yīng)1 h，然后在70 ℃水浴鍋中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活；將得到cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。④RT-qPCR。按比例配制反應(yīng)體系：2×SYBR Green qPCR Mix 10 ?L，上游引物（10 ?mol/L）1 ?L；下游引物（10 ?mol/L）1 ?L，cDNA 1 ?L，水7.0 ?L。設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-Time定量，預(yù)變性95 ℃、3 min，之后每一步變性95 ℃、10 s，58 ℃退火延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，每次在延伸階段讀取熒光值。用2-ΔΔCt法進(jìn)行各基因表達(dá)的相對(duì)定量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，方差齊用LSD分析，方差不齊用Dunnett T3分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 電針對(duì)模型大鼠體質(zhì)量的影響

造模前各組大鼠體質(zhì)量無(wú)差異。造模后，模型組、西藥組及電針組體質(zhì)量明顯高于低脂組（P<0.05）。治療4周后，西藥組和電針組大鼠體質(zhì)量明顯低于模型組（P<0.05），但西藥組和電針組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

4.2 電針對(duì)模型大鼠空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的影響

電針組FINS、FPG明顯低于模型組（P<0.05）；電針組和西藥組胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR=FINS×FPG÷22.5）明顯低于模型組（P<0.05），但西藥組和電針組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

4.3 電針對(duì)模型大鼠下丘腦刺鼠基因相關(guān)蛋白、神經(jīng)肽Y基因表達(dá)的影響

與低脂組比較，模型組AGRP、NPY基因表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，西藥組和電針組AGRP、NPY基因表達(dá)水平明顯下降（P<0.05），但西藥組和電針組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表3。

4.4 電針對(duì)模型大鼠脂肪細(xì)胞、肝臟組織的影響

模型組大鼠脂肪細(xì)胞直徑大于低脂組（P<0.05），而西藥組和電針組脂肪細(xì)胞直徑小于模型組（P<0.05），見表4、圖1。光鏡下，低脂組大鼠肝臟可見單個(gè)脂變肝細(xì)胞；模型組大鼠肝細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)脂滴大小不一，脂變細(xì)胞達(dá)3/4以上，細(xì)胞水腫嚴(yán)重，灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)；西藥組和電針組較模型組脂變細(xì)胞在1/2以下，胞漿內(nèi)脂滴變小，輕度水腫，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。各組大鼠肝臟病理變化見圖2。

4.5 不良反應(yīng)

西藥組大鼠大便溏稀不成形，活動(dòng)減少，精神萎靡，毛色枯黃；模型組大鼠大便尚可，活動(dòng)量稍減少，毛色略黃；電針組和低脂組大便正常，毛色有光澤。

5 討論

對(duì)于單純性肥胖癥的治療，目前主要有藥物療法、針灸療法、手術(shù)療法和運(yùn)動(dòng)療法等。自從曲美等一批鹽酸西布曲明類藥物下架后，奧利司他是目前國(guó)內(nèi)僅有的合法減肥藥。該藥可抑制胃腸道消化脂肪所需的酵素，而減少胃腸道對(duì)脂肪的吸收，但易導(dǎo)致脂肪代謝紊亂，表現(xiàn)為胃腸脹氣、大便次數(shù)增多和脂肪便等[3]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們亦觀察到西藥組大鼠大便溏稀不成形、體毛枯黃，而電針組大鼠大便正常，毛色有光澤。

陽(yáng)明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)脈，與能量代謝關(guān)系最為密切，食欲的強(qiáng)弱直接與胃經(jīng)和胃氣相關(guān)，無(wú)論是臨床實(shí)踐還是動(dòng)物模型操作中，陽(yáng)明經(jīng)腧穴常被選為針刺干預(yù)肥胖的主穴。因此本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇陽(yáng)明經(jīng)的“后三里”和“曲池”作為治療肥胖大鼠的腧穴。

在本實(shí)驗(yàn)中，電針組和西藥組治療4周后，體質(zhì)量明顯低于模型組（P<0.05），治療期間體質(zhì)量增長(zhǎng)數(shù)值亦低于模型組（P<0.05），表明電針和奧利司他均可有效抑制DIO大鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)。

胰島素是重要的能量調(diào)節(jié)因子，正常大鼠予下丘腦注射胰島素可明顯抑制攝食。下丘腦在食欲調(diào)節(jié)及攝食中起著關(guān)鍵作用，其中的弓狀核含有許多調(diào)節(jié)食欲的神經(jīng)肽，包括促進(jìn)攝食的AGRP和NPY。弓狀核上的AGRP和NPY神經(jīng)元含有胰島素受體。下丘腦的胰島素通過與其受體結(jié)合后，啟動(dòng)相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，可以抑制AGRP和NPY神經(jīng)元的表達(dá)[4]，達(dá)到降低食欲，增加產(chǎn)熱和能量消耗的作用。然而流行病學(xué)調(diào)查表明，肥胖者存在著明顯的胰島素抵抗[5]，高胰島素血癥是胰島素抵抗的一個(gè)主要標(biāo)志[6]。肥胖者體內(nèi)雖然存在著較高水平的胰島素，卻無(wú)法發(fā)揮其相應(yīng)的作用。

研究表明，減輕糖尿病患者的體質(zhì)量能有效改善胰島素抵抗、降低血糖[7]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也觀察到，模型組胰島素水平較低脂組升高，提示模型組大鼠可能存在胰島素抵抗。而電針治療4周后，電針組大鼠胰島素水平較模型組顯著下降（P<0.05），相應(yīng)的HOMA-IR亦顯著下降（P<0.05），說明電針組大鼠的胰島素抵抗情況得到明顯改善。同時(shí)，我們觀察到，模型組AGRP和NPY基因表達(dá)水平顯著高于低脂組（P<0.05），而電針組其基因表達(dá)水平均顯著低于模型組（P<0.05）。提示電針組大鼠治療后胰島素抵抗的狀況得到改善，增加了胰島素的敏感性，通過與其受體結(jié)合，抑制了AGRP和NPY神經(jīng)元的表達(dá)。

脂肪細(xì)胞體積增大是肥胖癥的重要組織學(xué)特征。模型組大鼠脂肪體積增大，這與人類肥胖癥的組織學(xué)改變相一致。治療4周后，電針組和西藥組大鼠脂肪細(xì)胞直徑明顯變小，表明整體的脂肪代謝經(jīng)調(diào)整后，脂肪組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了相應(yīng)的改變，可能是其減肥的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。病理觀察結(jié)果顯示，電針組和西藥組大鼠肝組織脂肪病變較模型組明顯減輕，表明2組皆可改善肝臟中脂質(zhì)的含量。

本研究結(jié)果表明，電針可通過改善胰島素抵抗情況，從而抑制促食因子AGRP和NPY神經(jīng)元的基因表達(dá)，同時(shí)改變脂肪細(xì)胞大小、改善肝臟脂變狀態(tài)，而達(dá)到控制體質(zhì)量增長(zhǎng)的目的。電針對(duì)胰島素及下丘腦NPY和AGRP基因表達(dá)的良性調(diào)整作用可能是電針減肥的重要細(xì)胞分子作用機(jī)制。相較西藥組大鼠表現(xiàn)出來的不良反應(yīng)，電針是一種具有明顯優(yōu)勢(shì)的抗肥胖治療方法。

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