復(fù)方參鹿顆粒治療腎陽虛型再生障礙性貧血療效觀察及對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群的影響

趙琳 邱仲川 陳珮 黃中迪 胡曉瑩 朱小勤 瞿瑋穎

摘要：目的 觀察復(fù)方參鹿顆粒聯(lián)合西藥治療腎陽虛型再生障礙性貧血（AA）臨床療效及對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群的影響，探討其作用機(jī)制。方法 將40例AA患者隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組各20例。治療組予復(fù)方參鹿顆粒聯(lián)合西藥治療，對(duì)照組單用西藥治療。療程均為6個(gè)月，隨訪1年以上。觀察2組臨床療效及治療前后外周血CD4+T細(xì)胞亞群變化。結(jié)果 治療組臨床療效優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。治療后2組血細(xì)胞計(jì)數(shù)均較治療前改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。治療組治療后紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與治療前比較，治療組治療后CD4+CD25+細(xì)胞/CD4+細(xì)胞、CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞/CD4+CD25+細(xì)胞比例升高，Th1、Th2細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組治療后僅Th2細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 復(fù)方參鹿顆?？商岣吣I陽虛型AA治療效果，其機(jī)制可能與減少Th1細(xì)胞數(shù)量、增加CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量、提高其FoxP3的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：復(fù)方參鹿顆粒；再生障礙性貧血；CD4+T細(xì)胞亞群

中圖分類號(hào)：R259.565 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）05-0020-04

Efficacy Observation of Fufang Shenlu Granule for Kidney-yang Deficiency Aplastic Anemia and Its Effects on CD4+ T Lymphocyte Subsets ZHAO Lin， QIU Zhong-chuan， CHEN Pei， HUANG Zhong-di， HU Xiao-ying， ZHU Xiao-qin， QU Wei-ying （Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM， Shanghai 200021， China）

Abstract： Objective To observe the clinical efficacy of Fufang Shenlu Granule for kidney-yang deficiency aplastic anemia （AA） and its effects on CD4+ T lymphocyte subsets， and explore its mechanism. Methods Forty AA patients were randomly divided into treatment group and control group， 20 cases in each group. The treatment group was treated with Fufang Shenlu Granule combined with conventional western medicine therapy， while the control group was only treated with conventional western medicine therapy. The treatment lasted for 6 months， and follow-up visits lasted for at least one year. The clinical efficacy and T lymphocyte subsets ratio changes before and after treatment in the two groups were observed. Results The clinical efficacy of treatment group was better than that of control group （P<0.05）. After treatment， the blood cell counts of the two groups were improved than those of before treatment （P<0.05， P<0.01）. After treatment， the red blood cell count and hemoglobin of treatment group were higher than those of control group （P<0.05）. Compared with the data before treatment in treatment group， the ratio of CD4+CD25+ cells in all CD4+ cells， and the ratio of CD4+CD25+FoxP3+ cells in all CD4+CD25+ cells increased （P<0.05）； the ratio of Th1 and Th2 cells in all CD3+CD4+ decreased （P<0.05）. The ratio of Th2 cells was lower than that before treatment in the control group （P<0.05）. Conclusion Fufang Shenlu Granule can enhance the treatment efficiency of AA with kidney-yang deficiency syndrome. The mechanism may be related to the decrease of Th1 cells， the increase of CD4+CD25+Tregs and their FoxP3 expression.

Key words： Fufang Shenlu Granule； aplastic anemia； CD4+ T lymphocytes subsets

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是免疫介導(dǎo)的以全血細(xì)胞減少為主要臨床表現(xiàn)的骨髓衰竭性疾病。既往研究認(rèn)為，CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的造血干細(xì)胞免疫損傷是AA發(fā)生的病理基礎(chǔ)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞亞群在AA發(fā)病中發(fā)揮更重要的作用[2-3]。AA為臨床常見的難治性血液系統(tǒng)疾病，中西醫(yī)結(jié)合治療該病的效果已得到認(rèn)可。復(fù)方參鹿顆粒為本院院內(nèi)制劑，該方重用溫腎益髓藥物，臨床用于AA治療20余年。本研究采用隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證復(fù)方參鹿顆粒聯(lián)合西藥治療AA療效的可靠性，觀察其對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群的影響，探討作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選擇2012年5月-2014年12月在本院血液科就診的AA患者40例。采用隨機(jī)數(shù)字表將入組患者分為治療組和對(duì)照組各20例。治療組男10例，女10例；年齡18～70歲，平均（47.25±12.80）歲；病程最短3個(gè)月，最長30年，平均（1.82±1.25）年；初治17例，復(fù)治3例；重型AA 7例，輕型AA 13例。對(duì)照組男11例，女9例；年齡20～70歲，平均（43.50±19.32）歲；病程最短2個(gè)月，最長28年，平均（1.95±1.78）年；初治15例，復(fù)治5例；重型AA 8例，輕型AA 12例。2組患者性別、年齡、病程、血象、骨髓象方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 診斷與納入標(biāo)準(zhǔn)

符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》AA診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》AA腎陽虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①有明顯兼夾證或合并證者。②年齡在18歲以下或70歲以上，妊娠期或哺乳期婦女，過敏體質(zhì)及對(duì)本藥過敏者。③合并嚴(yán)重心、腦、肝、腎疾病及精神病患者。④未按規(guī)定用藥，無法判斷療效，或資料不全等影響療效或安全性判斷者。⑤參加其他臨床研究者。

1.4 治療方法

2組均予司坦唑醇片（廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)1201015），6～8 mg/d，分2～3次口服。重型AA者加用環(huán)孢霉素A（杭州中美華東制藥有限公司，批號(hào)120932），3～6 mg/（kg·d），分早晚2次口服，血藥濃度維持在100～300 ng/L。治療組同時(shí)予復(fù)方參鹿顆粒（本院院內(nèi)制劑，滬藥制字Z06100005，由本院藥劑科制備，批號(hào)20120302），每次12 g，每日3次，開水沖服。2組療程均為6個(gè)月。隨訪1年以上。

2組均予支持治療：如血紅蛋白<60 g/L，予紅細(xì)胞懸液輸注；如血小板計(jì)數(shù)<5.0×109/L（無出血危險(xiǎn)因子）或<20.0×109/L（有明顯出血傾向或存在出血危險(xiǎn)因子），予血小板懸液輸注及對(duì)癥止血治療；如合并感染，根據(jù)感染部位及嚴(yán)重程度及時(shí)給予有效抗感染治療。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 外周血細(xì)胞計(jì)數(shù) 每2周用COULTER LH750全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)1次。

1.5.2 CD4+T細(xì)胞亞群比例 分別于治療前后采用BD FACScantoII流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞亞群1次。所用單克隆抗體CD3-PerCp、CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE、IL-17-PE、IFN-γ-PE、IL-4-PE及其同型陰性對(duì)照抗體均購自BD pharmingen公司，破膜/固定劑購自eBioscience公司，佛波酯和離子霉素購自Sigma公司。用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6 療效標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]判斷臨床療效。基本治愈：貧血和出血癥狀消失，血紅蛋白男性達(dá)120 g/L、女性達(dá)110 g/L，白細(xì)胞達(dá)4×109/L，血小板達(dá)100×109/L，隨訪1年以上未復(fù)發(fā)。緩解：貧血和出血癥狀消失，血紅蛋白男性達(dá)120 g/L、女性達(dá)100 g/L，白細(xì)胞達(dá)3.5×109/L左右，血小板有一定程度增加，隨訪3個(gè)月病情穩(wěn)定或繼續(xù)進(jìn)步。明顯進(jìn)步：貧血和出血癥狀明顯好轉(zhuǎn)，不輸血，血紅蛋白較治療前1個(gè)月內(nèi)常見值增長30 g/L以上，并能維持3個(gè)月。判定以上3項(xiàng)療效者均應(yīng)3個(gè)月內(nèi)不輸血。無效：經(jīng)充分治療后，癥狀、血象未達(dá)明顯進(jìn)步。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用—x±s表示，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布且方差齊性，組間比較采用成組t檢驗(yàn)，同組治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。若資料呈偏態(tài)分布，進(jìn)行相應(yīng)的變量變換后呈正態(tài)分布且方差齊性者采用t檢驗(yàn)，若變換后仍不服從正態(tài)分布或方差仍不齊，采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)。等級(jí)資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床療效比較

治療組基本治愈3例，緩解7例，明顯進(jìn)步7例，無效3例；對(duì)照組基本治愈1例，緩解4例，明顯進(jìn)步8例，無效7例。治療組療效優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.129，P=0.040）。

2.2 2組治療前后外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)

治療前2組外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），治療后2組血細(xì)胞計(jì)數(shù)均較治療前改善（P<0.05，P<0.01）。治療后治療組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量均高于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)果見表1。

2.3 2組治療前后外周血CD4+T細(xì)胞亞群分析

2組分別有16例患者進(jìn)行了CD4+T細(xì)胞亞群檢測(cè)。治療前2組CD4+T細(xì)胞亞群比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療組治療后CD4+CD25+細(xì)胞/CD4+細(xì)胞、CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞/CD4+CD25+細(xì)胞比例較治療前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

治療組治療后Th1、Th2細(xì)胞比例較治療前降低，對(duì)照組僅Th2細(xì)胞比例較治療前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

AA是由于效應(yīng)T細(xì)胞的過度激活導(dǎo)致造血組織衰竭的一種自身免疫性疾病，以貧血、出血和感染為主要臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)“虛勞”“髓勞”等范疇。以“腎虛為本”論治已得到多數(shù)醫(yī)家的認(rèn)同。我們認(rèn)為，生化之道，陽居主位，“邪之所湊，其氣必虛”，腎中陽氣虧虛，則衛(wèi)外不固，營不內(nèi)守，氣不攝血，血不循經(jīng)，故AA易繼發(fā)感染和出血；在感染和出血之后，由于火熱和亡血耗氣傷陰，可見陰血虧虛或陰陽俱虛癥狀?！皳p者益之，勞者溫之”（《素問·至真要大論篇》），“補(bǔ)氣在補(bǔ)血之先……而養(yǎng)陽在滋陰之上”（《醫(yī)宗必讀》），對(duì)氣血陰陽俱損之虛勞AA治宜溫陽益氣為先。復(fù)方參鹿顆粒重用紅參須、鹿角片、附子等藥物溫陽益氣以促進(jìn)骨髓造血恢復(fù)。陽附于陰，陽生陰長，故以熟地黃、龜甲等滋補(bǔ)腎陰藥物同用，既可達(dá)到陽得陰助則生化無窮之效，又可去除溫陽藥物耗傷陰血之弊。本研究結(jié)果顯示，對(duì)于辨證屬腎陽虛型AA，以復(fù)方參鹿顆粒聯(lián)合西藥治療，可有效改善AA患者外周血象，療效優(yōu)于單用西藥組，尤其是對(duì)紅細(xì)胞、血紅蛋白有顯著提高作用，其中治療組治療后的血紅蛋白量接近正常。

免疫機(jī)制異常是AA關(guān)鍵的發(fā)病機(jī)制，而CD4+T細(xì)胞是這種免疫反應(yīng)發(fā)生的重要驅(qū)動(dòng)者和參與者。CD4+T細(xì)胞包括IFN-γ–producing CD4+T細(xì)胞（Th1細(xì)胞）、IL-4–producing CD4+T細(xì)胞（Th2細(xì)胞）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）、IL-17–producing CD4+T細(xì)胞（Th17細(xì)胞）等，Th1和Th2、Th17和Tregs在分化及功能上相互拮抗，在自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[6]。

有研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照比較，AA患者存在Th1細(xì)胞數(shù)顯著增加，而Th2細(xì)胞數(shù)無變化，導(dǎo)致Th1細(xì)胞反應(yīng)亢進(jìn)，造血負(fù)調(diào)控因子產(chǎn)生增加，骨髓正常造血受抑[7]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，AA患者Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量均顯著高于正常對(duì)照，Th1細(xì)胞數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度不相關(guān)，而Th2細(xì)胞數(shù)量增加僅見于重型、極重型AA[2]，可能由于重型AA的Tregs數(shù)量顯著減少，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞凋亡功能障礙[8]。本研究結(jié)果顯示，治療組治療后Th1、Th2細(xì)胞比例均降低，可能與本研究納入了重型AA有關(guān)。雖然Th1/Th2比值同時(shí)也呈下降趨勢(shì)，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與健康人群相比，AA患者存在Tregs數(shù)量減少，轉(zhuǎn)錄因子FoxP3蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著下降，和疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[9]。Tregs數(shù)量減少、功能障礙，免疫耐受調(diào)節(jié)功能受抑，導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞的異常增殖活化，是AA發(fā)生的主要原因之一。AA殘存造血組織中IL-17+T細(xì)胞數(shù)量增多，而治療有效者Th17細(xì)胞比例及絕對(duì)值較治療前明顯減低，并且與Tregs數(shù)量存在負(fù)相關(guān)[10]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，AA患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量及其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORC的表達(dá)并無增加，提示Th17免疫應(yīng)答在AA發(fā)病中的作用可能并不重要[11]。在本研究中，治療組經(jīng)治療后，CD4+CD25+Tregs比例顯著上升，F(xiàn)oxP3表達(dá)增加，而Th17細(xì)胞數(shù)量與治療前相比并無明顯改變，與Tregs數(shù)量并不存在負(fù)相關(guān)。

CD4+T細(xì)胞各亞群之間存在復(fù)雜的相互作用，其與AA發(fā)病的關(guān)系仍有許多疑問未闡明。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，復(fù)方參鹿顆粒至少可以降低AA患者Th1細(xì)胞比例，改善Th1細(xì)胞極化，增加CD4+CD25+Tregs的數(shù)量，提高其FoxP3的表達(dá)，從而增強(qiáng)Tregs的免疫抑制功能，而對(duì)Th17細(xì)胞無明確的作用。但是，復(fù)方參鹿顆粒是否對(duì)Th1細(xì)胞有直接的抑制和逆轉(zhuǎn)作用，亦或通過增強(qiáng)Tregs的免疫抑制功能來改善Th1細(xì)胞極化，尚待進(jìn)一步研究。

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