熊果酸通過抑制Akt通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

王雄 黃書嵐

熊果酸通過抑制Akt通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

王雄 黃書嵐

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科， 湖北 武漢 430060)

目的 探討熊果酸對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并分析可能的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)的U87MG細(xì)胞，用不同濃度熊果酸(濃度0、10、20、40、80、100 μmol/L)處理24、48、72 h，MTT法測(cè)定其對(duì)U87MG細(xì)胞增殖的影響；熊果酸(濃度分別為0、20、40、80 μmol/L)處理U87MG細(xì)胞48 h后，分別采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，分光光度法檢測(cè)細(xì)胞Caspase-3活性；Western blot法檢測(cè)Akt、p-Akt, p-GSK-3β、Bax及Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量、時(shí)間依賴性；U87MG細(xì)胞經(jīng)熊果酸作用48 h后，細(xì)胞凋亡率從14.8 %上升至37.7 %；Bax表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)下調(diào)；細(xì)胞Caspase-3活性顯著升高；且熊果酸可抑制p-Akt及其下游蛋白p-GSK-3β的表達(dá)。結(jié)論 熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞增殖具有抑制作用，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其抗腫瘤作用機(jī)制可能與抑制Akt信號(hào)通路激活，繼而上調(diào)Bax并下調(diào)Bcl-2，并增加Caspase-3活性有關(guān)。

熊果酸； U87MG細(xì)胞； 凋亡； Akt信號(hào)通路

神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率高居是顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的首位，由于腫瘤生長(zhǎng)快，早期即可像腦實(shí)質(zhì)侵襲，發(fā)病后發(fā)展迅速，手術(shù)難以完全切除，膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差[1]。近年來化療藥物不斷發(fā)展更新，而膠質(zhì)瘤患者生存率卻并未提高，在需為進(jìn)一步探討新的治療方法。熊果酸(Ursolic acid)，又成為烏索酸，廣泛存在于包括白花蛇舌草、女貞子、烏梅、夏枯草等在內(nèi)的天然植物中，藥理學(xué)研究證實(shí)，熊果酸具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、護(hù)肝等多種藥理學(xué)作用[2]。此外，熊果酸還具有抗腫瘤作用。研究證實(shí)，熊果酸可抵抗包括苯并芘、黃曲霉素在內(nèi)的多種致癌物質(zhì)的致癌效應(yīng)，且在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用[3-6]。

研究證實(shí)，Akt信號(hào)通路在細(xì)胞代謝、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用，異?；蜻^度激活的Akt通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[7, 8]。本研究旨在觀察熊果酸對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG細(xì)胞增殖和凋亡的作用，并探討其對(duì)U87MG細(xì)胞Akt信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 細(xì)胞株選用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG細(xì)胞，該細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，保存于武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室；熊果酸、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)(MTT)均購自sigma公司；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自中國(guó)KeyGEN公司；胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司，DMEM培養(yǎng)液、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物科技有限公司；Akt, p-Akt (Ser473), p-GSK-3β (Ser9), Bax, Bcl-2 及 內(nèi)參β-actin單克隆抗體購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中后置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3天后觀察培養(yǎng)基顏色及培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)，若培養(yǎng)基顏色變淡而細(xì)胞未長(zhǎng)滿則棄去培養(yǎng)基，用高壓過的PBS液輕輕搖晃洗滌2～3遍，加入6 ml含10%胎牛血清的新培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定 取3塊96孔板，標(biāo)記為d1-d3，每塊板上劃分為6個(gè)區(qū)域，用于接種6組細(xì)胞，每組細(xì)胞含5個(gè)副孔，同時(shí)準(zhǔn)備好細(xì)胞計(jì)數(shù)板；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞備用；各組細(xì)胞按2000/well接種于96孔板上，每孔加培養(yǎng)基100 μL，鋪板過程中確保每個(gè)孔接種的細(xì)胞數(shù)目一致，鋪板完成后將96孔板放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中；細(xì)胞貼壁后分別各組分別加入熊果酸終濃度為0、10、20、40、80、100 μmol/L的培養(yǎng)液，三塊培養(yǎng)板分別培養(yǎng)24, 48, 72 h，在培養(yǎng)終止前4h，每孔內(nèi)加入10μL 5mg/ml的MTT，4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL的DMSO終止反應(yīng)。用振蕩器振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm的OD值。細(xì)胞增殖抑制率(%)計(jì)算公司：(實(shí)驗(yàn)組平均A值-調(diào)零孔A值)/(對(duì)照組平均A值-調(diào)零孔A值)]×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板中，貼壁后棄上清。熊果酸組分別加入含不同濃度熊果酸(熊果酸終濃度為20、40、80 μmol/L)的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，將6孔板置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，后收集培養(yǎng)上清于5 ml離心管中，用D-Hanks液洗滌細(xì)胞一次后用胰酶消化細(xì)胞，消化完全后收集細(xì)胞于同一5 ml離心管中。以1500rmp的速度離心5 min，棄去上清。收集細(xì)胞。用1×的binding buffer液洗滌細(xì)胞，離心機(jī)上1500 rmp，離心5min，收集細(xì)胞，加入staining buffer液，充分混勻，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106cell/ml左右。取5 uL annexin V-APC加入100 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行染色，室溫下避光放置10min，將染色后的細(xì)胞懸液置于流式上機(jī)管中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組設(shè)三個(gè)副孔。

1.2.4 Caspase-3活性檢測(cè) 細(xì)胞接種及分組同上，處理48 h后收集細(xì)胞，用冷的PBS洗滌3遍，棄去PBS，加入三去污蛋白裂解液，置于冰上裂解30分鐘，用雙蒸水泡過的細(xì)胞刮收集瓶中液體于EP管中，4℃，離心機(jī)上12000 rpm離心10min，小心吸取上清，將上清移至預(yù)冷的離心管內(nèi)，放置在冰上，采用BCA法測(cè)定提取的蛋白濃度。根據(jù)Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒操作方法操作。取待測(cè)樣本各50 μl，根據(jù)所測(cè)濃度調(diào)整蛋白量(2～4 g/L)，分別加入20 μl緩沖液，用移液器吹打混勻，在暗室再分別加入5 μl 的Caspase-3催化底物Ac-DEVD-pNA，再將6孔板放回37℃培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀上測(cè)定各待測(cè)孔在405 nm處的吸光值(OD405)。

1.2.5 Akt, p-Akt (Ser473), p-GSK-3β (Ser9), Bax, Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè) 細(xì)胞接種及分組同上，收集細(xì)胞，用冷的PBS洗滌3遍，棄去PBS，加入三去污蛋白裂解液，置于冰上裂解30分鐘，用雙蒸水泡過的細(xì)胞刮收集瓶中液體于EP管中，4℃，12000 rpm離心10min，吸取上清，小心將上清移至高壓過的EP管中，做好標(biāo)記，將EP管放入超低溫冰箱-80℃凍存。采用BCA法測(cè)定提取的樣本蛋白質(zhì)濃度，加入5×上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。將膠板固定在電泳架上，加入電泳緩沖液，每孔加入40μg蛋白樣品，同時(shí)在兩側(cè)的上樣孔中加入5μL蛋白marker作為分子量參照。電泳結(jié)束后，再電轉(zhuǎn)至PVDF膜，后將膜置入5%脫脂奶粉中，在搖床上搖晃封閉1 h，分別加入Akt, p-Akt (Ser473), p-GSK-3β (Ser9), Bax及Bcl-2抗體，再將膜放置于4℃冰箱內(nèi)搖床上，過夜。第二天小心將膜取出，加入TBST洗滌3次，每次10 min，再加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫?fù)u床上放置2 h，后用TBST洗滌3次，每次10 min，將膜用吸水紙將水分吸干后加入ECL發(fā)光液，在室溫下孵育PVDF膜后放入暗盒中，暗室紅燈下曝光1分鐘，然后顯影，定影，對(duì)膠片進(jìn)行拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸抑制U87MG細(xì)胞增殖 不同濃度熊果酸處理不同時(shí)間點(diǎn)后，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，且隨著藥物濃度的升高及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，U87MG細(xì)胞增殖水平明顯降低，見圖1。

2.2 熊果酸促進(jìn)U87MG細(xì)胞凋亡 如圖2所示，熊果酸處理U87MG細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，U87MG細(xì)胞凋亡率從14.8%上升至37.7%，而對(duì)照組凋亡率僅為0.6%，見圖2。

圖1 熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞增殖的影響

Figure 1 Effect of ursolic acid on cell proliferation in U87MG cells

2.3 熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 熊果酸處理U87MG細(xì)胞48 h后，Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量逐漸降低，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量逐漸增高，見圖3。

2.4 熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞Caspase-3活性的影響 分光光度法檢測(cè)結(jié)果顯示，熊果酸(濃度分別為20、40、80 μmol/L)處理U87MG細(xì)胞48 h后，Caspase-3相對(duì)活性隨著藥物濃度的升高而逐漸增加。熊果酸組細(xì)胞Caspase-3相對(duì)活性較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，見圖4。

圖3 熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

Figure 3 Effect of ursolic acid on the expression of Bcl-2 and Bax in U87MG cells

圖4 熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞Caspase-3活性的影響

Figure 4 Effect of ursolic acid on the relative activity of Caspase-3 in U87MG cells

注：#P<0.05 vs 0 μmol/L

2.5 熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞Akt信號(hào)通路的影響 如圖5所示，U87MG細(xì)胞經(jīng)不同濃度熊果酸(0、20、40、80 μmol/L)處理48 h后，細(xì)胞總的Akt表達(dá)量沒有變化，而p-Akt表達(dá)減少，同時(shí)，Akt下游效應(yīng)蛋白p-GSK-3β表達(dá)也減少，且呈濃度依賴性。表明熊果酸能抑制U87MG細(xì)胞Akt磷酸化，并抑制下游蛋白的活性，即抑制U87MG細(xì)胞Akt信號(hào)通路。

圖5 熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞Akt、p-Akt及p-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

Figure 5 Effect of Ursolic acid on the expression of Akt, p-Akt and p-GSK-3β in U87MG cells

3 討論

在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞的過度增殖與凋亡的相對(duì)或絕對(duì)數(shù)不足之間的不平衡扮演著重要角色[9]。因此，通過抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是腫瘤治療最直接有效的途徑之一。促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑的藥物，特別是尋找低毒性的天然化合物已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。熊果酸是廣泛存在于包括白花蛇舌草、女貞子、烏梅、夏枯草天然植物中的化合物，本研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸對(duì)U87MG細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，且作用效果呈時(shí)間和濃度依賴性，即隨著藥物濃度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)，熊果酸的抑制增殖的效果也越強(qiáng)。熊果酸處理U87MG細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，細(xì)胞后凋亡率顯著增加。

Bcl-2是一種非常重要的抗凋亡蛋白，主要分布在內(nèi)膜上，包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等，Bcl-2的過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增殖，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中Bcl-2均成過表達(dá)狀態(tài)。Bcl-2可發(fā)揮增強(qiáng)線粒體膜電位、維持線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，并阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，抑制核酸內(nèi)切酶活化等作用發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中扮演著重要角色[10, 11]。此外，Bcl-2還可通過與ERK通路相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[12]。研究證實(shí)，抑制或阻斷Bcl-2表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，患者生存期亦可明顯延長(zhǎng)[13]。Bax屬于是Bcl-2家族，但其作用與Bcl-2相反，Bax即可與自身形成同源二聚體，又可與Bcl-2相互結(jié)合形成異源二聚體。研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)時(shí)可促進(jìn)自身與Bax結(jié)合形成異源二聚體，發(fā)揮抗凋亡作用，Bcl-2表達(dá)下調(diào)時(shí)，則出現(xiàn)相反的效應(yīng)，即細(xì)胞Bcl-2/Bax比例改變可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[14]。此外，Bax還可通過直接激活死亡效應(yīng)因子Caspase，改變細(xì)胞膜通透性促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸處理U87MG細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量則顯著降低。此外， Caspase-3作為細(xì)胞凋亡的“執(zhí)行器”，本研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Caspase-3活性顯著升高，研究已經(jīng)證實(shí)Caspase-3的活化標(biāo)志著細(xì)胞凋亡已經(jīng)不可逆轉(zhuǎn)[15]。

Akt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、存活及凋亡過程中的關(guān)鍵組成部分，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用。Akt及p-Akt在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，p-Akt是Akt的活化形式，Akt磷酸化激活后，可對(duì)下游相關(guān)蛋白包括BAD、GSK-3β、NF-κB等進(jìn)行調(diào)節(jié)，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Akt激活后可使Bad磷酸化，后者與Bcl-2或Bcl-xL解聚，使游離的Bcl-2升高，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[16]。此外，Akt信號(hào)通路可直接或間接調(diào)控其他信號(hào)通路[17]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)U87MG細(xì)胞經(jīng)熊果酸作用后，Akt總的表達(dá)量沒有變化，而p-Akt及Akt下游效應(yīng)蛋白p-GSK-3β表達(dá)均減少，且呈濃度依賴性。表明熊果酸可抑制U87MG細(xì)胞Akt信號(hào)通路。本研究結(jié)果提示熊果酸可能通過抑制Akt信號(hào)通路進(jìn)而抑制U87MG細(xì)胞增殖并通過調(diào)控Bcl-2、Bax、caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

熊果酸在體外能抑制膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能是通過抑制Akt信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控Bcl-2、Bax、caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白。熊果酸在抗腫瘤方面具有廣闊的前景，其抗腫瘤機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

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Ursolic acid induced cell apoptosis in glioma cells by inhibition of the Akt signaling pathway

WANG Xiong,HUANG Shulan

(DepartmentofNeurosurgery,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To observe the effect of ursolic acid on the cell apoptosis in glioma cell line U87MG cells and explore its possible mechanisms. Methods MTT assay and flow cytometry were used to determine the cell growth inhibitory rate and apoptosis rate of glioma cell line U87MG cells treated by different concentrations of ursolic acid at different time. Spectrophotometer was used to detect the cell Caspase-3 activity. Western blot were used for Akt, p-Akt, p-GSK-3β, Bcl-2 and Bax protein expression analysis. Results Ursolic acid inhibited the growth of glioma cell line U87MG cells in a dose-dependent and time-dependent manner. Ursolic acid could promote cell apoptosis. The apoptosis rate of U87MG cells increased from 14.8% to 37.7% in Ursolic acid group. The treatment with Ursolic acid promoted the expression of pro-apoptotic factor Bax, and suppressed the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2. The relative activity of caspase-3 of Ursolic acid group was increased. Furthermore, the data of western blot showed that Ursolic acid decreased the expression of p-AKT and downstream effector of Akt, p-GSK-3β in a dose-dependent manner. Conclusion Ursolic acid inhibits the cell proliferation and induces cell apoptosis in U87MG cells, and the effects of antitumor may be associated with inhibition of the Akt signaling pathway, thus promoting the expression of Bax, inhibiting the expression of Bcl-2 and increasing the relative activity of caspase-3.

Ursolic acid; U87MG cell; Apoptosis; Akt signaling pathway

黃書嵐，教授，E-mail: huangshulannwk@163.com

R 73-35+4

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.005

2015-05-22； 編輯： 張文秀)