綠茶多酚對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究*

唐曦 茍博 劉洪 楊松 吳少平 江亮

綠茶多酚對(duì)家兔動(dòng)脈粥樣硬化抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究*

唐曦1茍博1劉洪2楊松1吳少平1江亮1

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像系，2. 成都醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院內(nèi)科, 四川 成都 610500)

目的 探究綠茶多酚對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化抑制作用的效能及其機(jī)制，為冠心病的防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 選取1.5～2.0kg約2月齡的純種健康雄性新西蘭大白兔10只，隨機(jī)分為3組： 正常對(duì)照組:飼普通顆粒飼料(糖、蛋白質(zhì)及脂肪各占總熱量的62%、17%及21%)； 高脂飼料模型組:飼高脂飼料(7.5%蛋黃粉+1%膽固醇+3%豬油+88.5%普通顆粒飼料)，蛋黃粉開始足量，膽固醇和豬油逐次增加(+0.5%/次)，觀察兔子無腹瀉，進(jìn)食量可則加，約3天左右加一次，直至目標(biāo)劑量(膽固醇6%，豬油4%)； 高脂飼料綠茶多酚組:飼料同高脂飼料模型組+綠茶多酚100 mg·kg-1·d-1。 均單籠喂養(yǎng)，常規(guī)飲水，每天每只進(jìn)食總量控制在100～120g，連續(xù)喂養(yǎng)12周。實(shí)驗(yàn)?zāi)?經(jīng)耳緣靜脈取血，測定血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平；超聲檢查家兔髂外動(dòng)脈及其遠(yuǎn)端血管情況；取主動(dòng)脈組織，進(jìn)行AS斑塊面積及HE、MASSON染色檢測。結(jié)果 高脂飼料模型組家兔主動(dòng)脈內(nèi)膜充滿泡沫細(xì)胞，壁上可見斑塊；高脂飼料茶多酚組家兔主動(dòng)脈壁脂質(zhì)沉積相對(duì)較輕。結(jié)論 綠茶多酚可降低高脂飼料誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬動(dòng)物模型的血脂水平，緩解血管脂質(zhì)性變和纖維性變。

綠茶多酚； 動(dòng)脈粥樣硬化； 纖維素

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)及其并發(fā)癥，是發(fā)達(dá)國家首要的發(fā)病和死亡原因。在美國人群抽查顯示，目前有6000萬成年人患動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病，占每年所有死亡人數(shù)的42%。根據(jù)我國衛(wèi)生部全國統(tǒng)計(jì)年報(bào)資料顯示，從1989年～1996年的8年內(nèi)，我國城市和農(nóng)村冠心病死亡率分別升高53.4%和40.4%，仍在繼續(xù)升高[1]。AS是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)膳食中具有抗氧化作用食物和成分的消耗量與心血管疾病病死率呈顯著負(fù)相關(guān)[2]。綠茶作為我國一種被人們廣泛接受的飲品,其綠茶多酚的含量一般為15%～20%[3]。綠茶多酚(Green tea polyphenols，GTP)是綠茶中兒茶素類、黃酮類、酚酸類和花色素類化合物的總稱，其中兒茶素類含量最多，約占多酚類總量的65%～80%[4]。目前已有研究確認(rèn)了，綠茶多酚具有較強(qiáng)的抗氧化、減輕自由基損傷、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病等多種生物學(xué)作用[5]。進(jìn)一步探究綠茶多酚對(duì)AS抑制作用的效能及可能的機(jī)制，有助于闡明AS的發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、延遲和逆轉(zhuǎn)AS病變的進(jìn)展、開發(fā)及應(yīng)用多種保健基料復(fù)合的保健食品，乃至發(fā)現(xiàn)有效的潛在藥物靶點(diǎn)以及開發(fā)新型藥物。這對(duì)AS的診斷、治療和預(yù)防都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 家兔AS模型的建立與分組 純種健康雄性新西蘭大白兔10只，約2月齡，體重1.5～2.0kg，單籠喂養(yǎng)普通兔顆粒飼料一周后，空腹12小時(shí)，耳緣靜脈取血，測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C水平，血脂水平差異大者不作為實(shí)驗(yàn)用兔。實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分組： ①正常對(duì)照組:飼普通顆粒飼料(糖、蛋白質(zhì)及脂肪各占總熱量的62%、17%及21%)。 ②高脂飼料模型組:飼高脂飼料(7.5%蛋黃粉+1%膽固醇+3%豬油+88.5%普通顆粒飼料)，蛋黃粉開始足量，膽固醇和豬油逐次增加(+0.5%/次)，觀察兔子無腹瀉，進(jìn)食量可則加，3天加一次，直至目標(biāo)劑量(膽固醇6%，豬油4%)。 ③高脂飼料綠茶多酚組:飼料同高脂飼料模型組+綠茶多酚100 mg·kg-1·d-1。所有動(dòng)物均單籠喂養(yǎng)，常規(guī)飲水，每天每只進(jìn)食總量控制在100～120g，連續(xù)喂養(yǎng)12周，觀察動(dòng)物精神狀態(tài)，進(jìn)食、飲水及大小便情況，每周測體重，及時(shí)調(diào)整進(jìn)食量。

1.2 樣本采集

1.2.1 血清 實(shí)驗(yàn)?zāi)?，家兔深麻狀態(tài)下經(jīng)耳緣靜脈取血，用全自動(dòng)生化分析儀測定TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.2.2 血管超聲檢查 實(shí)驗(yàn)?zāi)彝蒙盥闋顟B(tài)下分別對(duì)其髂外動(dòng)脈及遠(yuǎn)端血管進(jìn)行超聲檢查。

1.2.3 主動(dòng)脈標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诓裳?，立即?jīng)耳緣靜脈注射過量水合氯醛處死家兔，剖開胸腹腔，游離主動(dòng)脈全長，剝離外膜脂肪組織，將主動(dòng)脈從根部分離至股動(dòng)脈遠(yuǎn)端，離斷并縱行剖開，生理鹽水沖洗干凈，鋪平攝像，肉眼觀察并記錄大體標(biāo)本的情況。圖像分析各組兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積。

1.2.4 主動(dòng)脈組織學(xué)標(biāo)本 取主動(dòng)脈弓動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處動(dòng)脈組織多塊，保存于4%多聚甲醛溶液中用于HE及MASSON染色檢測。

1.3 圖像分析 應(yīng)用倒置生物顯微鏡采集圖像，采用Image-Pro Plus多媒體彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，經(jīng)灰度變換將陽性染色與背景分開進(jìn)行自動(dòng)測量。

2 結(jié)果

2.1 GTP對(duì)AS兔血漿TC、TG、LDL-C及HDL-C含量的影響 與飼正常飼料兔相比，兔在連續(xù)飼高脂飼料12周后，兔血漿TG、TC、LDL-C及HDL-C含量均升高(TG：5.55倍；TC：31.33倍；LDL-C：33.06倍；HDL-C：4.36倍)，表明本實(shí)驗(yàn)中兔血脂處于高水平。與高脂飼料模型組兔相比，兔在連續(xù)給予高脂飼料+綠茶多酚12周后，高脂飼料綠茶多酚組兔血漿TG、TC含量顯著下降(P<0.01)，分別下降約50.9%、41.8%；LDL-C含量顯著下降了52.4%(P<0.05)，而HDL-C升高了約1.6倍(P<0.01)，見表1。

表1 綠茶多酚對(duì)AS兔12周血漿TC、TG、LDL-C及HDL-C含量的影響

注:與正常對(duì)照組比較①P<0.01;與高脂飼料模型組比較②P<0.05,③P<0.01

2.2 GTP對(duì)兔AS斑塊面積及病理形態(tài)學(xué)改變的影響 肉眼下，正常對(duì)照組：主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，未見明顯粥樣硬化斑塊(斑塊面積比：1.50%)；高脂飼料模型組：主動(dòng)脈內(nèi)膜的粥樣硬化病變嚴(yán)重，斑塊多融合成片，密布內(nèi)膜面(斑塊面積比：78.8%)，與正常對(duì)照組比較差異明顯(P<0.01)，表明實(shí)驗(yàn)中AS兔模型建立成功；高脂飼料綠茶多酚組：粥樣斑塊散在分布(斑塊面積比：15.3%),病變較高脂飼料模型組明顯減輕(P<0.01)，見圖1。

2.3 GTP對(duì)病理組織學(xué)改變的影響 正常對(duì)照組：血管內(nèi)皮下可見極少許吞噬脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞；高脂飼料模型組：血管內(nèi)皮下見較多泡沫細(xì)胞，其中見散在淋巴細(xì)胞和大片狀纖維斑塊形成；高脂飼料綠茶多酚組：泡沫細(xì)胞明顯減少，纖維斑塊消失，見圖2。

正常對(duì)照組：可見平滑肌和纖維蛋白共同存在，泡沫細(xì)胞區(qū)未見纖維素產(chǎn)生；高脂飼料模型組：纖維斑塊區(qū)可見較多紅色的纖維素沉積；高脂飼料綠茶多酚組：斑塊區(qū)紅染纖維素減少，見圖3。

Figure 1 Influence of green tea polyphenols on aorta atheromatous plaque

注：a:正常對(duì)照組；b:高脂飼料模型組；c:高脂飼料綠茶多酚組(與正常對(duì)照組比較P<0.01；與高脂飼料模型組比較P<0.01)

圖2 主動(dòng)脈組織(HE ×200)

Figure 2 aorta tissue(HE ×200)

注：a正常對(duì)照組；b高脂飼料模型組；c高脂飼料綠茶多酚組

2.4 血管超聲檢查 正常對(duì)照組：髂外動(dòng)脈及其遠(yuǎn)端血管管壁光滑，內(nèi)透聲性好，未見異常回聲；高脂飼料模型組：髂外動(dòng)脈近髂血管分叉處探及一高回聲斑，后方聲影不明顯，CDFI示：該處血流信號(hào)充盈缺損；高脂飼料綠茶多酚組：髂外動(dòng)脈及其遠(yuǎn)端血管管壁毛糙，內(nèi)透聲可，未見明顯硬斑聲像，見圖4。

圖3 主動(dòng)脈組織(Masson ×200)

Figure 3 aorta tissue(Masson ×200)

圖4 家兔髂外動(dòng)脈及其遠(yuǎn)端血管超聲檢查

Figure 4 Outside of rabbit iliac artery and its distal vessels by ultrasound

注：a正常對(duì)照組：髂外動(dòng)脈及其遠(yuǎn)端血管管壁光滑；b高脂飼料模型組：箭頭所示髂外動(dòng)脈探及一高回聲斑，CDFI：該處血流信號(hào)充盈缺損；c高脂飼料綠茶多酚組：髂外動(dòng)脈及其遠(yuǎn)端血管管壁毛糙

3 討論

鑒于AS及其并發(fā)癥是發(fā)達(dá)國家首要的發(fā)病和死亡原因，其預(yù)防及治療便成了現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)。

3.1 GTP對(duì)血脂水平的抑制 該研究顯示，高脂飼料綠茶多酚組兔血清TG、TC及LDL-C含量較高脂飼料模型組顯著下降，而血清HDL-C含量升高。有研究發(fā)現(xiàn)LDL在體內(nèi)被氧化修飾形成氧化型LDL(OX-LDL), OX-LDL通過一系列作用促進(jìn)粥樣斑塊的形成[6]。綠茶多酚分子中含有多個(gè)酚性羥基，使其具有較強(qiáng)的抗氧化能力。同時(shí)有研究顯示茶多酚的主要成分兒茶素能抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的LDL的氧化修飾，明顯降低其脂質(zhì)過氧化物的生成[7]。HDL可參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、清除，并能抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和血小板的凝集，同時(shí)有研究顯示HDL具有防止LDL氧化修飾的作用[8]。該實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與已有研究理論吻合。

3.2 GTP對(duì)血管脂質(zhì)性變及纖維性變的抑制 該研究中高脂飼料綠茶多酚組兔粥樣斑塊散在分布,病變較高脂飼料模型組明顯減輕，內(nèi)皮下吞噬脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞也明顯減少，纖維斑塊消失。已有研究發(fā)現(xiàn)[9]細(xì)胞因子IL-6由巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌,在AS斑塊中大量存在。這就可能是GTP通過抑制脂蛋白的氧化,減少炎癥因子生成量,從而達(dá)到抑制炎癥的發(fā)生或減輕炎癥程度以及縮短炎癥持續(xù)時(shí)間,進(jìn)而起到保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用。

3.3 超聲檢查評(píng)價(jià)GTP效能的可行性 對(duì)喂養(yǎng)12周家兔行血管超聲檢查示，高脂飼料綠茶多酚組家兔髂外動(dòng)脈及其分支遠(yuǎn)端血管管壁毛糙，內(nèi)透聲可，較高脂飼料模型組兔少見或未見明顯硬斑聲像。血管超聲檢查結(jié)果與病檢一致，故超聲檢查可用于GTP對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化抑制效能的評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

GTP對(duì)AS抑制作用過程中不僅作為抗氧化劑發(fā)揮其抗氧化作用外，還通過其他途徑防止動(dòng)脈粥樣硬化的形成。GTP對(duì)AS多危險(xiǎn)因素的綜合預(yù)防表現(xiàn)出良好的一級(jí)預(yù)防功效，非單一化學(xué)合成藥物所能替代。再結(jié)合其物理特性，GTP為天然提取物，無毒副作用，且水溶性較好。因此，可將GTP用于多種血管性預(yù)防保健食品的基料，發(fā)揮其預(yù)防保健功效，進(jìn)而為冠心病的預(yù)防尋得福音。該實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間有限，未能深入探究GTP在抗AS過程中所涉及到的機(jī)制。大量研究表明，在動(dòng)脈粥樣硬化部位及斑塊中可發(fā)現(xiàn)處于激活狀態(tài)的核因子κB(NF-κB)，而正常的血管很少或沒有NF-κB的表達(dá)[10]。NF-κB是否為基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子，在AS的形成過程中是否又發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，將是該課題接下來研究的重點(diǎn)。

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Inhibitory effect of green tea polyphenols on atherosclerosis in rabbit

TANG Xi1，GOU Bo1，LIU Hong1，etal

(1.DepartmentofMedicalImageology,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;2.DepartmentofInternalMedicine,ChengduMedicalCollegeHospital,Chengdu610500,China)

Objective To explore the effectiveness of green tea polyphenols on inhibition of atherosclerosis and possible mechanisms, for the prevention and treatment of coronary heart disease (CHD) to provide theoretical and experimental basis. Methods 10 healthy male New Zealand white rabbit (1.5-2.0 kg, 2 months) were randomly divided into Normal control group with ordinary granulated feed (sugar, protein and fat were 62%, 17% and 62% of total calories), High fat feed model group with high fat forage egg yolk powder (7.5% egg yolk powder + 1% lard +3% cholesterol, 88.5% ordinary granulated feed) and High-fat feed green tea polyphenols groups with high fat feedstuff model group + green tea polyphenol, mg·kg-1·d-1. At the end of the experiment, the ear vein blood, serum total cholesterol (TC), triglycerides (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL - C) and high-density lipoprotein cholesterol (HDL - C) level were measured. The rabbit iliac artery and its distal vessels were examined with ultrasound. The aorta tissue was stained with HE and MASSON. Results The aortic intima of high fat feed model group was full of foam cells. There were visible patches in the walls. The aortic lipid deposition of high-fat feed tea polyphenols group is relatively light. Conclusion Green tea polyphenols can reduce atherosclerosis induced by high-fat feed and relieve blood lipid change and fibrous.

Green tea polyphenols; Atherosclerosis; Cellulose

四川省衛(wèi)生廳科研課題(120472)

劉洪，Tel:(028)83016830。

R 972+.6

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.009

2015-06-18； 編輯： 張文秀)