白腐菌產(chǎn)漆酶活化木粉制備纖維板的力學(xué)性能1)

郁昭軒　王麗茹　康兆顏　韓松

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

周永鑫　　　　　　　朱曉冬　陳廣勝

(延邊林業(yè)集團科技產(chǎn)業(yè)處)　　　(生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)))

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白腐菌產(chǎn)漆酶活化木粉制備纖維板的力學(xué)性能1)

郁昭軒王麗茹康兆顏韓松

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

周永鑫朱曉冬陳廣勝

(延邊林業(yè)集團科技產(chǎn)業(yè)處)(生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)))

摘要利用白腐菌產(chǎn)漆酶的特性，優(yōu)化連續(xù)培養(yǎng)高活漆酶，使得大量培養(yǎng)漆酶成為可能。結(jié)果表明：在連續(xù)培養(yǎng)和直接培養(yǎng)兩種情況下，第11天時漆酶的酶活最高；利用連續(xù)培養(yǎng)白腐菌得到的大量的粗漆酶來處理木粉，活化其木質(zhì)素成分，使其能夠替代一部分的脲醛樹脂膠制備纖維板。靜曲強度上升了18.95%，彈性模量上升了35.49%，內(nèi)結(jié)合強度上升了44.11%。漆酶催化氧化了木質(zhì)素，增加了木質(zhì)纖維中化學(xué)鍵的數(shù)量，使木質(zhì)纖維之間的膠結(jié)點增多。與此同時，經(jīng)過漆酶處理的木粉增強了脲醛樹脂膠黏劑在纖維表面的滲透和擴散能力，提高了纖維板的力學(xué)性能。

關(guān)鍵詞白腐菌；漆酶；纖維板；力學(xué)性能

分類號TS653.5

Mechanical Properties of the Fiberboard from Production of Laccase from White Rot Fungus

Yu Zhaoxuan, Wang Liru, Kang Zhaoyan, Han Song

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Zhou Yongxin(Science and technology industry of Yanbian Forestry Group); Zhu Xiaodong, Chen Guangsheng(Key Laboratory of Bio-Based Material Science & Technology of Ministry of Education, Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(4)：86-89.

By using the characteristics of white rot fungus, we produced laccase, optimized the continuous culture of high activity laccase, and cultivated a large number of laccase. The eleventh day culture showed the highest laccase activity by continuous culture and direct culture methods. Enzyme treatment process can produce environmental protection board, which can solve the problem of formaldehyde pollution caused by indoor decoration. The properties of static bending strength, elastic modulus and interior bond strength were increased by 18.95%, 35.49% and 44.11%, respectively. The laccase catalyzed oxidation of lignin, and increased the number of chemical bonds in the fiber so that the bonding points between the wood fibers increased. Wood flour treated by the laccase enhanced urea formaldehyde resin adhesive in fiber surface penetration and diffusion capacity that increased mechanical property of the fiberboard.

KeywordsWhite rot fungus; Laccase; Fiber board; Mechanical property

人造板釋放的游離甲醛造成的室內(nèi)環(huán)境污染問題是近年來人們關(guān)注的焦點[1-3]。游離甲醛大多集中在人造板原材料的膠黏劑中，因此在人造板生產(chǎn)過程中采用無膠膠合或者對膠黏劑配方進行改進成為解決這一問題的突破口[4-6]。目前無膠膠合的方法主要有以下幾種：氧化結(jié)合法、自由基引發(fā)法、酸催化縮聚法、堿溶液活化法、天然物質(zhì)轉(zhuǎn)化法和酶處理法[7-8]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，可利用活性中心的銅離子催化氧化多種結(jié)構(gòu)的芳香化合物，同時將分子氧還原成水[9]。利用漆酶催化活化可以使木材自身組分產(chǎn)生膠合作用，或者利用漆酶催化活化工業(yè)木質(zhì)素生成一種與酚類化合物相似的膠黏劑，使得在人造板生產(chǎn)工藝中實現(xiàn)無膠膠合成為可能，為解決游離甲醛污染問題提供了可行的方法。國內(nèi)外研究人員用漆酶處理法進行試驗已取得一定的研究成果。Kharazipour等將纖維放置在溫度為25 ℃漆酶水溶液中,經(jīng)2～7 d培養(yǎng)后，烘干到含水率3%左右熱壓成纖維板，與對照板相比內(nèi)結(jié)合強度得到了一定的提高[10]。Yamaguchi等用漆酶處理纖維，得到了內(nèi)結(jié)合強度和靜曲強度都有了很大提高的中密度纖維板[11]。Febly等用漆酶活化山毛櫸木纖維，得到的中密度纖維板力學(xué)性能要優(yōu)于普通纖維板[12]。曹永健以楓香、思茅松纖維、漆酶和工業(yè)木質(zhì)素及其磺酸鹽為主要原料，用漆酶處理木纖維壓制纖維板，結(jié)果表明漆酶處理使纖維板的密度、吸水厚度膨脹率、內(nèi)結(jié)合強度均有一定程度的提高[12]。周冠武提出漆酶催化氧化楊樹木纖維的可能反應(yīng)機制，結(jié)果表明漆酶介導(dǎo)反應(yīng)不能直接觸及木質(zhì)素的大部分結(jié)構(gòu)域，因此低分子量可溶性木質(zhì)素可能重新附著到纖維表面，起著與膠黏劑類似的活性化合物的作用[13]。李振坤采用漆酶催化工業(yè)堿木質(zhì)素的方法，制備了可再生和環(huán)保的生物質(zhì)基漆酶/木質(zhì)素膠黏劑，并對漆酶催化木質(zhì)素的膠合機理進行了研究[14]。以上研究結(jié)果表明，用漆酶處理木纖維制成的纖維板可以提高產(chǎn)品的力學(xué)性能，但是大部分研究采用的都是商品漆酶，在生產(chǎn)中的成本較高，且產(chǎn)量不高。

漆酶在自然界分布十分廣泛，在很多植物、真菌和細菌的分泌物中均能找到漆酶[15-18]。白腐菌是一種絲狀真菌，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長很快，具有發(fā)達的菌絲體，經(jīng)過適當(dāng)?shù)墓に囂幚砜梢赃B續(xù)產(chǎn)出漆酶[19-20]。本研究針對白腐菌產(chǎn)漆酶的特性優(yōu)化培養(yǎng)高活漆酶，并且利用連續(xù)培養(yǎng)的技術(shù)，使得大量培養(yǎng)漆酶成為可能，從而進一步降低漆酶的生產(chǎn)成本，以替代傳統(tǒng)的高昂的商品漆酶。然后，利用培養(yǎng)白腐菌得到的大量的粗漆酶來處理木粉，通過活化木質(zhì)素，使其替代一部分脲醛樹脂膠黏劑以制造低甲醛釋放、產(chǎn)品力學(xué)性能高于普通纖維板的高性能人造板材。

1材料和方法

1.1材料

本實驗中培養(yǎng)的白腐菌的菌種為糙皮側(cè)耳菌。糙皮側(cè)耳菌相對于其他菌種優(yōu)勢在于更易培養(yǎng)，且生產(chǎn)酶活相對較高。脲醛樹脂膠采用市場購買的粉末狀固體脲醛樹脂膠(東莞市統(tǒng)耐樹脂有限公司生產(chǎn)的，M-101A型)，外觀為白色，黏度為2 500～3 500 MPa·s，25 ℃時m(膠)∶m(水)=2∶1，pH值為7.5，密度為1.22 g/cm3，細度為90%過80目篩。木粉采用市場購買的楊木木粉，目數(shù)為80目，產(chǎn)自黑龍江省綏化市雙豐林業(yè)局。木質(zhì)纖維原料采用市場上購買的柞木和楊木混合纖維，纖維的含水率為8%。

1.2白腐菌的優(yōu)化培養(yǎng)

本實驗選用的培養(yǎng)方法為模擬自然法[21]，即向培養(yǎng)基中添加天然物質(zhì)，模擬白腐菌生長的自然環(huán)境進行白腐菌的培養(yǎng)。實驗分為兩個培養(yǎng)基階段，其過程為：將白腐菌菌種放置在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱里進行活化，活化后接種在固體培養(yǎng)基上，在儀器溫度范圍為25～28 ℃的條件下恒溫培養(yǎng)。至白腐菌菌落長滿平板后，接種到液體培養(yǎng)基中，在儀器溫度范圍為25～28 ℃的條件下進行恒溫搖床培養(yǎng)，在搖床培養(yǎng)過程中，白腐菌生產(chǎn)漆酶。

1.3白腐菌的連續(xù)培養(yǎng)

在實驗過程中，由于對漆酶的需求量較大，且由于模擬自然法的常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的白腐菌需要較長的周期，并且有著染菌等一系列的問題，故如何在較短的時間內(nèi)培養(yǎng)出大量且產(chǎn)漆酶酶活較高的白腐菌成為重點和難點。連續(xù)培養(yǎng)的過程就是當(dāng)培養(yǎng)的第一批白腐菌酶活達到最高值時，將酶液濾出加入新的培養(yǎng)液，并按照優(yōu)化培養(yǎng)的方法繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4木粉和木質(zhì)纖維的活化處理

將木粉和木質(zhì)纖維原料分別與活化處理5 d的漆酶液進行混合。木粉、木纖維與漆酶液的配比混合比例均為m(木粉、木纖維)∶m(漆酶)=1∶2，將混合物攪拌均勻，放置在25～30 ℃的環(huán)境下靜置7 d。靜置期間隔天攪拌混合物，使混合物中漆酶與木質(zhì)素及氧氣充分接觸達到活化的效果。活化處理后的木粉、木質(zhì)纖維靜置后進行烘干，將木粉和木質(zhì)纖維烘至含水率為8%～10%，即氣干狀態(tài)待用。烘箱溫度設(shè)置在50 ℃，溫度達到50 ℃以上時，漆酶會失去活性。

1.5纖維板制作

將市場購置的脲醛樹脂膠黏劑與漆酶處理后的木粉以一定比例進行混合。漆酶活化后的木粉在熱壓反應(yīng)中其表面官能團會發(fā)生反應(yīng)，起到膠合作用，因此在本研究中用其替代一部分脲醛樹脂膠黏劑以達到膠合和降低成本的作用。實驗中采用的混合比例分別是：A為m(脲醛樹脂)∶m(木粉)=9∶1、B為m(脲醛樹脂)∶m(木粉)=6∶4、C為m(脲醛樹脂)∶m(木粉)=3∶7。二者混合后以施膠量為12%的比例與漆酶活化后的木質(zhì)纖維進行鋪裝，熱壓制成纖維板。熱壓溫度為120 ℃，熱壓時間為30 min，厚度為6 mm。在同樣的熱壓條件下，使用不加入木粉的脲醛樹脂膠對漆酶活化后的木質(zhì)纖維進行施膠，施膠量為12%，厚度為6 mm。

1.6纖維板性能測試

纖維板制作后放置在恒溫恒濕室中48 h，然后按照GB/T 11718—2009，釆用萬能力學(xué)實驗機測定其靜曲強度、彈性模量和內(nèi)結(jié)合強度。按照GB/T 17657—2013中的穿孔萃取法測試試件的甲醛釋放量。采用日本理學(xué)公司生產(chǎn)的D/MAX2200X射線衍射儀測定木質(zhì)纖維素的相對結(jié)晶度，掃描范圍為5°～40°，掃描速度為4°/min。

2結(jié)果與分析

2.1漆酶活性測試

利用漆酶氧化ABTS(2,2＇-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))，在可見紫外分光光度計測定波長為420 nm處0～15 s內(nèi)吸光度值隨時間的變化規(guī)律，求得漆酶氧化ABTS反應(yīng)速率，進而推算酶活(見表1)?？梢钥吹竭B續(xù)培養(yǎng)漆酶的酶活在前5 d的增速較快，到第5天就達到較高的酶活值。連續(xù)培養(yǎng)縮短了培養(yǎng)周期，可在相對較短時間得到大量高活漆酶。在連續(xù)培養(yǎng)和直接培養(yǎng)兩種情況下，第11天時漆酶的酶活最高。

表1　直接培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)的酶活測試結(jié)果

2.2纖維結(jié)晶度

采用X射線衍射儀測定不同培養(yǎng)時間漆酶處理木粉的相對結(jié)晶度。漆酶未處理木粉和漆酶培養(yǎng)3、5、7、9、11 d的木粉相對結(jié)晶度分別為55.32%、61.28%、64.36%、65.53%、65.79%、68.73%。從測試結(jié)果可以看出漆酶培養(yǎng)11 d的相對結(jié)晶度比漆酶未處理木粉高24.24%，比漆酶培養(yǎng)3 d木粉高12.15%。這是由于漆酶催化氧化了木質(zhì)素，提高了纖維素上羥基分子間和分子內(nèi)結(jié)合的可能，增加了木質(zhì)纖維中化學(xué)鍵的數(shù)量，使木質(zhì)纖維之間的膠結(jié)點增多。漆酶活化木粉相對結(jié)晶度的增加預(yù)示纖維板力學(xué)性能指標(biāo)的提高。

2.3漆酶處理纖維板與素板物理力學(xué)性能對比

首先，觀察漆酶處理纖維板與素板的外觀質(zhì)量，不同條件下制備的纖維板均沒有分層和鼓泡質(zhì)量缺陷。但是，隨著脲醛樹脂和木粉混合比例的變化，特別是當(dāng)混合比例為C時，纖維板試件的板邊開始變得松軟。總體來說試件均符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 11718—2009中規(guī)定的合格品的外觀質(zhì)量要求。漆酶處理纖維板與素板的物理力學(xué)性能如表2所示。

表2　漆酶處理纖維板與素板的物理力學(xué)性能測試結(jié)果

2.3.1靜曲強度

混合比例為A時壓制的纖維板的靜曲強度平均值為17.57 MPa，而素板的靜曲強度平均值為14.24 MPa，漆酶處理板的靜曲強度比素板上升了18.95%。但是隨著漆酶處理木粉比例的增大，靜曲強度經(jīng)過初期的上升后開始下降，當(dāng)混合比例為C時，試件的的靜曲強度平均值僅為3.76 MPa，遠低于素板的平均值。采用少量的漆酶處理木粉和脲醛樹脂膠黏劑混合制備纖維板時，經(jīng)過漆酶處理的木粉增強了脲醛樹脂膠黏劑在纖維表面的滲透和擴散能力，漆酶的作用明顯。與此同時，漆酶催化氧化了木質(zhì)素，增加了纖維中化學(xué)鍵的數(shù)量，使木質(zhì)纖維之間的膠結(jié)點增多，提高了最終纖維板的膠合性能。但是，隨著漆酶處理木粉添加量的提高，木粉對膠合性能的影響超過了漆酶的影響，木粉本身阻礙了木質(zhì)纖維之間的膠合，從而影響了纖維板的力學(xué)強度。

2.3.2彈性模量

經(jīng)漆酶處理的混合比例為A時壓制的纖維板的彈性模量平均值為1 586.30 MPa，而素板的彈性模量平均值為1 023.29 MPa，漆酶處理板的彈性模量比素板上升了35.49%。但是隨著漆酶處理木粉比例的增大，彈性模量經(jīng)過初期的上升后開始下降；當(dāng)混合比例為C時，試件的靜曲強度平均值僅為368.45 MPa，遠低于素板的平均值。

2.3.3內(nèi)結(jié)合強度

經(jīng)漆酶處理的混合比例為A時壓制的纖維板的內(nèi)結(jié)合強度平均值為0.34 MPa，而素板的內(nèi)結(jié)合強度平均值為0.19 MPa，漆酶處理板的內(nèi)結(jié)合強度比素板上升了44.11%。但是隨著漆酶處理木粉比例的增大，內(nèi)結(jié)合強度經(jīng)過初期的上升后開始下降；當(dāng)混合比例為C時，試件的的內(nèi)結(jié)合強度平均值僅為0.07 MPa，遠低于素板的平均值。

2.3.4甲醛釋放量

經(jīng)漆酶處理過的木粉制備的纖維板甲醛釋放量均低于素板的甲醛釋放量，小于90 μg/g，達到了國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的E1級標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)混合比例為C時，纖維板試件的甲醛釋放量平均值為57.9 μg/g，比素板的甲醛釋放量降低了30.8%。

3結(jié)論

連續(xù)培養(yǎng)漆酶的酶活在前5 d的增速較快，到第5天就達到較高的酶活值。連續(xù)培養(yǎng)縮短了培養(yǎng)周期，可在相對較短時間得到大量高活漆酶。利用連續(xù)培養(yǎng)白腐菌得到的大量的粗漆酶來處理木粉，活化其木質(zhì)素成分，增加了木粉中化學(xué)鍵的數(shù)量，使膠結(jié)點增多，可以替代一部分的脲醛樹脂膠。以適當(dāng)?shù)谋壤齧(脲醛樹脂)∶m(木粉)=9∶1將二者混合后與漆酶活化后的木質(zhì)纖維熱壓制成纖維板，力學(xué)性能都有所提高。

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收稿日期：2015年10月21日。

作者簡介：第一郁昭軒，男，1994年3月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，本科生。E-mail：18745012652@qq.com。通信作者：陳廣勝，生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，教授。E-mail：kjc_chen@163.com。

1)國家自然科學(xué)基金面上項目(31170515)、高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(博導(dǎo)類)(20130062110012)、東北林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(201410225157)。

責(zé)任編輯：戴芳天。