CD59 RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株A2780的構(gòu)建

臧金林， 李紅梅， 方建紅， 周東風(fēng)

臨床與基礎(chǔ)研究

CD59 RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株A2780的構(gòu)建

臧金林， 李紅梅， 方建紅， 周東風(fēng)

目的 獲得攜帶針對(duì)人CD59基因 pSUPER retro RNAi 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的卵巢癌細(xì)胞株A2780。方法 設(shè)計(jì)能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向CD59小發(fā)夾RNA (shRNA)轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒，構(gòu)建pSUPER-siCD59重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞株A2780內(nèi)。鑒定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株能形成穩(wěn)定的擴(kuò)增。 結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)PCR凝膠電泳、核苷酸測(cè)序證實(shí)與設(shè)計(jì)序列一致；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株A2780，可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白。結(jié)論 攜帶針對(duì)人CD59基因 pSUPER retro RNAi 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的卵巢癌細(xì)胞株A2780的建立為深入進(jìn)行腫瘤細(xì)胞研究奠定了基礎(chǔ)。

siRNA； CD59； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體； 卵巢癌細(xì)胞株A2780

CD59與腫瘤的無(wú)序生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-3]。諸多相關(guān)研究證實(shí)，在腸道、卵巢、前列腺癌、非何杰金淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞膜表面存在CD59 等一系列的膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，使得腫瘤細(xì)胞逃脫了自身的免疫監(jiān)視以及靶向單抗治療中由補(bǔ)體介導(dǎo)的溶細(xì)胞作用[2,4-6]。本研究利用小干擾RNA技術(shù)，將攜帶靶向CD59基因發(fā)夾狀短鏈RNA導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞株A2780細(xì)胞，并觀察細(xì)胞株的穩(wěn)定擴(kuò)增，以為篩選穩(wěn)定擴(kuò)增的轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞株A2780細(xì)胞，進(jìn)一步研究補(bǔ)體介導(dǎo)的溶細(xì)胞活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人類卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、大腸桿菌JM109及兔抗A2780細(xì)胞多抗由本實(shí)驗(yàn)室保存，pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院羅兵教授提供，限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司，Lipofectamne 2000轉(zhuǎn)染試劑和總RNA提取試劑盒來(lái)自Invitrogen，Access RT-PCR A1250試劑盒來(lái)自Promega，靶向CD59的60bp oligos由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 靶向CD59基因發(fā)夾狀短鏈RNA設(shè)計(jì) 應(yīng)用美國(guó)Oligo Engine公司提供的siRNA設(shè)計(jì)軟件及參照pSUPER載體說明書構(gòu)建能有效抑制CD59基因表達(dá)的載體，選出1條針對(duì)CD59基因小發(fā)夾RNA序列作為實(shí)驗(yàn)組。如下：5′-GATCCCCTGAGCTAACGTACTACTGCTTCAAGAGAGCAGTAGTACGTTAGCTCATTTTTA-3′，As 5′-AGCTTAAAAATGAGCTAACGTACTACTGCTCTCTTGAAGCAGTAGTAC GTTAGCTCAGGG-3′。帶下劃線的序列為靶序列，之間為SPACE區(qū)，兩端為BglⅡ和HindⅢ兩個(gè)酶切粘性末端，可與 BglⅡ和HindⅢ兩個(gè)酶切后的 pSUPER retro載體進(jìn)行連接。

1.3 重組載體的構(gòu)建 選用美國(guó)Oligo Engine公司的有BglⅡ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)的pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒作為載體，經(jīng)過寡核苷酸鏈退火，BglⅡ和HindⅢ兩個(gè)酶酶切，在T4DNA酶作用下與上述合成的小發(fā)夾RNA雙鏈連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒。在大腸桿菌 JM109里轉(zhuǎn)化。經(jīng)過抽提純化。

1.4 重組載體的鑒定 根據(jù)pSUPER retro neo+gfp質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，具體如下：pSUPER-a：5′-CCTTTATCCAGCCCTCACTC-3′，pSUPER-s：5′- AGACTGCCTTGGGAAAAG CG-3′。其擴(kuò)增產(chǎn)物為395 bp，包含嵌入的60 nt寡核苷酸序列和其兩側(cè)翼序列。將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.5 感染卵巢癌A2780細(xì)胞 Phoenix A用DMEM常規(guī)培養(yǎng)。按說明書利用Lipofectine 2000將pSUPER-siCD59質(zhì)粒導(dǎo)入Phoenix A細(xì)胞。分為正常細(xì)胞組、實(shí)驗(yàn)組(T)和對(duì)照組(C)共3組。24 h后，觀察綠色熒光，估算轉(zhuǎn)染效率。分別于轉(zhuǎn)染后72 h 收集病毒上清，在醋酸纖維素膜上過濾。收集培養(yǎng)的A2780細(xì)胞，在Polybrene作用下感染A2780細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染后48 h收獲A2780細(xì)胞的mRNA和蛋白。采用Access RT-PCR A1250試劑盒進(jìn)一步檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)。在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。在凝膠呈像系統(tǒng)照相，觀察CD59mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒靶序列鑒定 取3 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示，395 bp的條帶為陽(yáng)性質(zhì)粒，將陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)合成的序列完全吻合(見圖1)。

圖1 陽(yáng)性質(zhì)粒CD59基因小發(fā)夾RNA序列測(cè)序圖

2.2 轉(zhuǎn)染卵巢癌A2780細(xì)胞株鑒定以及RT-PCR鑒定結(jié)果 卵巢癌細(xì)胞CD59蛋白染色為棕黃色，結(jié)果顯示CD59著色主要定位于細(xì)胞膜，也可見于細(xì)胞漿(圖2A)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組A2780細(xì)胞(圖2B為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，圖2C為轉(zhuǎn)染pSUPER-siCD59重組載體組；圖2D為轉(zhuǎn)染pSUPER-siCD59-C對(duì)照組)綠色熒光蛋白的表達(dá)，每孔尋找3個(gè)具有代表性的視野，各觀察100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出各孔載體轉(zhuǎn)染效率均約為70%。RT-PCR方法檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)。取2 μl RT-PCR產(chǎn)物上樣，行凝膠電泳。在凝膠呈像系統(tǒng)照相。電泳結(jié)果顯示CD59基因在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)降低，正常細(xì)胞組及對(duì)照組CD59的mRNA表達(dá)量基本一致 (圖3)。

圖2 CD59蛋白在卵巢癌組織中高表達(dá)及重組載體轉(zhuǎn)染效果圖

圖3 pSUPER-siCD59 mRNA RT-PCR結(jié)果

3 討論

1998年由SUGITA等[7]人發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一種以糖基磷酸酯肌醇(GPI)錨定于細(xì)胞膜表面的糖蛋白，即CD59，又名保護(hù)素，膜反應(yīng)性溶破抑制劑等。CD59目前已知有兩個(gè)重要功能[8-9]：(1)通過干擾C8和(或)C9相互作用，C9多聚化或C9插入細(xì)胞膜內(nèi)阻止補(bǔ)體攻膜復(fù)合物(MAC)形成。(2)作為CD2天然配體，參與T細(xì)胞激活和粘附。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)在腸道、卵巢及前列腺等多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中有CD59 分子的高表達(dá)，并與腫瘤的失控性生長(zhǎng)和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[10]。因此使補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白不表達(dá)，或者失活，無(wú)疑是一種腫瘤治療策略。

RNA干擾(RNAi)是指一種由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。dsRNA被Dicer 酶加工后產(chǎn)生的RNA或者miRNA可以引導(dǎo)沉默復(fù)合物找到與其有互補(bǔ)序列的mRNA并且與其結(jié)合，通過Ago酶的作用剪切靶向mRNA,從而達(dá)到在轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因的目的。RNAi不但是一種有效的研究工具，還具有優(yōu)秀的臨床應(yīng)用前景。所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病(如HIV)及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。shRNA介導(dǎo)的基因沉默具有高度特異性[11-14]。目前認(rèn)為以載體為基礎(chǔ)的shRNA表達(dá)系統(tǒng)在抑制基因表達(dá)方面比siRNA而言具有效率高、費(fèi)用低、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。慢病毒載體具有可感染分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞。目的基因整合至靶細(xì)胞基因組后具有可長(zhǎng)期穩(wěn)定目的基因表達(dá)、轉(zhuǎn)染效率很高、生物安全性高、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，有望成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體[15]。我們建立了無(wú)輔助病毒的親嗜性和兼親嗜性包裝細(xì)胞Phoenix A做為慢病毒載體，其可識(shí)別一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的受體。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒導(dǎo)入Phoenix A。這種方法較以前大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，步驟簡(jiǎn)化，效率高。本實(shí)驗(yàn)成功地將pSUPER-siCD59導(dǎo)入包裝細(xì)胞Phoenix A，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過重組質(zhì)粒pSUPER-siCD59經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Phoenix A，再進(jìn)一步感染A2780細(xì)胞。pSUPER帶有熒光，經(jīng)過包裝后的重組質(zhì)粒感染A2780細(xì)胞后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功。RT-PCR方法檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)，電泳結(jié)果顯示CD59基因在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)降低。說明我們?cè)O(shè)計(jì)的小干涉RNA在卵巢癌A2780細(xì)胞株增值過程中已經(jīng)起到作用。成功獲得pSUPER-siCD59-A2780細(xì)胞株后，在分子水平上為進(jìn)一步研究補(bǔ)體介導(dǎo)的溶細(xì)胞活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of ovarian cancer cell line A2780 transfected with human RNAi CD59 retroviral vector

ZANGJinlin1,LIHongmei1,FANGJianhong2,ZHOUDongfeng1.

(1.DepartmentofGeneralSurgery,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266011,China; 2.DepartmentofObstetricsandGynecology,People’sHospitalofChengyangDistrict,Qingdao266000,China)

Corresponding author:FANGJianhong,E-mail:fjhqd@163.com

Objective To construct and screen the stable cell clone of pSUPER gene retro RNAi of CD59 in A2780 by using the expression vector of siRNA. Methods 60 bp oligonucleotide sequences targeting CD59 RNA were cloned into pSUPER retro neo+gfp plasmid, and the recombinant plasmid was transfected into ovarian cancer cell line A2780. The stable cell clones can be formed after the transfection. Results The recombinant vector was identified by PCR and restriction enzyme digestion. The recombinant vector was transfected into ovarian cancer cell line A2780, which can be stably expressed in green fluorescent protein. Conclusions pSUPER retro RNAi of CD59 gene in A2780 was established as a basis for further study on human ovarian cancer.

siRNA; CD59; Retroviral vector; Ovarian cancer cell A2780

266011 山東 青島，青島青島市市立醫(yī)院 普外科(臧金林，李紅梅，周東風(fēng))；266000 山東 青島，

青島市城陽(yáng)人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科(方建紅)

臧金林，男，主治醫(yī)師，研究方向：結(jié)直腸腫瘤基礎(chǔ)與臨床，E-mail: talkxyz@163.com

方建紅，女，副主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤基礎(chǔ)研究與臨床治療，E-mail: fjhqd@163.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.01.010

1674-4136(2016)01-0033-04

2015-11-12][本文編輯：李 慶]