結腸癌組織Wnt/PCP信號通路相關因子表達及其意義

孟道林， 何躍君， 徐 海， 陳衛(wèi)花， 王 建

臨床與基礎研究

結腸癌組織Wnt/PCP信號通路相關因子表達及其意義

孟道林， 何躍君， 徐 海， 陳衛(wèi)花， 王 建

目的 探討Wnt/PCP信號途徑中Wnt7a、JNK和RhoA在結腸腫瘤組織中的表達和意義。方法 選取徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院2012年3月至2015年3月經(jīng)病理學確診并行根治性手術的結腸癌石蠟標本共62例，同時分別選取癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5cm)和良性結腸腺瘤62例作為對照組。采用免疫組化方法檢測Wnt/PCP信號途徑中Wnt7a、JNK和RhoA在結腸癌組織、結腸腺瘤和正常結腸組織中的表達情況，分析其與結腸癌臨床病理參數(shù)的關系。結果 Wnt7a、JNK和RhoA在結腸癌組織中均高表達，明顯高于癌旁正常組織和腺瘤組(P<0.05)，三者在結腸癌臨床分期Ⅲ+Ⅳ期中的表達明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，有淋巴結轉移組的表達明顯高于無淋巴結轉移組(P<0.05)。結論 Wnt/PCP信號途徑中Wnt7a、JNK和RhoA蛋白在結腸癌組織中高表達，可能與結腸癌的發(fā)生發(fā)展有關系，并有可能成為腫瘤靶向治療的潛在靶點。

結腸癌； Wnt/PCP； 信號傳導； 免疫組織化學； 治療靶點

結腸癌在我國分別占女性和男性惡性腫瘤的第3位和第4位，盡管在早期診斷和治療方面取得了一些進展，但發(fā)病率和死亡率卻在逐年上升，因此，進一步明確結腸癌的發(fā)生發(fā)展機制并尋找有效的防治措施仍是我們需要解決的難題。Wnt信號途徑調(diào)節(jié)控制著許多生命過程，參與細胞的癌變、增殖、分化、凋亡等[1-6]。大量數(shù)據(jù)證實腫瘤的發(fā)生與典型Wnt途徑產(chǎn)生的穩(wěn)定的β-鏈蛋白(β-catenin)有關，與此同時越來越多的證據(jù)表明其他途徑如Ca2+通道、G蛋白等也在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用[7]。其中，Wnt/PCP(plnercellpolarity)途徑主要通過激活Dvl下游區(qū)、Rac、小GTP酶、RhoA和Cde42等，從而激活c-jun氮端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)來發(fā)揮作用，該途徑是否與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關需要進一步的研究。我們前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，Wnt/PCP信號途徑中重要因子Wnt7a、JNK和RhoA在大鼠結腸腫瘤組織中高表達，提示其可能參與大鼠結腸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究進一步以人結腸癌組織為實驗對象，采用免疫組織化學方法檢測其中Wnt7a、JNK、RhoA蛋白的表達情況，觀察人結腸癌的形成過程中是否也有Wnt/PCP信號通路的參與。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院2012年3月至2015年3月經(jīng)病理學確診并行根治性手術的結腸癌石蠟標本共62例，男37例，女25例；年齡32～84歲，中位年齡68歲；高分化腺癌14例，中分化腺癌20例，低分化腺癌28例；有淋巴結轉移36例，無淋巴結轉移26例；根據(jù)TNM分期的臨床病理分期Ⅰ+Ⅱ期24例，Ⅲ+Ⅳ期38例。所有病例術前均未行放、化療。另分別選取癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)和良性結腸腺瘤62例作為對照組。

1.2 主要試劑 兔抗人Wnt7a、RhoA單克隆抗體和JNK多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，免疫組化SP試劑盒(北京中杉金橋)，DAB顯色試劑盒(福州邁新)。

1.3 免疫組化 取結腸癌組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、抗原修復后，采用SP法免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精復染后脫水、透明、封片。PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定標準 Wnt7a、JNK和RhoA表達于細胞的胞質和(或)胞核，陽性細胞內(nèi)可見清晰黃色顆粒。根據(jù)顯色程度判斷陽性程度，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。觀察陽性細胞數(shù)在視野下細胞中所占的百分率，陽性細胞個數(shù)<25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。將陽性細胞百分比和著色強度兩者的計分相加，0～1分為陰性(-)，≥2為陽性(+)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理，陽性率以百分比表示，兩樣本間采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Wnt7a、JNK和RhoA的表達 Wnt7a、JNK和RhoA陽性反應主要定位于細胞漿和(或)細胞核，胞漿可見黃色或棕黃色顆粒。Wnt7a在正常結腸組織和結腸腺瘤中的陽性表達率分別為24.2%(15/62)和35.5%(22/62)，在結腸癌組織的陽性表達率為74.2%(46/62)，癌變組陽性表達率高于腺瘤組(P=0.000)和正常組(P=0.000)，腺瘤組與正常組陽性表達率相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.239)。JNK在正常結腸組織和結腸腺瘤中的陽性表達率分別為25.8%(16/62)和38.7%(24/62)，在結腸癌組織的陽性表達率為74.2%(46/62)，癌變組陽性表達率明顯高于腺瘤組(P=0.000)和正常組(P=0.000)，腺瘤組與正常組陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.178)。RhoA在正常結腸組織和結腸腺瘤中的陽性表達率分別為29.0%(18/62)和40.3%(25/62)，在結腸癌組織的陽性表達率為80.6%(50/62)，癌變組陽性表達率明顯高于腺瘤組(P=0.000)和正常組(P=0.000)，腺瘤組與正常組陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.257)。

2.2 與臨床病理因素的關系 結腸癌組織中Wnt7a的陽性表達與患者的性別、年齡、病理分化程度無關(P>0.05)，與是否有淋巴結轉移及腫瘤的臨床分期相關(P<0.05)。JNK的陽性表達與性別、年齡、病理分化程度無關(P>0.05)，與是否有淋巴結轉移及腫瘤的臨床分期相關 (P<0.05)。RhoA的陽性表達與性別、年齡、病理分化程度無關(P>0.05)，與是否有淋巴結轉移及腫瘤的臨床分期相關 (P<0.05)。見表1。

表1 Wnt7a、JNK和RhoA蛋白表達和結腸癌臨床病理參數(shù)的關系

3 討論

隨著科學技術的發(fā)展和治療模式的改變，有學者提出腫瘤分子病理分期的概念[9]，即運用分子生物學知識對腫瘤從分子水平重新認識，這將使腫瘤的治療更貼近腫瘤的生物學發(fā)展原理，改變腫瘤以往的治療策略，提高患者的生存率及改善預后。最近，腫瘤的靶向治療正在興起，以其高選擇性、低毒性的優(yōu)勢正成為腫瘤治療研究的熱點。

Wnt通路是一條對控制發(fā)育起重要作用的信號途徑，在進化上具有高度保守性，從低等生物果蠅到高等哺乳動物，其成員都具有高度的同源性，Wnt信號的某些異?；罨c多種組織細胞癌變、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及腫瘤侵襲過程有密切聯(lián)系[10-14]。根據(jù)Wnt信號蛋白傳遞方式不同，Wnt信號通路分為3條途徑：(1)經(jīng)典Wnt信號途徑，即Wnt/β-catenin信號途徑。此通路是目前研究最明確的通路，其在胚胎發(fā)育和腫瘤中的作用已基本闡明，因此被公認為新的抗癌治療分子靶點[11-14]。(2)Wnt/Ca2+途徑。此通路主要由Wnt5a或Wnt11激活，調(diào)節(jié)細胞運動和黏著性，同時能拮抗經(jīng)典Wnt信號通路，發(fā)揮抑癌作用[15-16]。(3)平面細胞極性(PCP)途徑，即Wnt/PCP途徑。在脊椎動物中又稱Wnt/JNK途徑，主要通過激活Dvl下游區(qū)、Rac、小GTP酶、RhoA和Cde42等，從而激活JNK來發(fā)揮作用，在胚胎發(fā)育階段調(diào)控細胞骨架的重排，并參與原腸胚形成[17-18]。

JNK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，JNK基因包括：JNK1，JNK2和JNK3。JNK1和JNK2在哺乳動物全身組織中表達廣泛，而JNK3只表達于心、腦和睪丸[19]。JNK基因編碼產(chǎn)生相對分子質量為46×103和55×103的2種蛋白質[20]。JNK參與多種生理過程的調(diào)控，如細胞生長、細胞分化、細胞死亡和癌基因轉化[19-20]。多種刺激信號，如細胞因子和炎性介質等，可介導JNK基因的磷酸化進入活化狀態(tài)，活化的JNK激活下游Elk-1、c-Jun等信號分子，從而在細胞增殖和轉化、細胞周期調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮重要作用[21]。研究表明，JNK與腫瘤的發(fā)生有關，在多種惡性腫瘤如甲狀腺癌、食管癌、胃癌和乳腺癌中存在不同JNK基因的高表達或者突變[22-23]。同時有研究表明JNK會促進腫瘤的侵襲和轉移。RYOKO等[24]通過RNA干擾降低JNK的表達和加入JNK抑制劑阻斷JNK信號通路后發(fā)現(xiàn)，HeLa細胞的體外遷移和侵襲能力明顯減低。JNK促進大腸癌侵襲和轉移機制可能為JNK通過激活其下游成員使大腸癌MMP的分泌增加、細胞-細胞黏附力下降而導致大腸癌細胞的運動和侵襲力增加，最終促進癌細胞的轉移[25]。

本研究通過免疫組化在蛋白水平上觀察了結腸癌組織、結腸腺瘤組織和正常結腸組織中Wnt7a、JNK和RhoA的表達情況。我們發(fā)現(xiàn)在結腸癌組織中Wnt7a、JNK和RhoA的表達明顯高于正常結腸組織和結腸腺瘤組(P<0.05)，有淋巴結轉移的標本明顯高于無淋巴結轉移的標本(P<0.05)，臨床病理分期Ⅲ+Ⅳ期的腫瘤組織也明顯高于Ⅰ+Ⅱ期的腫瘤組織(P<0.05)，但Wnt7a、JNK和RhoA的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤的分化程度無關(P>0.05)。這與之前關于JNK的研究結果一致，并且發(fā)現(xiàn)Wnt7a和RhoA的表達情況與JNK一致。而我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠結腸癌和結腸非典型增生組織中Wnt/PCP信號途徑中的重要因子Wnt7a、JNK和RhoA無論從蛋白質水平還是mRNA水平都是高表達的[8]。因此我們推測在Wnt/PCP信號途徑中，上述因子在結腸癌形成過程中起到非常重要的作用，并有可能成為腫瘤靶向治療的潛在靶點。但其參與結腸癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機制仍需進一步的探討。

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Expression of Wnt7a,JNK and RhoA in Wnt/PCP signal pathway in the tissue of colonic neoplasms

MENGDaolin，HEYuejun，XUHai，CHENWeihua，WANGJian.

(DepartmentofGeneralSurgery,theSecondHospitalAffilatedtoXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221006,China)

Corresponding author:WANGJian,E-mail:15005206620@163.com

Objective To investigate the expression of Wnt7a,JNK and RhoA in Wnt/PCP signal pathway in human colon cancer and their clinical significance.Methods Expression of Wnt7a,JNK and RhoA in 62 colon cancer tissue and colonic adenoma tissue and normal colon tissue samples were detected by immunohistochemical assay.Their relation with the clinicopathological characteristics of colon cancer was studied．Results Immunohistochemistry demonstrated that Wnt7a,JNK and RhoA were mainly located in the cancer cells nuclear and/or cytoplasm.The results showed that the expression of Wnt7a,JNK and RhoA was significantly higher in tumor tissue than colonic adenoma and normal tissue (P<0.05).Meanwhile，the expression was markedly higher in clinical stage Ⅲ+Ⅳ than in clinical Ⅰ+Ⅱ(P<0.05)，in the cases with lymph node metastasis than those without metastasis (P<0.05). Conclusion The positive rate of expression of Wnt7a,JNK and RhoA protein in Wnt/PCP signaling pathway in colonic neoplasms tissues is higher than that in colonic adenoma tissue and normal colon tissue.These factors probably play an important role in the forming process of colonic neoplasms.

Colon cancer； Wnt/PCP； Cell signalling； Immunohistochemistry； Therapeutic target

221006 江蘇 徐州，徐州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 普外科

孟道林，男，碩士研究生，研究方向：消化道腫瘤，E-mail:414804500@qq.com

王 建，男，主任醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤，E-mail:15005206620@163.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.01.006

1674-4136(2016)01-0019-04

2015-09-07][本文編輯：李 慶]