鹽酸小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的作用

梁寶今　蒙如慶　周卓東　梁濤

[摘要]目的 觀察鹽酸小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的作用，以探討鹽酸小檗堿促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法25 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L濃度小檗堿分別干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞1 h、2 h、4h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTr法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，Western Blot方法檢測(cè)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)。結(jié)果 不同濃度鹽酸小檗堿作用于大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可顯著抑制其增殖（P<0.001）；鹽酸小檗堿與大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞作用24 h，促凋亡蛋白BAX隨濃度增加而上調(diào)（P<0.001）。結(jié)論 鹽酸小檗堿可抑制大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并上調(diào)促凋亡蛋白BAX水平。

[關(guān)鍵詞]鹽酸小檗堿；主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；凋亡

鹽酸小檗堿亦稱黃連素，是毛茛科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖中的主要成分，屬于異喹啉類生物堿，臨床上多用于抗腸道細(xì)菌感染。近年來小檗堿的研究越來越廣泛，包括降糖、降脂、內(nèi)皮依賴性舒張血管、誘導(dǎo)自噬、神經(jīng)性疾病的治療等方向。內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡即內(nèi)皮細(xì)胞的程序性壞死，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可抑制血管新生導(dǎo)致血管退化。目前，通過抑制腫瘤血管新生治療腫瘤的方式已成為新的研究方向。

1.材料與方法

1.1主要試劑與儀器 鹽酸小檗堿（分子式：C20H18C1N04，分子量：371.81，CAS號(hào)：633-65-8）：阿拉丁試劑公司：大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株：清華大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；PRMI.1640培養(yǎng)基：Gibico公司；噻唑蘭（MrlT）：凱基生物試劑公司；胎牛血清：Hyclone公司；BAX：SANTA公司；beta-actin：ABJENT；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體BCA試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜：碧云天公司；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀Muhiskan MK3：Thermo公司；電泳槽、電泳儀、凝膠成像儀：BIO-RAD。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng) 將凍存于液氮的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞解凍、1000轉(zhuǎn)/分離心3 min，并在含10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞長到80%左右，用0.25%胰酶（含EDTA）消化傳代。在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)、形態(tài)，選取狀態(tài)優(yōu)良的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)體外試驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)鹽酸小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 對(duì)消化的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×104細(xì)胞/孔加入96孔板中，每孔200 uL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后加人不同濃度的鹽酸小檗堿（0umol/L、25umol//L，50umol//L、75umol//L、100umol//L），每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。培養(yǎng)結(jié)束棄上清，避光加人M1Tr溶液（終濃度5 mg/m1），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄細(xì)胞上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150uL，于恒溫振蕩箱反應(yīng)10 min以充分溶解。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)吸光度OD值。

1.2.3Western Blot檢測(cè)BAX蛋白 25 umol/L、50umol//L、75umol//L、100umol//L濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后.用100：1的RIPA/PMSF混合液提取各組細(xì)胞總蛋白，注意冰上操作，以減輕蛋白裂解；使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，酶標(biāo)儀562 nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算出蛋白的質(zhì)量。每個(gè)樣品加5xSDS 25uL，100℃沸水中變性。分別從每組中取總蛋白25ug制備蛋白上樣，進(jìn)行12%SDS-PAGE膠電泳，連接正負(fù)極，加滿電泳液，開始使用80 V電壓.跑30 min后把電壓改為120 V.樣本繼續(xù)跑1 h，直到溴酚藍(lán)跑出玻璃板。PVDF膜轉(zhuǎn)膜，電泳槽置冰上，100 V電壓跑75 min。麗春紅染色并用去離子水清洗，配一抗、二抗稀釋液（水：casein=20：1），抗體濃度為（1：1000），一抗4℃過夜，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用碧云天ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光，通過凝膠成像儀顯影，并用imageJ進(jìn)行灰度值分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用成組設(shè)計(jì)的單因素方差分析，3個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較的q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)：a=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

2.1不同濃度小檗堿在不同干預(yù)時(shí)間作用下的OD值 使用25umol//L、50umol/L、75 umol/L、100umol/L濃度小檗堿分別干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞1h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTY法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性結(jié)果。由表1、圖1可見，與對(duì)照組（0umol/L）相比，25umol//L、50 umol/L、75umol/L、100 umol/L濃度小檗堿作用8 h、12 h、24 h、48 h、72h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制增殖活性的作用。不同濃度作用12 h、24 h OD值變化較明顯，且這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)效果相似，故選取12 h作為最適作用時(shí)間。其中各濃度作用1 h、2 h，內(nèi)皮細(xì)胞抑制率低于10%；4 h、8 h內(nèi)皮細(xì)胞抑制率低于25%；12 h、24 h、48 h、72 h內(nèi)皮細(xì)胞抑制率為31%-62%，其中72小時(shí)100umol/L小檗堿作用內(nèi)皮細(xì)胞抑制率可達(dá)到62%。

2.2不同濃度鹽酸小檗堿處理后BAX蛋白表達(dá)水平 不同濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，Western Blot結(jié)果如圖2所示。可見25umol/L、50umol//L、75umol/L、100umol/L濃度小檗堿促進(jìn)促凋亡蛋白BAX水平的表達(dá).但是未見濃度依賴性。

3.討論

3.1鹽酸小檗堿可抑制大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖

細(xì)胞凋亡可抑制血管新生過程，導(dǎo)致血管退化。本研究主要以不同濃度的鹽酸小檗堿作用于大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察其增殖活性及檢測(cè)促凋亡蛋白BAx的表達(dá).探討鹽酸小檗堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為抑制血管新生過程的研究提供理論基礎(chǔ)。使用25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L濃度小檗堿分別干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h，可見12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.提示小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制增殖活性的作用。但是，作用1 h、2 h、4 h療效不顯著，可能與藥物在內(nèi)皮細(xì)胞的代謝有關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是腫瘤血管形成最關(guān)鍵的生長因子，研究表明，HIF-1A可以誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)增加，并且可以引起腫瘤組織的微血管密度增加，在腫瘤新生血管形成過程中有著重要的作用。小檗堿不僅可以顯著抑制腫瘤血管增殖，降低胞內(nèi)ROS水平，而且在維生素E存在時(shí)可完全清除腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生血管，提示了小檗堿具有抑制腫瘤血管形成的特性。

3.2鹽酸小檗堿可上調(diào)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)不同濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果可見25 umol/L、50 umo]/L、75 umol/L、100 umol/L濃度小檗堿促進(jìn)促凋亡蛋白BAX水平的表達(dá)，但是未見濃度依賴性。內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡主要與腫瘤壞死因子死亡通路及線粒體途徑通路有關(guān)。腫瘤壞死因子死亡通路主要包括天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）和絲裂原激活蛋白激酶（P38MAPK）信號(hào)途徑。腫瘤壞死因子有調(diào)節(jié)血管形成的作用.低劑量腫瘤壞死因子能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)：高劑量腫瘤壞死因子能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。BAX基因是BCL-2家族中最重要的一個(gè)促凋亡因子，通過BH3區(qū)域識(shí)別BCL-2蛋白并形成BAX-BCL-2異二聚體，發(fā)揮促凋亡作用。。游離BAX可直接在線粒體膜上形成BAX-BAX同二聚體，改變線粒體膜通透性.使細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)，激活下游的caspase3協(xié)同細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的鹽酸小檗堿作用于大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，能抑制其增殖活性及上調(diào)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)，高劑量小檗堿較低劑量小檗堿抑制增殖作用更明顯。

梁寶今　蒙如慶　周卓東　梁濤

[摘要]目的 觀察鹽酸小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的作用，以探討鹽酸小檗堿促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法25 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L濃度小檗堿分別干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞1 h、2 h、4h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTr法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，Western Blot方法檢測(cè)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)。結(jié)果 不同濃度鹽酸小檗堿作用于大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可顯著抑制其增殖（P<0.001）；鹽酸小檗堿與大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞作用24 h，促凋亡蛋白BAX隨濃度增加而上調(diào)（P<0.001）。結(jié)論 鹽酸小檗堿可抑制大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并上調(diào)促凋亡蛋白BAX水平。

[關(guān)鍵詞]鹽酸小檗堿；主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；凋亡

鹽酸小檗堿亦稱黃連素，是毛茛科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖中的主要成分，屬于異喹啉類生物堿，臨床上多用于抗腸道細(xì)菌感染。近年來小檗堿的研究越來越廣泛，包括降糖、降脂、內(nèi)皮依賴性舒張血管、誘導(dǎo)自噬、神經(jīng)性疾病的治療等方向。內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡即內(nèi)皮細(xì)胞的程序性壞死，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可抑制血管新生導(dǎo)致血管退化。目前，通過抑制腫瘤血管新生治療腫瘤的方式已成為新的研究方向。

1.材料與方法

1.1主要試劑與儀器 鹽酸小檗堿（分子式：C20H18C1N04，分子量：371.81，CAS號(hào)：633-65-8）：阿拉丁試劑公司：大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株：清華大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；PRMI.1640培養(yǎng)基：Gibico公司；噻唑蘭（MrlT）：凱基生物試劑公司；胎牛血清：Hyclone公司；BAX：SANTA公司；beta-actin：ABJENT；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體BCA試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜：碧云天公司；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀Muhiskan MK3：Thermo公司；電泳槽、電泳儀、凝膠成像儀：BIO-RAD。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng) 將凍存于液氮的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞解凍、1000轉(zhuǎn)/分離心3 min，并在含10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞長到80%左右，用0.25%胰酶（含EDTA）消化傳代。在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)、形態(tài)，選取狀態(tài)優(yōu)良的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)體外試驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)鹽酸小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 對(duì)消化的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×104細(xì)胞/孔加入96孔板中，每孔200 uL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后加人不同濃度的鹽酸小檗堿（0umol/L、25umol//L，50umol//L、75umol//L、100umol//L），每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。培養(yǎng)結(jié)束棄上清，避光加人M1Tr溶液（終濃度5 mg/m1），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄細(xì)胞上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150uL，于恒溫振蕩箱反應(yīng)10 min以充分溶解。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)吸光度OD值。

1.2.3Western Blot檢測(cè)BAX蛋白 25 umol/L、50umol//L、75umol//L、100umol//L濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后.用100：1的RIPA/PMSF混合液提取各組細(xì)胞總蛋白，注意冰上操作，以減輕蛋白裂解；使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，酶標(biāo)儀562 nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算出蛋白的質(zhì)量。每個(gè)樣品加5xSDS 25uL，100℃沸水中變性。分別從每組中取總蛋白25ug制備蛋白上樣，進(jìn)行12%SDS-PAGE膠電泳，連接正負(fù)極，加滿電泳液，開始使用80 V電壓.跑30 min后把電壓改為120 V.樣本繼續(xù)跑1 h，直到溴酚藍(lán)跑出玻璃板。PVDF膜轉(zhuǎn)膜，電泳槽置冰上，100 V電壓跑75 min。麗春紅染色并用去離子水清洗，配一抗、二抗稀釋液（水：casein=20：1），抗體濃度為（1：1000），一抗4℃過夜，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用碧云天ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光，通過凝膠成像儀顯影，并用imageJ進(jìn)行灰度值分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用成組設(shè)計(jì)的單因素方差分析，3個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較的q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)：a=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

2.1不同濃度小檗堿在不同干預(yù)時(shí)間作用下的OD值 使用25umol//L、50umol/L、75 umol/L、100umol/L濃度小檗堿分別干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞1h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTY法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性結(jié)果。由表1、圖1可見，與對(duì)照組（0umol/L）相比，25umol//L、50 umol/L、75umol/L、100 umol/L濃度小檗堿作用8 h、12 h、24 h、48 h、72h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制增殖活性的作用。不同濃度作用12 h、24 h OD值變化較明顯，且這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)效果相似，故選取12 h作為最適作用時(shí)間。其中各濃度作用1 h、2 h，內(nèi)皮細(xì)胞抑制率低于10%；4 h、8 h內(nèi)皮細(xì)胞抑制率低于25%；12 h、24 h、48 h、72 h內(nèi)皮細(xì)胞抑制率為31%-62%，其中72小時(shí)100umol/L小檗堿作用內(nèi)皮細(xì)胞抑制率可達(dá)到62%。

2.2不同濃度鹽酸小檗堿處理后BAX蛋白表達(dá)水平 不同濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，Western Blot結(jié)果如圖2所示?？梢?5umol/L、50umol//L、75umol/L、100umol/L濃度小檗堿促進(jìn)促凋亡蛋白BAX水平的表達(dá).但是未見濃度依賴性。

3.討論

3.1鹽酸小檗堿可抑制大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖

細(xì)胞凋亡可抑制血管新生過程，導(dǎo)致血管退化。本研究主要以不同濃度的鹽酸小檗堿作用于大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察其增殖活性及檢測(cè)促凋亡蛋白BAx的表達(dá).探討鹽酸小檗堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為抑制血管新生過程的研究提供理論基礎(chǔ)。使用25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L濃度小檗堿分別干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h，可見12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.提示小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制增殖活性的作用。但是，作用1 h、2 h、4 h療效不顯著，可能與藥物在內(nèi)皮細(xì)胞的代謝有關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是腫瘤血管形成最關(guān)鍵的生長因子，研究表明，HIF-1A可以誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)增加，并且可以引起腫瘤組織的微血管密度增加，在腫瘤新生血管形成過程中有著重要的作用。小檗堿不僅可以顯著抑制腫瘤血管增殖，降低胞內(nèi)ROS水平，而且在維生素E存在時(shí)可完全清除腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生血管，提示了小檗堿具有抑制腫瘤血管形成的特性。

3.2鹽酸小檗堿可上調(diào)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)不同濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果可見25 umol/L、50 umo]/L、75 umol/L、100 umol/L濃度小檗堿促進(jìn)促凋亡蛋白BAX水平的表達(dá)，但是未見濃度依賴性。內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡主要與腫瘤壞死因子死亡通路及線粒體途徑通路有關(guān)。腫瘤壞死因子死亡通路主要包括天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）和絲裂原激活蛋白激酶（P38MAPK）信號(hào)途徑。腫瘤壞死因子有調(diào)節(jié)血管形成的作用.低劑量腫瘤壞死因子能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)：高劑量腫瘤壞死因子能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。BAX基因是BCL-2家族中最重要的一個(gè)促凋亡因子，通過BH3區(qū)域識(shí)別BCL-2蛋白并形成BAX-BCL-2異二聚體，發(fā)揮促凋亡作用。。游離BAX可直接在線粒體膜上形成BAX-BAX同二聚體，改變線粒體膜通透性.使細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)，激活下游的caspase3協(xié)同細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的鹽酸小檗堿作用于大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，能抑制其增殖活性及上調(diào)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)，高劑量小檗堿較低劑量小檗堿抑制增殖作用更明顯。

梁寶今　蒙如慶　周卓東　梁濤

[摘要]目的 觀察鹽酸小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的作用，以探討鹽酸小檗堿促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法25 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L濃度小檗堿分別干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞1 h、2 h、4h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTr法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，Western Blot方法檢測(cè)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)。結(jié)果 不同濃度鹽酸小檗堿作用于大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞可顯著抑制其增殖（P<0.001）；鹽酸小檗堿與大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞作用24 h，促凋亡蛋白BAX隨濃度增加而上調(diào)（P<0.001）。結(jié)論 鹽酸小檗堿可抑制大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并上調(diào)促凋亡蛋白BAX水平。

[關(guān)鍵詞]鹽酸小檗堿；主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；凋亡

鹽酸小檗堿亦稱黃連素，是毛茛科黃連屬植物黃連、黃柏的根莖中的主要成分，屬于異喹啉類生物堿，臨床上多用于抗腸道細(xì)菌感染。近年來小檗堿的研究越來越廣泛，包括降糖、降脂、內(nèi)皮依賴性舒張血管、誘導(dǎo)自噬、神經(jīng)性疾病的治療等方向。內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡即內(nèi)皮細(xì)胞的程序性壞死，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可抑制血管新生導(dǎo)致血管退化。目前，通過抑制腫瘤血管新生治療腫瘤的方式已成為新的研究方向。

1.材料與方法

1.1主要試劑與儀器 鹽酸小檗堿（分子式：C20H18C1N04，分子量：371.81，CAS號(hào)：633-65-8）：阿拉丁試劑公司：大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株：清華大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；PRMI.1640培養(yǎng)基：Gibico公司；噻唑蘭（MrlT）：凱基生物試劑公司；胎牛血清：Hyclone公司；BAX：SANTA公司；beta-actin：ABJENT；HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體BCA試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、PVDF膜：碧云天公司；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀Muhiskan MK3：Thermo公司；電泳槽、電泳儀、凝膠成像儀：BIO-RAD。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng) 將凍存于液氮的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞解凍、1000轉(zhuǎn)/分離心3 min，并在含10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞長到80%左右，用0.25%胰酶（含EDTA）消化傳代。在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)、形態(tài)，選取狀態(tài)優(yōu)良的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)體外試驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)鹽酸小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 對(duì)消化的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×104細(xì)胞/孔加入96孔板中，每孔200 uL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后加人不同濃度的鹽酸小檗堿（0umol/L、25umol//L，50umol//L、75umol//L、100umol//L），每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。培養(yǎng)結(jié)束棄上清，避光加人M1Tr溶液（終濃度5 mg/m1），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄細(xì)胞上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150uL，于恒溫振蕩箱反應(yīng)10 min以充分溶解。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)吸光度OD值。

1.2.3Western Blot檢測(cè)BAX蛋白 25 umol/L、50umol//L、75umol//L、100umol//L濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后.用100：1的RIPA/PMSF混合液提取各組細(xì)胞總蛋白，注意冰上操作，以減輕蛋白裂解；使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，酶標(biāo)儀562 nm處檢測(cè)OD值，計(jì)算出蛋白的質(zhì)量。每個(gè)樣品加5xSDS 25uL，100℃沸水中變性。分別從每組中取總蛋白25ug制備蛋白上樣，進(jìn)行12%SDS-PAGE膠電泳，連接正負(fù)極，加滿電泳液，開始使用80 V電壓.跑30 min后把電壓改為120 V.樣本繼續(xù)跑1 h，直到溴酚藍(lán)跑出玻璃板。PVDF膜轉(zhuǎn)膜，電泳槽置冰上，100 V電壓跑75 min。麗春紅染色并用去離子水清洗，配一抗、二抗稀釋液（水：casein=20：1），抗體濃度為（1：1000），一抗4℃過夜，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用碧云天ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光，通過凝膠成像儀顯影，并用imageJ進(jìn)行灰度值分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用成組設(shè)計(jì)的單因素方差分析，3個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較的q檢驗(yàn)（Newman-Keuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)：a=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

2.1不同濃度小檗堿在不同干預(yù)時(shí)間作用下的OD值 使用25umol//L、50umol/L、75 umol/L、100umol/L濃度小檗堿分別干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞1h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h。MTY法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性結(jié)果。由表1、圖1可見，與對(duì)照組（0umol/L）相比，25umol//L、50 umol/L、75umol/L、100 umol/L濃度小檗堿作用8 h、12 h、24 h、48 h、72h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制增殖活性的作用。不同濃度作用12 h、24 h OD值變化較明顯，且這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)效果相似，故選取12 h作為最適作用時(shí)間。其中各濃度作用1 h、2 h，內(nèi)皮細(xì)胞抑制率低于10%；4 h、8 h內(nèi)皮細(xì)胞抑制率低于25%；12 h、24 h、48 h、72 h內(nèi)皮細(xì)胞抑制率為31%-62%，其中72小時(shí)100umol/L小檗堿作用內(nèi)皮細(xì)胞抑制率可達(dá)到62%。

2.2不同濃度鹽酸小檗堿處理后BAX蛋白表達(dá)水平 不同濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，Western Blot結(jié)果如圖2所示?？梢?5umol/L、50umol//L、75umol/L、100umol/L濃度小檗堿促進(jìn)促凋亡蛋白BAX水平的表達(dá).但是未見濃度依賴性。

3.討論

3.1鹽酸小檗堿可抑制大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖

細(xì)胞凋亡可抑制血管新生過程，導(dǎo)致血管退化。本研究主要以不同濃度的鹽酸小檗堿作用于大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察其增殖活性及檢測(cè)促凋亡蛋白BAx的表達(dá).探討鹽酸小檗堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為抑制血管新生過程的研究提供理論基礎(chǔ)。使用25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L濃度小檗堿分別干預(yù)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h，可見12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.提示小檗堿對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞具有抑制增殖活性的作用。但是，作用1 h、2 h、4 h療效不顯著，可能與藥物在內(nèi)皮細(xì)胞的代謝有關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是腫瘤血管形成最關(guān)鍵的生長因子，研究表明，HIF-1A可以誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)增加，并且可以引起腫瘤組織的微血管密度增加，在腫瘤新生血管形成過程中有著重要的作用。小檗堿不僅可以顯著抑制腫瘤血管增殖，降低胞內(nèi)ROS水平，而且在維生素E存在時(shí)可完全清除腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的新生血管，提示了小檗堿具有抑制腫瘤血管形成的特性。

3.2鹽酸小檗堿可上調(diào)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)不同濃度鹽酸小檗堿處理大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果可見25 umol/L、50 umo]/L、75 umol/L、100 umol/L濃度小檗堿促進(jìn)促凋亡蛋白BAX水平的表達(dá)，但是未見濃度依賴性。內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡主要與腫瘤壞死因子死亡通路及線粒體途徑通路有關(guān)。腫瘤壞死因子死亡通路主要包括天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）和絲裂原激活蛋白激酶（P38MAPK）信號(hào)途徑。腫瘤壞死因子有調(diào)節(jié)血管形成的作用.低劑量腫瘤壞死因子能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu)：高劑量腫瘤壞死因子能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。BAX基因是BCL-2家族中最重要的一個(gè)促凋亡因子，通過BH3區(qū)域識(shí)別BCL-2蛋白并形成BAX-BCL-2異二聚體，發(fā)揮促凋亡作用。。游離BAX可直接在線粒體膜上形成BAX-BAX同二聚體，改變線粒體膜通透性.使細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)，激活下游的caspase3協(xié)同細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的鹽酸小檗堿作用于大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，能抑制其增殖活性及上調(diào)促凋亡蛋白BAX的表達(dá)，高劑量小檗堿較低劑量小檗堿抑制增殖作用更明顯。