MIF抑制劑ISO-1在妊娠大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷中的作用

李晨，王衛(wèi)星，左騰，石喬，王鵬，趙亮，梅方超

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科，湖北武漢430060)

MIF抑制劑ISO-1在妊娠大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷中的作用

李晨，王衛(wèi)星，左騰，石喬，王鵬，趙亮，梅方超

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科，湖北武漢430060)

目的探討巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)在孕鼠重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷中的作用。方法30只晚期SD孕鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為孕鼠組(SO組)、孕鼠SAP組(SAP組)和孕鼠MIF抑制劑ISO-1預(yù)處理組(ISO-1組)，每組均為10只。逆行膽胰管注射5%牛磺膽酸鈉制備SAP模型。術(shù)后12 h處死大鼠取血檢測(cè)血清淀粉酶(AMY)。取胰腺組織及肺組織行病理學(xué)檢查并評(píng)分，免疫組化檢測(cè)肺組織中MIF、核因子κB(NF-κB)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)。結(jié)果SAP組孕鼠的血清淀粉酶(AMY)、胰腺及肺組織病理評(píng)分較SO組均有顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；SAP組孕鼠肺組織中的MIF、NF-κB及TNF-α表達(dá)較SO組也顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ISO-1組上述指標(biāo)較SAP組均有顯著改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MIF的表達(dá)與NF-κB及TNF-α的表達(dá)均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.815和r=0.787，P＜0.05。結(jié)論MIF抑制劑ISO-1對(duì)孕鼠急性重癥胰腺炎肺損傷具有一定的保護(hù)作用，其部分機(jī)制可能與抑制NF-κB及TNF-α的激活有關(guān)。

妊娠合并急性胰腺炎；肺損傷；巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子；核因子-κB；腫瘤壞死因子-α

妊娠合并急性胰腺炎(Acute pancreatitis in pregnancy，APIP)是妊娠合并外科急腹癥的首位病死原因[1]，發(fā)病率為1/3 000～1/1 000[2]，具有起病急、發(fā)展快、易出現(xiàn)多臟器功能衰竭和病死率高的特點(diǎn)。有報(bào)道APIP并發(fā)肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)及多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)在APIP中的發(fā)生率高達(dá)60%[3]。目前關(guān)于APIP的實(shí)驗(yàn)研究較少，本研究旨在探討巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)在孕鼠重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組妊娠晚期SD大鼠30只，孕期16～17 d，體重330～380 g，由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。使用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為三組：孕鼠組(SO組)，孕鼠SAP組(SAP組)，孕鼠MIF抑制劑ISO-1預(yù)處理組(ISO-1組)，每組均為10只。

1.2 主要試劑?；悄懰徕c購自美國Sigma公司，MIF抑制劑ISO-1購自美國Santa Cruz公司，MIF抗體、TNF-α抗體購自美國Abcam公司，NF-κB抗體購自美國CST公司。

1.3 動(dòng)物模型制作與處理實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。麻醉動(dòng)物取仰臥位，碘伏棉球消毒腹部后鋪洞巾，無菌操作下上腹正中切口入腹，肝門處分離出膽總管后，以無損傷血管夾夾閉。使用4.5#注射針頭穿十二指腸壁，經(jīng)十二指腸大乳頭逆行穿刺進(jìn)入膽胰管，以無損血管鉗夾閉近乳頭處的膽胰管與穿刺針。以微量注射泵向膽胰管恒速(0.1 ml/min)注入5%牛磺膽酸鈉(1 ml/kg)。注射完畢后，抽出針頭的同時(shí)原位夾閉膽胰管5 min，確認(rèn)周圍胰腺組織立即出現(xiàn)水腫、出血、壞死后松開無損傷血管夾，逐層縫合關(guān)閉腹腔，SAP造模完畢。SO組孕鼠開腹后僅翻動(dòng)十二指腸和胰腺后關(guān)腹。SO組及SAP組術(shù)前30 min經(jīng)腹腔注射5%DMSO(2 ml/kg)，ISO-1組術(shù)前30 min腹腔注射溶解ISO-1(7.0 mg/kg)的5%DMSO(2 ml/kg)溶液。大鼠蘇醒后禁食不禁水，分籠喂養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本獲取各組大鼠依照時(shí)間于術(shù)后12 h處死，下腔靜脈穿刺取血，2 000 r/min離心血清15 min后凍存?zhèn)溆?。取適量胰頭、右肺上葉組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，取部分肺組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 生化指標(biāo)檢測(cè)采用全自動(dòng)多功能生化分析儀檢測(cè)大鼠血清淀粉酶(AMY)水平(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)。

1.5.2 HE染色觀察胰腺及肺組織病理變化將胰腺及肺組織固定包埋后切片，HE染色并進(jìn)行光鏡觀察。胰腺病理評(píng)分參照文獻(xiàn)[3]，根據(jù)胰腺是否出現(xiàn)水腫、壞死、出血和脂肪壞死、炎癥和血管炎性細(xì)胞浸潤進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。肺損傷組織學(xué)評(píng)分參照文獻(xiàn)[4]，根據(jù)肺泡壁水腫程度、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤程度以及間質(zhì)和肺泡腔出血范圍來判斷肺損傷的程度。

1.5.3 免疫組織化學(xué)染色各組取肺組織切片，脫蠟水化后行抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，一抗二抗孵育、鏈霉素抗生物素-過氧化物酶依次孵育后，DAB顯色。觀察MIF、NF-κB及TNF-α表達(dá)，并使用Image pro-Plus6.0軟件進(jìn)行累計(jì)光密度(IOD)值測(cè)量，進(jìn)行表達(dá)半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 胰腺生化及病理學(xué)檢查SAP組大鼠血清AMY水平較SO組顯著升高。ISO-1組AMY水平與SO組相比升高明顯(P＜0.05)，但與SAP組相比較，淀粉酶水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。胰腺病理觀察，SO組胰腺小葉結(jié)構(gòu)完整，無明顯病理改變或僅見輕度水腫。SAP組胰腺切片可見胰腺不同程度的水腫、出血及片狀壞死，腺葉間隙增寬和炎性細(xì)胞浸潤，病理評(píng)分較SO組顯著增加(P＜0.05)；ISO-1組胰腺腺泡輕度水腫，間質(zhì)內(nèi)有少量出血及炎性細(xì)胞浸潤，病理評(píng)分較SAP組大鼠顯著降低(P＜0.05)，見表1。

2.2 肺組織病理改變與評(píng)分SO組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，肺間質(zhì)無滲出。SAP組肺間隔增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)大量滲出物，肺泡腔塌陷，局灶性實(shí)變，病理評(píng)分較SO組大鼠顯著升高(P＜0.05)。ISO-1組肺間質(zhì)增寬，充血水腫，有少量炎性細(xì)胞浸潤，病理評(píng)分較SAP組大鼠顯著降低(P＜0.05)，見表1及圖1。

注：與SO組比較，aP＜0.05；與SAP組比較，bP＜0.05。

2.3 免疫組織化學(xué)檢查肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α表達(dá)采用免疫組織化學(xué)染色法染色，SAP組孕鼠肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α的表達(dá)明顯增加，IOD值較SO組顯著升高；ISO-1組孕鼠肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α的表達(dá)顯著少于SAP組，IOD值顯著降低；各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2、圖3、圖4。

圖1 各組大鼠肺組織病理改變(HE×200)

圖2 各組大鼠肺組織中MIF的表達(dá)(×200)注：A：SO組；B：SAP組；C：ISO-1組；D：MIF IOD值。

圖3 各組大鼠肺組織中NF-κB的表達(dá)(×200)注：A：SO組；B：SAP組；C：ISO-1組；B：NF-κB IOD值。

圖4 各組大鼠肺組織中TNF-α的表達(dá)(×200)注：A：SO組；B：SAP組；C：ISO-1組；D：TNF-α IOD值。

2.4 相關(guān)性分析各組孕鼠肺組織中MIF的表達(dá)與NF-κB的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.815，P值小于0.01；各組孕鼠肺組織中MIF的表達(dá)與TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.787，P＜0.05。

3 討論

近年來，隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，APIP的發(fā)病率有升高的趨勢(shì)，其不僅影響妊娠進(jìn)展及胎兒成長，還極易伴發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、ARDS、MODS，增加母嬰圍產(chǎn)期的死亡率[5]。因此筆者研究MIF在APIP肺損傷中的作用對(duì)于保護(hù)APIP母嬰在圍產(chǎn)期的安全具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAP組孕鼠血清AMY水平及胰腺、肺組織病理學(xué)評(píng)分較SO組顯著升高，提示APIP合并肺損傷模型建立成功，APIP中胰腺和肺損傷程度呈正相關(guān)；免疫組化結(jié)果顯示SAP組孕鼠肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α的表達(dá)較SO組顯著升高，提示APIP發(fā)病過程中肺組織中MIF及炎癥因子表達(dá)增加，與肺損傷程度密切相關(guān)。

近年來，MIF已被證實(shí)在SAP[6-7]、ARDS[8-9]及膿毒癥休克等危重疾病的致病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。MIF是集細(xì)胞因子、趨化因子、神經(jīng)-內(nèi)分泌激素和生物酶特性于一身的多效能蛋白分子，可抑制巨噬細(xì)胞的游走，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥局部浸潤、增生、分泌一些細(xì)胞因子，如IL-1 β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等[10]。TNF-α是SAP中的一個(gè)最早升高并起核心作用的促炎因子，Calandra等[11]報(bào)道TNF-α?xí)催^來促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌MIF，TNF-α和MIF協(xié)同作用于前炎癥反應(yīng)環(huán)路，導(dǎo)致SAP病情的加重。NF-κB是一類能與多種細(xì)胞基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，在調(diào)控多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)上起著關(guān)鍵作用。APIP合并肺損傷時(shí)，肺組織NF-κB的激活可引起多種促炎蛋白表達(dá)，包括細(xì)胞因子(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α等)和黏附分子(ICAM-1、P-selectin)等，從而導(dǎo)致肺損傷。Daun等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MIF可以通過抑制糖皮質(zhì)激素對(duì)IκB-α表達(dá)的上調(diào)，對(duì)抗激素在NF-kB/IκB-α信號(hào)轉(zhuǎn)換通路中的效應(yīng)，進(jìn)而阻斷其對(duì)炎癥因子表達(dá)的限制作用，說明MIF可對(duì)NF-κB的激活進(jìn)行調(diào)控。

筆者在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用選擇性MIF互變異構(gòu)酶活性抑制劑ISO-1，觀察其對(duì)APIP肺損傷的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ISO-1組孕鼠血清淀粉酶水平下降，胰腺、肺組織病理改變減輕，肺組織中MIF、NF-κB及TNF-α的表達(dá)水平下降。說明ISO-1對(duì)APIP孕鼠肺損傷具有一定的保護(hù)作用，其部分機(jī)制可能與抑制NF-κB及TNF-α的激活有關(guān)。

[1]Scherer J,Singh VP,Pitchumoni CS,et al.Issues in hypertriglyceridemic pancreatitis:an update[J].J Clin Gastroenterol,2014,48(3): 195-203.

[2]Pandey R,Jacob A,Brooks H.Acute pancreatitis in pregnancy:review of three cases and anaesthetic management[J].Int J Obstet Anesth,2012,21(4):360-363.

[3]蔣曉忠,嚴(yán)律南,龔光,等.妊娠合并急性胰腺炎的臨床診治分析[J].中華肝膽外科雜志,2008,14(11):759-762.

[4]Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.Abetter model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J].Ann Surg,1992,215(1):44-56.

[5]程石,何三光,張佳林.肺泡巨噬細(xì)胞活化在急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷中的作用[J].中華外科雜志,2002,40(8):609-612.

[6]Tang SJ,Rodriguez-Frias E,Singh S,et al.Acute pancreatitis during pregnancy[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2010,8(1):85-90.

[7]Rahman SH,Menon KV,Holmfield JH,et al.Serum macrophage migration inhibitory factor is an early marker of pancreatic necrosis in acute pancreatitis[J].Ann Surg,2007,245(2):282-289.

[8]Matsuda N,Nishihira J,Takahashi Y,et al.Role of macrophage migration inhibitory factor in acute lung injury in mice with acute pancreatitis complicated by endotoxemia[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 2006,35(2):198-205.

[9]Lai KN,Leung JC,Metz CN,et al.Role for macrophage migration inhibitory factor in acute respiratory distress syndrome[J].J Pathol, 2003,199(4):496-508.

[10]Donnelly SC,Haslett C,Reid P T,et al.Regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in acute respiratory distress syndrome[J].Nat Med,1997,3(3):320-323.

[11]Calandra T,Roger T.Macrophage migration inhibitory factor:a regulator of innate immunity[J].Nat Rev Immunol,2003,3(10):791-800.

[12]Bernhagen J,Mitchell RA,Calandra T,et al.Purification,bioactivity, and secondary structure analysis of mouse and human macrophage migration inhibitory factor(MIF)[J].Biochemistry,1994,33(47): 14144-14155.

[13]Daun JM,Cannon JG.Macrophage migration inhibitory factor antagonizes hydrocortisone-induced increases in cytosolic IkappaBalpha [J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2000,279(3): R1043-R1049.

Effects of MIF inhibitor ISO-1 on lung injury in rat models of acute pancreatitis in pregnancy.

LI Chen,WANG Wei-xing,ZUO Teng,SHI Qiao,WANG Peng,ZHAO Liang,MEI Fang-chao.Department of Hepatobiliary Surgery, People's Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of ISO-1(macrophage migration inhibitory factor,MIF)on lung injury in pregnant rats with severe acute pancreatitis(SAP).MethodsThirty pregnant SD rats were randomly divided into the sham operation(SO)group,SAP group,and ISO-1 group,with 10 rats in each group.SAP model was established by retrograde injection of 5%sodium taurocholate into the biliopancreatic duct.The level of serum amylase and histopathological scores of pancreatic and lung tissues were determined.MIF,NF-κB and TNF-α activity in the lung was examined by immunohistochemical methods.ResultsSerum level of amylase(AMY),histopathological scores of pancreatic and lung tissues and activities of MIF,NF-κB,TNF-α in SAP group increased significantly as compared with those in SO group(P＜0.05),and the microscopic lung injuries were gradually aggravated with disease progression(P＜0.05).In ISO-1 group,all the above mentioned indexes were reduced significantly in comparison with those in the SAP group(P＜0.05).Intrapulmonary levels of MIF was positively associated with the expression of NF-κB and TNF-α(r= 0.815,r=0.787,P＜0.05).ConclusionMIF inhibitor ISO-1 protects lung from injury in pregnant rats with SAP.It was suggested that MIF was one of the mechanisms in acute pancreatitis in pregnancy with lung injury and may correlate with the activations of NF-κB and TNF-α.

Acute pancreatitis in pregnancy;Lung injury;Macrophage migration inhibitory factor(MIF);Nuclear factor-κB(NF-κB);Tumor necrosis factor-α(TNF-α)

R-332

A

1003—6350（2016）02—0180—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.02.003

2015-10-18)

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81370562）；湖北省衛(wèi)生廳科研基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（編號(hào)：JX6A07）；天晴肝病扶持基金（編號(hào)：TQCB20140182）

王衛(wèi)星。E-mail:sate.llite@163.com