減小肝損傷白酒的研制及其質(zhì)量控制

樂細選，楊　強，陳敬炳，童國強，管　瑩，施　鵬，李先芝，?！〕?勁牌有限公司，湖北大冶435100)

?

減小肝損傷白酒的研制及其質(zhì)量控制

樂細選，楊強，陳敬炳，童國強，管瑩，施鵬，李先芝，祝成
(勁牌有限公司，湖北大冶435100)

摘要：將枸杞、山楂、葛根、木瓜等原料中提取出的功效成分，與白酒配制成具有減小肝損傷功能的產(chǎn)品。經(jīng)過毒理學(xué)評價和功效學(xué)評價，結(jié)果表明，該酒體安全無毒，并能減少對四氯化碳所致的肝損傷，對肝臟具有輔助保護作用。用HPLC的方法測定減小肝損傷白酒中齊墩果酸的含量，齊墩果酸檢測濃度范圍：44.064～440.64 mg/L, Y=-0.01882222X3+36.14729X2+2942.488X，R2=0.9999，平均回收率為102.62 %，結(jié)果證明，該方法靈敏、簡單、快速、穩(wěn)定、效果較好。

關(guān)鍵詞：減小肝損傷白酒；毒理學(xué)；功效學(xué)；齊墩果酸；HPLC；保健酒

中國釀造白酒已有4000多年的悠久歷史，酒文化作為中華傳統(tǒng)文化的一部分已經(jīng)深入到社會的各個階層，飲用白酒已成為中國人重要的生活習(xí)慣。白酒的主要成分是乙醇，乙醇可以促進血液循環(huán)、擴張皮膚血管、通經(jīng)活絡(luò)，適量飲用有利于人體健康，但長期不節(jié)制飲酒容易對人體的消化系統(tǒng)、特別是肝臟造成損傷。

基于健康的理念，我公司開發(fā)完成的減小肝損傷白酒是以枸杞、葛根、山楂、木瓜為原料[1-2]，通過科學(xué)的提取分離方法提取藥材中的有效部位或有效成分，按一定的處方比例，以白酒為基體進行調(diào)配而成，使產(chǎn)品既具有白酒的風(fēng)味風(fēng)格、又具有減小肝損傷的保健功能。枸杞、葛根和山楂中的有效成分已經(jīng)有比較完善的檢測方法，本實驗中則使用HPLC方法對木瓜中的主要成分齊墩果酸進行檢測，以驗證方法的適宜性。藥理實驗研究證明，齊墩果酸具有較顯著的保肝作用[6-7]。

1　材料與方法

1.1樣品

50 %vol白酒（勁牌有限公司生產(chǎn)，批號：20090701），枸杞（寧夏中寧），葛根（湖北羅田），山楂，木瓜（安徽宣城），齊墩果酸對照品（批號：110709—200304，中國藥品生物制品檢定檢驗所）。

1.2試劑與儀器

乙腈（色譜純），純凈水，二次蒸餾水，微孔濾膜，針頭過濾器，一次性注射器等，Prostar高效液相色譜儀，AB135-S電子天平（十萬分之一），F(xiàn)A2004電子天平（萬分之一）。

1.3實驗方法

1.3.1減小肝損傷白酒的研制

1.3.1.1藥材的提取

山楂提取物的提?。河靡掖蓟亓魈崛》?，稱取干燥山楂，破碎，于70℃下按固液比1∶20加入70 %vol乙醇回流提取2 h，重復(fù)1次，合并提取液，濾液真空濃縮至浸膏，40℃真空干燥，稱重，得山楂提取物。

枸杞提取物的提?。悍Q取枸杞子，水洗干凈后置于不銹鋼鍋中，用沸水保溫浸泡24 h后，趁熱用500目篩過濾，收集濾液，濾液減壓濃縮至密度為1.0 g/ mL時加入1.5倍量的95 %vol乙醇,得沉淀物，收集沉淀物于80℃下鼓風(fēng)干燥8 h，取出冷卻、粉碎，得棕紅色的枸杞(多糖)提取物。

葛根提取物的提?。喝「鸶鬯槌纱址郏尤?倍量70 %vol的乙醇，加熱提取3次，每次1.5 h，溫度為90℃，合并葛根提取液，回收乙醇，葛根提取浸膏，5倍水溶解，過濾，水液上101大孔樹脂柱，水洗脫后用70 %vol乙醇洗脫，乙醇洗脫液，回收乙醇，減壓干燥，得葛根提取物（葛根素粗品）。

木瓜提取物的提?。喝∧竟戏鬯槌纱址?，用95 %vol乙醇提取3次，每次3 h，過濾，回收乙醇，至原料與溶劑的比例為1∶1，用水溶解，水不溶物用乙醇反復(fù)重結(jié)晶，得木瓜提取物（齊墩果酸）。

1.3.1.2酒體的配制

取山楂提取物、枸杞多糖提取物、葛根提取物和木瓜提取物按處方的比例溶于白酒，用0.1 %活性炭進行脫色，過濾即得。

1.3.2毒理學(xué)和功效學(xué)實驗

1.3.2.1毒理學(xué)評價方法

急性毒性試驗（Horn's法）：雌雄小鼠各25只，按體重隨機分為5組（5雌5雄），以5種劑量進行喂養(yǎng)。各組動物經(jīng)停食16 h后，一次性經(jīng)口給予受試物，連續(xù)觀察7 d，記錄各組動物的中毒反應(yīng)情況和死亡數(shù)，以確定該受試物對小鼠的半數(shù)致死劑量（LD50），解剖確定死亡原因。

遺傳毒性實驗（平板摻入法）：以多氯聯(lián)苯（PCB）誘導(dǎo)的大鼠肝微粒酶（S9，經(jīng)2-氨基芴鑒定合格）作為體外代謝活化系統(tǒng)，鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型突變株TA97、TA98、TA100、TA102經(jīng)his、△uvrB、rfa、R因子、PAQI質(zhì)粒、自發(fā)回變等鑒定合格后，在37℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)10 h，菌數(shù)達到1×109cfu/ mL后備用。在頂層培養(yǎng)基中加入0.1 mL實驗菌株增菌液、0.1 mL受試物溶液和0.5 mL S9混合液（需要代謝活化時），混勻后倒入底層培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)每皿菌落數(shù)。

1.3.2.2功效學(xué)評價方法

建立酒精性肝損傷模型，將適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d的小鼠，按體重隨機分為6組（空白組、模型組、溶劑組、3個劑量組），各組數(shù)量均為10只。3個劑量組分別按人體推薦攝入量（1.67 mL/kg·bw）的10倍、20倍、30倍給予受試物，空白及模型對照組給予蒸餾水，溶劑對照組給予15 %vol酒精，灌胃容量10.0 mL/kg·bw。

實驗期間每周稱重2次，觀察小鼠生長情況以及調(diào)整受試樣品灌胃劑量。于實驗第30天將模型對照組、溶劑對照組以及各劑量組一次性灌胃50 %vol酒精，灌胃量為12 mL/kg·bw，空白對照組給予相同劑量的蒸餾水，禁食16 h處死小鼠，取肝臟測定丙二醛（MDA），谷胱甘肽（GSH）及甘油三酯（TG），并進行病理組織學(xué)檢測。

1.3.3齊墩果酸的測定方法

1.3.3.1色譜條件

C18柱為色譜分析用色譜柱，乙腈∶水（比例為75∶25）為流動相，流動相流速為1.0 mL/min，蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度為100℃，霧化氣體氮氣流速為2.5 L/min。

1.3.3.2對照品溶液的制備

取齊墩果酸標準品適量，用甲醇溶解，配制成1 mL含0.5mg/mL的甲醇溶液，然后稀釋成不同濃度以建立標準曲線。

1.3.3.3供試品溶液制備方法

取50 mL減小肝損傷白酒樣于60℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至干，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10.0 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液備用，供試品溶液進樣量為50 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1減小肝損傷白酒的毒理學(xué)和功效學(xué)實驗

2.1.1毒理學(xué)評價結(jié)論

通過急性毒性小鼠30 d喂養(yǎng)試驗，減小肝損傷白酒對小鼠的半數(shù)致死劑量（LD50）＞200.0 mL/kg·bw，屬實際無毒物質(zhì)；測定結(jié)果顯示各項生理、生化指標均在正常值范圍內(nèi)波動，病理切片中也沒有發(fā)現(xiàn)有與受試物有關(guān)的毒性問題。

2.1.2功效學(xué)評價結(jié)論

小、中、大、超大劑量組小鼠肝細胞膜MDA含量明顯降低（P＜0.05；P＜0.01），SOD、CAT和GSH-Px活性升高（P＜0.05；P＜0.01）；減小肝損傷白酒對大鼠血清AST有明顯降低作用，肝臟病理切片結(jié)果顯示，與模型對照組相比，氣球樣變程度減輕（p＜0.05），病變總評分（p＜0.05），能減少對四氯化碳所致的肝損傷而對肝臟具有輔助保護作用，4個劑量均能改善肝細胞的變性程度，具有抗酒精性肝保護作用，其作用機制與提高肝臟抗氧化功能有關(guān)。

2.2齊墩果酸的含量測定

2.2.1線性關(guān)系考察

配制不同濃度的齊墩果酸溶液進行色譜分析，得到各濃度的齊墩果酸色譜峰的峰面積，以濃度為橫坐標，相對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標建立標準曲線。結(jié)果表明齊墩果酸溶液濃度在44.064～440.64 mg/L時，與峰面積有良好的相關(guān)性，R2=0.9999，得到方程：

Y= -0.01882222X3+36.14729X2+2942.488X。

2.2.2精密度試驗

選擇線性范圍實驗中的濃度為176.256 mg/L的齊墩果酸標準物質(zhì)，連續(xù)進樣分析6次，得到各次分析的色譜峰面積，計算峰面積的RSD值。計算得到精密度實驗的RSD值為0.84 %。結(jié)果表明，精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性實驗

選擇線性范圍實驗中的濃度為176.256 mg/L齊墩果酸標品溶液，分別在0、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h進樣分析，得到相應(yīng)的峰面積，計算峰面積的RSD值。計算得到穩(wěn)定性實驗的RSD值為2.11 %。結(jié)果表明，供試品溶液在16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.4重復(fù)性實驗

重復(fù)制備6個供試品溶液并進樣測定，利用建立的標準曲線計算供試品溶液中齊墩果酸的含量。得到減小肝損傷白酒樣品中齊墩果酸的含量為21.9276 mg/L，重復(fù)性實驗的RSD值為1.45 %。結(jié)果表明，本檢測方法重復(fù)性良好。

2.2.5回收率試驗

吸取重復(fù)性實驗中的減小肝損傷酒樣品25.00 mL于茄形瓶中，各加入不同量的齊墩果酸對照品溶液，然后按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在確定的色譜條件下進行色譜分析，得到各供試品溶液的色譜峰面積，根據(jù)建立的標準曲線計算出各樣品中齊墩果酸的量，再根據(jù)添加量計算出齊墩果酸的回收率，并計算回收率的RSD值。計算得到各添加量下的平均回收率為102.62 %，RSD值為3.12 %。具體數(shù)據(jù)見表1。

2.2.6樣品的含量測定

共測定了6個批號的減小肝損傷白酒，齊墩果酸的平均含量為1.36 mg/L，結(jié)果見表2。

3　結(jié)論

3.1減小肝損傷白酒是以枸杞、葛根、山楂和木瓜等4味藥食兩用藥材為原料，分別提取其中的功效成分枸杞多糖、葛根黃酮、山楂黃酮和齊墩果酸后配制而成的一種保健白酒，毒理學(xué)和功效學(xué)評價結(jié)果表明，本品無毒，且對小鼠血清AST有明顯降低作用，能減少四氯化碳所致的肝損傷，對肝臟具有輔助保護作用。

3.2齊墩果酸是山楂和木瓜的功效成分之一，用HPLC方法測定齊墩果酸的含量，操作簡便、節(jié)省時間、方法可靠。齊墩果酸在稀乙醇中溶解度低，故減小肝損傷白酒樣品經(jīng)回收乙醇后用甲醇溶解方能進行HPLC色譜分析。

表1 減小肝損傷白酒齊墩果酸加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

表2 減小肝損傷白酒中齊墩果酸含量測定結(jié)果

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部) [M].北京：中醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上?？萍汲霭嫔?2006.

[3]古賽,姜蓉.枸杞多糖對酒精性脂肪肝大鼠肝細胞色素P4503A的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,32(4)：371-375.

[4]周吉銀,周世文.葛根總黃酮及葛根素解酒的藥理研究進展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007,27(9)：1280-1282.

[5]卓斌，譚泳怡.山楂的藥理作用研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2009, 5(3)：18-19.

[6]林丹,郭素華.木瓜化學(xué)成分、藥理作用研究進展[J].海峽藥學(xué), 2009,21(10)：85-87.

[7]王曉峰,李繼堯.齊墩果酸對肝損傷小鼠血清及肝細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)氨酶作用的研究[J].中國藥學(xué)雜志,1999,34(6)：377-379.

白云邊酒業(yè)獲松滋市“2015年工業(yè)發(fā)展突出貢獻獎”

本刊訊：2016年3月17日，2016年湖北省松滋市工業(yè)經(jīng)濟暨招商引資項目建設(shè)金融工作會議召開。會上，松滋市委、市政府對2015年度全市工業(yè)經(jīng)濟工作先進單位進行通報表彰。

湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司榮獲“2015年工業(yè)發(fā)展突出貢獻獎”，根據(jù)政企雙方簽訂的《戰(zhàn)略合作協(xié)議》，獎勵676.7萬元。2015年，白云邊酒業(yè)按照年初確定的“強基礎(chǔ)、補短板、提質(zhì)效、增后勁”工作方針，以市場為導(dǎo)向，做真做實，以質(zhì)取勝，開拓創(chuàng)新，在行業(yè)深度調(diào)整中站住了腳，穩(wěn)住了陣，實現(xiàn)了逆勢而上，穩(wěn)中有進，穩(wěn)中向好，促進了全市工業(yè)經(jīng)濟持續(xù)較快健康發(fā)展。

另悉，白云邊酒業(yè)還獲得了“工業(yè)企業(yè)參展和電子商務(wù)獎”“企業(yè)科技創(chuàng)新獎”。（王小波）

Development of Liver-Protecting Baijiu and Its Quality Control

YUE Xixuan, YANG Qiang, CHEN Jingbing, TONG Guoqiang, GUAN Ying, SHI Peng, LI Xianzhi and ZHU Cheng
(Jingpai Co.Ltd., Daye, Hubei 435100, China)

Abstract:The functional elements were extracted from Lycium chinense, Crataegus pinnatifida, Radix puerariae and Chaenomeles sinensis Koehne. Then they were blended with Baijiu to develop liver-protecting Baijiu. The efficacy and toxicology assessment showed that such Baijiu is safe without any toxic side-effects, and it has protective effects for carbon tetrachloride-induced liver damage. The content of oleanolic acid in the liquor was measured by HPLC (detection range within 44.064-440.64 mg/L, Y=-0.01882222X3+36.14729X2+2942.488X，R2=0.9999, and the average recovery was 102.62 %). Such measurement method was sensitive, simple, rapid, and effective.

Key words:liver-protecting Baijiu; toxicology; efficacy; oleanolic acid; HPLC; healthcare wine

作者簡介：樂細選（1977-），女，產(chǎn)品開發(fā)員，開發(fā)方向：提取物在白酒中的應(yīng)用研究。

收稿日期：2015-12-24

DOI：10.13746/j.njkj.2015478

中圖分類號：TS262.91；TS261.4；TS261.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016)04-0062-03

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-02-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160226.1042.005.html。