青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內(nèi)酯三組分對(duì)青蒿素在瘧疾小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為的影響

張超　仇峰　李靜　王滿元　龔慕辛

100069　北京，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[張超(碩士研究生)、仇峰、李靜、王滿元、龔慕辛]

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·論著·

青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內(nèi)酯三組分對(duì)青蒿素在瘧疾小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為的影響

張超仇峰李靜王滿元龔慕辛

100069北京，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[張超(碩士研究生)、仇峰、李靜、王滿元、龔慕辛]

【摘要】目的探究青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內(nèi)酯三組分在瘧疾小鼠體內(nèi)對(duì)青蒿素抗瘧增效作用在藥物動(dòng)力學(xué)方面可能的影響及其規(guī)律，為開(kāi)發(fā)新型基于青蒿素類抗瘧藥的聯(lián)合治療方案藥物奠定基礎(chǔ)。方法分別對(duì)瘧疾小鼠灌胃給予青蒿素(100 mg/kg)和青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素和東莨菪內(nèi)酯聯(lián)用(每種組分各100 mg/kg)，于給藥后不同時(shí)間點(diǎn)采集血漿，樣品經(jīng)液-液萃取后，采用HPLC-MS/MS法測(cè)定藥物濃度。結(jié)果與青蒿素單用比較，青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內(nèi)酯聯(lián)用組青蒿素的最大血藥濃度由924 ng/mL 增加到1065 ng/mL，AUC((0-t))(1893 h×ng/mL)明顯高于青蒿素單用組(661 h×ng/mL)，半衰期延長(zhǎng)，血漿清除率下降了65%。結(jié)論青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內(nèi)酯可顯著影響青蒿素的藥物動(dòng)力學(xué)行為。

【關(guān)鍵詞】青蒿素；青蒿；協(xié)同增效組分；藥物動(dòng)力學(xué)；小鼠瘧疾模型

近年來(lái)，艾滋病、結(jié)核和瘧疾被WHO列為對(duì)人類健康威脅最為嚴(yán)重的三大傳染病。根據(jù)WHO 2015年世界瘧疾報(bào)告，全球大約32億人面臨瘧疾風(fēng)險(xiǎn)，2015年仍有約2.14億瘧疾新病例，死亡大約43.8萬(wàn)人[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，藥物治療是人類抗擊瘧疾的主要方法和有效途徑。當(dāng)前，青蒿素類藥物發(fā)揮著挽救瘧疾患者生命的重要作用。2003年版《國(guó)際藥典》中收載的青蒿素類藥物有：蒿甲醚原料、注射液，青蒿素原料、片劑、膠囊，蒿乙醚原料、注射液，雙氫青蒿素原料、片劑，青蒿琥酯原料、片劑。為提高青蒿素類藥物的臨床療效，降低瘧原蟲(chóng)再燃率，延緩耐藥性的產(chǎn)生，WHO目前推薦基于青蒿素類抗瘧藥的聯(lián)合治療方案(artemisinin-based combination therapies，ACTs)，分別為蒿甲醚+本芴醇、青蒿琥酯+阿莫地喹、青蒿琥酯+甲氟喹、青蒿琥酯+磺胺多辛(周效磺胺)/乙胺嘧啶以及雙氫青蒿素+哌喹[2]，這些ACTs組合均為青蒿素類藥物與一種已產(chǎn)生耐藥性的抗瘧藥聯(lián)合應(yīng)用的組合。作為一類自2001年開(kāi)始就廣泛使用的瘧疾治療方案，目前ACTs的耐藥現(xiàn)狀不容樂(lè)觀，柬埔寨與泰國(guó)的邊境地區(qū)、緬甸和越南等地已經(jīng)確診出現(xiàn)了惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)青蒿素類藥物耐藥[3]。這種耐藥性雖然沒(méi)有導(dǎo)致青蒿素類藥物治療的徹底失敗，但卻減緩了從患者血液中清除惡性瘧原蟲(chóng)的速度。WHO認(rèn)為，在青蒿素耐藥性傳播到高感染地區(qū)之前，遏制或消除耐藥性的機(jī)會(huì)其實(shí)十分有限[1]。前期發(fā)現(xiàn)：青蒿中含量較高的青蒿酸、青蒿乙素和東莨菪內(nèi)酯對(duì)青蒿素的抗瘧藥效有明顯的增效作用(該藥物組合簡(jiǎn)稱青蒿四組分，青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內(nèi)酯三組分單用或伍用沒(méi)有觀察到明顯抗瘧活性)[4]。本課題組針對(duì)“以1∶1∶1∶1質(zhì)量比配伍時(shí)青蒿四組分體系中青蒿素增效4倍的現(xiàn)象”開(kāi)展了系列研究。前期研究結(jié)果提示，青蒿素屬于難溶易吸收藥物，雖不能完全排除藥效環(huán)節(jié)的增效作用，但青蒿素四組分體系的增效現(xiàn)象很可能是通過(guò)代謝環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，無(wú)抗瘧活性的天然組分可以增強(qiáng)青蒿素的藥效。臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)，瘧疾感染會(huì)導(dǎo)致宿主下調(diào)肝藥酶CYP450的表達(dá)，導(dǎo)致藥物首過(guò)代謝減少[5]。為了進(jìn)一步深入探究青蒿四組分體系的增效機(jī)制，開(kāi)展了青蒿多組分體系在約氏瘧原蟲(chóng)(plasmodium yoelii)感染小鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)特征的研究，為發(fā)展新的抗青蒿素耐藥治療策略提供參考。

1材料與方法

1.1儀器

6410型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent科技有限公司)；低溫冷凍離心機(jī)(Sigma公司，3K15)；渦旋混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠，2H-2)；十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，BT25S)。

1.2藥品與試劑

青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸(均為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)檢測(cè)純度均大于98.4%)；東莨菪內(nèi)酯(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，純度為98%)；內(nèi)標(biāo)物丁螺環(huán)酮(Sigma公司，批號(hào)BCBL7606V，純度為99.3%)。

色譜級(jí)甲醇(Fisher公司，批號(hào)140098)；色譜級(jí)乙腈(Fisher公司，批號(hào)124984)；色譜級(jí)甲酸(Sigma公司，批號(hào)0001394882)；甲基叔丁基醚(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20150120)；吐溫-80(天津市化學(xué)試劑六廠分廠，批號(hào)20110520)；羧甲基纖維素鈉(北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司，批號(hào)20130307)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康ICR小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2) g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.4色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脫，0～1分鐘，5% B相；1～1.1分鐘，5%～10% B相；1.1～5分鐘，10%～95% B相；5～6分鐘，95% B相；6～6.1分鐘，95%～5% B相；6.1～10分鐘，5% B相；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：采用ESI電離源，MRM檢測(cè)模式，青蒿素、青蒿乙素和東莨菪內(nèi)酯采用正離子電離模式，青蒿酸采用負(fù)離子電離模式。離子噴霧電壓為4.0 kV，加熱毛細(xì)管溫度300 ℃，輔助加熱氣壓為30 psi，霧化氣壓為30 psi，青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯和內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮的解簇電壓(DP)分別為100 V、120 V、130 V、120 V、100 V；碰撞能量(CE)分別為9 eV、10 eV、3 eV、25 eV、40 eV；用于定量分析的離子對(duì)分別為：283.2→247.1，249.1→189.1，232.8→232.8，193.0→133.0，386.3→122.1。

1.5實(shí)驗(yàn)方案和樣品采集

取SPF級(jí)健康ICR小鼠96只，小鼠腹腔接種1×107個(gè)被瘧原蟲(chóng)寄生的紅細(xì)胞，接種3天后(當(dāng)小鼠瘧疾感染率達(dá)到20%時(shí))，隨機(jī)分為2大組：即青蒿素單用組(100 mg/kg)、青蒿素+青蒿酸+青蒿乙素+東莨菪內(nèi)酯聯(lián)用組(每種組分各100 mg/kg)，每只小鼠按照所在藥物組別灌胃給藥。每大組再分為8小組(每一組為一個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)所需動(dòng)物)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取6只小鼠摘眼球取血。給藥前禁食12小時(shí)，自由飲水，給藥后5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、8小時(shí)和12小時(shí)摘眼球取血300 μL，收集血液樣品于預(yù)冷肝素化離心管，立即搖勻置于冰上，3000 rpm、4 ℃離心10分鐘，取上清血漿樣品于1.5 mL離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肔C-MS/MS法測(cè)定血漿中相關(guān)成分的濃度。

表1　采用LC-MS/MS法測(cè)定ICR小鼠血漿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和

1.6血漿樣品處理

取血漿樣品50 μL，依次加入甲醇-水(20:80，v/v)混合溶液10 μL、內(nèi)標(biāo)溶液(100 ng/mL丁螺環(huán)酮)10 μL、0.1%的甲酸溶液10 μL和甲基叔丁基醚(MTBE)400 μL，渦旋混合1分鐘，3500 rpm離心10分鐘，取上清液300 μL，氮?dú)獯蹈?，殘留物加入乙?水(1:1，v/v)混合溶液100 μL溶解，渦旋混合1分鐘，以LC-MS/MS法進(jìn)行測(cè)定。

2結(jié)果

2.1青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯在小鼠體內(nèi)的LC-MS/MS方法學(xué)驗(yàn)證

血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯的測(cè)定，青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯和內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮的保留時(shí)間分別為6.91分鐘、6.68分鐘、7.59分鐘、5.20分鐘和5.32分鐘；以藥物濃度(C)為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)(1/C2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，見(jiàn)表1；青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內(nèi)酯的低、中、高三個(gè)濃度日內(nèi)及日間精密度RSD均<15%(n=6)；青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯經(jīng)歷3個(gè)冷凍解凍循環(huán)、于-80 ℃冰箱冷凍30天、于20 ℃放置24小時(shí)后穩(wěn)定性良好；青蒿素的回收率在89.5%～99.3%，青蒿乙素的回收率在86.9%～99.0%，青蒿酸的回收率在93.4%～99.3%，東莨菪內(nèi)酯的回收率在85.2%～91.6%。樣品處理方法符合規(guī)定，可用于血漿樣品中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯的分析測(cè)定。

2.2青蒿素單用及四組分聯(lián)用在瘧疾小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.2.1青蒿素單用及四組分聯(lián)用在瘧疾小鼠體內(nèi)青蒿素的血藥濃度-時(shí)間曲線及藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)青蒿素單用及四組分聯(lián)用在瘧疾小鼠體內(nèi)青蒿素的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖1，采用WinNonlin軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

注：無(wú)顯著性差異(aP>0.05)；顯著性差異(bP<0.05)；極顯著性差異(cP<0.01)

圖1　青蒿素單用及四組分聯(lián)用在瘧疾小鼠體內(nèi)

與青蒿素單用相比，四組分聯(lián)用后瘧疾小鼠體內(nèi)青蒿素的血藥濃度增大，半衰期延長(zhǎng)，Cmax升高，Vd、CL降低，生物利用度是青蒿素單用的2.86倍。

2.2.2瘧疾小鼠體內(nèi)青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)瘧疾小鼠灌胃給予青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯組合物后青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

表3　四組分聯(lián)用在瘧疾小鼠體內(nèi)青蒿乙素、

3討論

青蒿素是含過(guò)氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，分子結(jié)構(gòu)中缺少共軛體系，采用常規(guī)紫外檢測(cè)器難以達(dá)到定量分析生物樣品的目的。本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)建立了青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內(nèi)酯在瘧疾小鼠血漿中藥物濃度的測(cè)定方法，同時(shí)為了提高分析方法的準(zhǔn)確性，減少實(shí)驗(yàn)誤差，選擇丁螺環(huán)酮作為內(nèi)標(biāo)，避免了在樣品處理及進(jìn)樣過(guò)程中帶來(lái)的誤差。在摸索青蒿酸的質(zhì)譜條件中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予較大碰撞能量時(shí)，青蒿酸母離子全部成為碎片，沒(méi)有特征子離子，而采用較小碰撞能量時(shí)，只有母離子，沒(méi)有碎片離子，故最終采用較小碰撞能量，只檢測(cè)母離子進(jìn)行藥物濃度測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈沉淀蛋白法、甲醇沉淀蛋白法、甲基叔丁基醚萃取法和二氯甲烷萃取法的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用沉淀蛋白法處理樣品檢測(cè)不到青蒿素，采用液-液萃取法處理樣品四種組分均可被檢測(cè)到，且甲基叔丁基醚的提取率高于二氯甲烷的提取率，故實(shí)驗(yàn)最終采用甲基叔丁基醚萃取法處理樣品。

無(wú)有效抗瘧藥對(duì)實(shí)現(xiàn)全球控制瘧疾將是一場(chǎng)災(zāi)難，一旦瘧原蟲(chóng)對(duì)目前的ACTs產(chǎn)生耐藥性，有可能導(dǎo)致與瘧疾有關(guān)的死亡人數(shù)大幅攀升。由于沒(méi)有其他抗瘧藥能具有ACTs的藥效和依從性，近期的瘧疾控制工作仍然面臨很大的不確定性，發(fā)展新型瘧疾治療藥物具有現(xiàn)實(shí)緊迫性。另一方面，由于受到經(jīng)濟(jì)發(fā)展?fàn)顩r以及傳統(tǒng)習(xí)俗的影響，青蒿素的不合理使用仍在繼續(xù)。非洲多地的瘧疾患者由于種種原因很難獲得ACTs藥物，致使這些瘧疾高發(fā)區(qū)的患者還在使用基于青蒿原植物開(kāi)發(fā)的號(hào)稱對(duì)瘧疾有預(yù)防和治療作用的植物藥[6-7]。WHO認(rèn)為這些植物藥中青蒿素的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于瘧疾治療的有效劑量，可能會(huì)促進(jìn)瘧原蟲(chóng)發(fā)展青蒿素的耐藥性[8]。但是，多年來(lái)這個(gè)問(wèn)題并沒(méi)有解決，現(xiàn)實(shí)中仍然在使用這些青蒿植物制劑。如何能夠更合理地使用天然青蒿素，延緩或避免青蒿素類藥物的抗藥性問(wèn)題，應(yīng)該得到更多的關(guān)注和研究。

課題組前期探討了青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內(nèi)酯三組分對(duì)正常小鼠體內(nèi)青蒿素藥動(dòng)學(xué)行為的影響。綜合分析正常和瘧疾小鼠模型的結(jié)果，表明正常和瘧疾小鼠灌胃給予100 mg/kg青蒿素后，正常小鼠體內(nèi)青蒿素的血藥濃度大于瘧疾小鼠體內(nèi)青蒿素濃度，正常小鼠組青蒿素的Cmax、AUC(0-t)均略高于瘧疾小鼠組，達(dá)峰時(shí)間相同；正常和瘧疾小鼠灌胃四組分后，正常小鼠體內(nèi)青蒿素的濃度大于瘧疾小鼠體內(nèi)青蒿素濃度，正常小鼠組青蒿素的Cmax、AUC(0-t)均略高于瘧疾小鼠組，達(dá)峰時(shí)間滯后。表明青蒿素單體相同劑量單次給藥，在正常和瘧疾小鼠的藥物動(dòng)力學(xué)存在差異。一般認(rèn)為，瘧疾感染會(huì)導(dǎo)致青蒿素類藥物的代謝減少，體內(nèi)血藥濃度相對(duì)增高[5]。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示，除代謝環(huán)節(jié)以外，青蒿素的體內(nèi)過(guò)程同時(shí)也受其他環(huán)節(jié)的影響，比如蛋白結(jié)合過(guò)程等。前期課題組研究表明與青蒿素單獨(dú)作用相比，四組分聯(lián)用對(duì)牛血清白蛋白的猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)均增大，青蒿素體內(nèi)蛋白存貯及轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生改變，影響青蒿素的藥物動(dòng)力學(xué)行為[9]。

鑒于青蒿素類藥物耐藥性發(fā)展的嚴(yán)峻形勢(shì)，研究人員應(yīng)高度重視新型抗瘧藥物和治療策略的研究。筆者認(rèn)為通過(guò)深入研究青蒿“以1∶1∶1∶1質(zhì)量比配伍時(shí)青蒿四組分體系中青蒿素增效4倍的現(xiàn)象”，有助于發(fā)展新的抗瘧策略，能夠?yàn)楹侠響?yīng)用青蒿植物制劑，發(fā)展低耐藥性天然ACTs組分藥物奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與青蒿素單用比較，青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內(nèi)酯聯(lián)用組青蒿素在約氏瘧原蟲(chóng)感染小鼠體內(nèi)的最大血藥濃度由924 ng/mL增加到1065 ng/mL，AUC(0-t)(1893 h×ng/mL)明顯高于青蒿素單用組(661 h×ng/mL)，半衰期延長(zhǎng)，血漿清除率下降了65%，確證了青蒿素天然協(xié)同組分通過(guò)改變其藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)來(lái)提高抗瘧作用的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，提示了天然組分干預(yù)青蒿素的體內(nèi)過(guò)程是一種可行的增效策略。

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(本文編輯： 董歷華)

The effects of arteannuin B,arteannuic acid and scopoletinon pharmacokinetics of artemisinin in mice infected by Plasmodium yoelii

ZHANGChao，QIUFeng，LIJing，etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the antimalaria synergistic effects of arteannuin B, arteannuic acid and scopoletin on the pharmacokinetics of artemisinin in mice infected by Plasmodium yoelii. MethodMice infected by Plasmodium yoelii were given artemisinin or a combination of artemisinin、arteannuin B、arteannuic acid and scopoletin. Blood samples were collected at different time intervals and extracted by liquid-liquid extraction. The contents in plasma were detected by HPLC-MS/MS method. ResultsCompared to single artemisinin group, the C(max) of the combination group was increased from 924 ng/mL to 1065 ng/mL,AUC((0-t))(1893 h×ng/mL), and the maximum plasma concentration was significantly higher than that of single artemisinin group (661 h×ng/mL), the biological half life was extended, and the CLtot was reduced at a proportion of 65%. ConclutionArteannuin B、arteannuic acid and scopoletin can obviously affect pharmacokinetic of artemisinin in mice infected by Plasmodium yoelii.

【Key words】Artemisinin；Artemisia annua L.；Synergistic components；Pharmacokinetic；Mouse model of malaria

(收稿日期：2016-02-29)

Corresponding author:WANG Man-yuan， E-mail： wangmyjun@163.com；GONG Mu-xin，gongmuxin@126.com

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.04.003

作者簡(jiǎn)介：張超(1986- )，女，2012年在讀碩士研究生。研究方向：中藥藥物動(dòng)力學(xué)研究。E-mail：13426423780@163.com通訊作者：王滿元(1976- )，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥物動(dòng)力學(xué)研究。E-mail: wangmyjun@163.com；龔慕辛(1968- )，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥物動(dòng)力學(xué)研究。E-mail: gongmuxin@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81573682，81102752)；北京市自然科學(xué)基金(2112010)