狼毒水煎液對A549細(xì)胞增殖及遷移的影響

孟明靜，耿勝男，鄭亞秋， 杜鋼

河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004

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狼毒水煎液對A549細(xì)胞增殖及遷移的影響

河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004

摘要：〔目的〕 觀察狼毒水煎液對人肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移的影響?！卜椒ā?MTT實(shí)驗(yàn)測定該藥對人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)法測定該藥對人肺癌A549細(xì)胞遷移的影響。〔結(jié)果〕 與對照組相比，狼毒水煎液對實(shí)驗(yàn)組肺癌A549細(xì)胞的增殖以及遷移均有一定的抑制作用，抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)?！步Y(jié)論〕 狼毒水煎液對人類非小細(xì)胞型肺癌有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：狼毒；水煎液；人A549細(xì)胞；增殖；遷移

據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)今世界肺癌的發(fā)病率約占各種癌癥的五分之一，居各種腫瘤發(fā)病率首位，對人類的健康以及生存質(zhì)量構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。我國是肺癌高發(fā)區(qū)，每年都有十幾萬人死于肺癌，已成為惡性腫瘤死亡的首要原因，并且發(fā)病率和死亡率在逐年上升，有大部分患者在確診時(shí)已是中晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，這樣給治療帶來了很大的難度，給患者、醫(yī)生以及社會(huì)帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。而非小細(xì)胞型肺癌約占肺癌總數(shù)的80%～85%，包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌，其癌細(xì)胞分裂較小細(xì)胞癌慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移較小細(xì)胞癌晚。放化療和手術(shù)在非小細(xì)胞型肺癌的治療方面起到了重要的作用，但對于年齡大、體力狀態(tài)差及不能接受手術(shù)的患者，由于化療抑制骨髓造血系統(tǒng)、產(chǎn)生免疫抑制等一系列副作用及放療并發(fā)癥的發(fā)生，在延長患者壽命和提高生存質(zhì)量方面的作用并不理想，使得他們在非小細(xì)胞肺癌的治療方面受到了一定的限制。近年來，中藥在緩解非小細(xì)胞肺癌癥狀，提高生存質(zhì)量方面的作用尤為突出，成為治療非小細(xì)胞型肺癌的重要方法之一，在其治療方面得到了廣泛認(rèn)可[1]。

狼毒，別名續(xù)毒、川狼毒，瑞香科瑞香狼毒或大戟科植物狼毒大戟的根，產(chǎn)于東北、華北、西北、西南及西藏等地，有瀉水逐飲、破積殺蟲之功效，可用于治療水腫腹脹、痰食蟲積、心腹疼痛、癥瘕積聚、結(jié)核、疥癬等。狼毒也有一定的抗腫瘤作用，能夠抑制肝癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。王敏等[2]通過研究證實(shí)了狼毒的抗腫瘤活性，其臨床用途也在不斷擴(kuò)大。楊柯等[3]通過研究證實(shí)了狼毒水提液對人肺癌A549細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。我們通過體外實(shí)驗(yàn)研究狼毒水煎液對人肺癌A549細(xì)胞增殖及遷移的影響來探究狼毒水煎液抑制非小細(xì)胞型肺癌的作用，以期為狼毒水煎液抑制非小細(xì)胞型肺癌的臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1材料

1.1藥品

狼毒飲片。取狼毒飲片20 g，置于冷水中浸泡0.5 h，然后小火煎煮，煎至水剛沒過藥渣，倒出藥水，藥渣留在砂鍋中，加水繼續(xù)煎煮。重復(fù)以上做法2次。將3次倒出的藥水混合在一起，濃縮至200 mL，即使其濃度為0.1 g/mL,放冷，置于4 ℃保存，備用。

1.2試劑

DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰蛋白酶(寶信生物科技有限公司)，MTT(Sigma公司)，PBS緩沖溶液(由磷酸二氫鉀、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、吐溫-20加水配制而成)，DMSO。

1.3瘤株

人A549肺癌細(xì)胞，由中科院提供，河南大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.4儀器

HDL潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)， ZXC紫外消毒車(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)，LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，ElX-800酶聯(lián)檢測儀(美國 BIO-IEK公司)，電子天平(上海麗馳計(jì)量儀器有限公司)，YN-ZD-2電熱蒸餾水器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，CHA-S恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)，TDL-508臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，BD-400冰柜(河南冷柜廠)，XDS-500D倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)，相機(jī)(奧林巴斯有限公司)，96孔板，6孔板，移液槍，EP管，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，Marker筆，直尺，20 μL槍頭，彎頭吸管。

2方法

2.1對人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

2.1.1消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)將鋪滿培養(yǎng)瓶的人肺癌A549細(xì)胞用胰蛋白酶液消化、離心，加DMEM完全培養(yǎng)基(血清∶DMEM=1∶9)，吹打成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.1.2稀釋細(xì)胞濃度將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板根據(jù)需要加入完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，使得每孔加入約104個(gè)細(xì)胞，吹打均勻，100 μL/孔點(diǎn)入96孔板，設(shè)置調(diào)零孔。調(diào)零孔只加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)16 h。

2.1.3加藥取出細(xì)胞培養(yǎng)板，以100 μL/孔加入狼毒水煎液。給藥組設(shè)置5個(gè)濃度梯度，濃度分別為50倍稀釋藥物(2 g/L)、100倍稀釋藥物(1 g/L)、200倍稀釋藥物(0.5 g/L)、400倍稀釋藥物(0.25 g/L)、800倍稀釋藥物(0.125 g/L)。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置對照孔，對照孔和調(diào)零孔均不加藥，只加入100 μL DMEM完全培養(yǎng)基，然后置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。

2.1.4加MTT取出細(xì)胞培養(yǎng)板，小心棄去各孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入 0.5 g/L的MTT溶液100 μL，再置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37 ℃條件下培養(yǎng)4 h。

2.1.5加DMSO并測定各孔吸光度值取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去MTT溶液。每孔加入DMSO 100 μL，混勻。用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處測各孔的OD值，根據(jù)如下公式計(jì)算抑制率[4]：抑制率=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。以藥物濃度為X軸、抑制率為Y軸繪制抑制率隨藥物濃度變化的曲線圖。

2.2對人肺癌A549細(xì)胞遷移的影響

2.2.1消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)將處于對數(shù)期的人肺癌A549細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，離心。加入DMEM完全培養(yǎng)液，吹打成單細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2.2.2調(diào)整細(xì)胞濃度將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，根據(jù)需要稀釋細(xì)胞濃度，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞。置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)。

2.2.3劃痕并加藥待細(xì)胞鋪滿6孔板，用20 μL移液槍頭呈“一”字劃痕，棄去各孔內(nèi)培養(yǎng)基，然后用PBS緩沖液洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞。設(shè)置對照孔和加藥孔，對照孔加入體積分?jǐn)?shù)為2%的血清培養(yǎng)基200 μL，加藥孔每孔加入含2 g/L狼毒水煎液、體積分?jǐn)?shù)為2%的血清培養(yǎng)基200 μL。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)。

2.2.4取樣拍照按0 h、24 h、48 h取樣拍照，觀察細(xì)胞的凋亡及遷移情況[5]。

3結(jié)果

3.1對人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測儀測得：給藥組OD值明顯較對照組OD值小，在顯微鏡下可見有部分細(xì)胞凋亡；隨著藥物濃度增大，給藥組的OD值有變小的趨勢，即狼毒水煎液對A549細(xì)胞增殖的抑制作用與其濃度呈正相關(guān)。結(jié)果見表1、圖1。

表1　狼毒水煎液對人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

3.2對人肺癌A549細(xì)胞遷移的影響

0 h、24 h、48 h分別在倒置顯微鏡下觀察并拍照，與對照組比較，給藥組細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯較多，同一時(shí)間點(diǎn)的照片中可見給藥組無細(xì)胞區(qū)域比對照組寬，且無細(xì)胞區(qū)域的寬度隨給藥時(shí)間的延長而減小。結(jié)果見圖2。

4結(jié)論

通過MTT實(shí)驗(yàn)探究了狼毒水煎液對人肺癌A549細(xì)胞增殖作用影響，發(fā)現(xiàn)狼毒水煎液對人肺癌A549細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了一定的抑制作用，且抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)；通過劃痕實(shí)驗(yàn)證明了狼毒水煎液抑制人肺癌A549細(xì)胞遷移并且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，從而說明了狼毒水煎液對人非小細(xì)胞型肺癌的抑制作用。

5討論

腫瘤細(xì)胞的無限增殖是腫瘤細(xì)胞的最重要生物學(xué)特征之一，也是危及癌癥患者生命的主要原因之一。同時(shí)，細(xì)胞增殖調(diào)控的異常是誘發(fā)腫瘤的重要原因。肺癌轉(zhuǎn)移給人們帶來的危害非常大，主要表現(xiàn)為腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移。病灶進(jìn)一步擴(kuò)大，引起血壓降低、癱瘓、呼吸困難、精神錯(cuò)亂、心律失常等，使患者的生命受到威脅，進(jìn)一步增加了患者的痛苦。因此，抑制肺癌的轉(zhuǎn)移是治療肺癌的重要目的之一。

圖1　狼毒水煎液對人肺癌A549細(xì)胞的抑制率

圖2　狼毒水煎液對人肺癌A549細(xì)胞遷移情況

一直以來，在癌癥的治療方面，手術(shù)切除以及放化療起到了重要作用，但是，這些傳統(tǒng)的治療方法并不能達(dá)到徹底清除腫瘤細(xì)胞和避免腫瘤轉(zhuǎn)移而有效地控制癌癥的目的，同時(shí)，手術(shù)給患者帶來的痛苦和創(chuàng)傷以及放化療對骨髓、肝、腎等重要器官產(chǎn)生的毒性作用，使得患者的機(jī)體免疫力有一定程度的降低，可能不僅不能延長患者的壽命，甚至造成患者壽命縮短或死亡。而與傳統(tǒng)的化療藥相比，中藥取材方便，醫(yī)療費(fèi)用低，毒副作用小，并且可以不同程度地提高人體免疫力，改善人體內(nèi)環(huán)境，患者痛苦較小，所以，中藥抗腫瘤作用的研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。

中藥通過多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等來抑制腫瘤的發(fā)展[6]。

綜上所述，狼毒水煎液對人非小細(xì)胞型肺癌有一定的抑制作用，可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，并且可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[7-8]，為非小細(xì)胞型肺癌的治療提供了一定的臨床指導(dǎo)。

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[責(zé)任編輯時(shí) 紅]

Effect of Euphorbia decoction on proliferation and migration in A549 cells

Intitute of Pharmacy, Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

Abstract:〔Objective〕To do a study of Euphorbia decoction on proliferation and migration in A549 cells. 〔Methods〕The effect on proliferation of lung cancer A549 cells is determined by MTT drugs,and the influence on migration of lung cancer A549 cells is determined by the scratch experiment. 〔Results〕Compared with the control group,there is different degrees of inhibition of A549 cells’ proliferation and migration in experimental group;it is a positive correlation between the inhibition effect and the concentration of Euphorbia decoction. 〔Conclusion〕Euphorbia decoction can inhibit non-small cell lung cancer.

Key words:euphorbia; decoction;A549 cells; proliferation; migration

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡介：孟明靜(1995-)，女，河南臺(tái)前人，碩士研究生，從事中藥抗腫瘤藥理學(xué)研究工作。 通信作者：杜鋼軍(1971-)，男，河南開封人，博士，教授，從事中藥抗腫瘤藥理學(xué)的研究工作。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173094)；河南省高校青年骨干教師項(xiàng)目(2010GGJS-025)

收稿日期：2015-09-12

文章編號：1672-7606(2016)01-0001-04