大腸桿菌植酸酶AppA野生型和熱穩(wěn)定突變型特性研究

段園園，趙　穎，張　民，李新良

（上海尤特爾生化有限公司，上?！?01201）

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大腸桿菌植酸酶AppA野生型和熱穩(wěn)定突變型特性研究

段園園，趙穎，張民，李新良

（上海尤特爾生化有限公司，上海201201）

摘要：大腸桿菌植酸酶AppA和突變型均在畢赤酵母表達(dá)并被分泌到胞外，在分離純化野生型和突變型植酸酶時(shí)發(fā)現(xiàn)突變型AppA植酸酶存在單體和復(fù)合體，而野生型植酸酶則沒有這一現(xiàn)象，生化分析表明，復(fù)合體是由單體通過二硫鍵鍵合形成。對(duì)植酸酶野生型、突變型單體、突變型復(fù)合體進(jìn)行酶學(xué)特性分析，降解植酸的比活力分別為1 750、994和1 082 U·mg(-1)，突變型植酸酶單體和復(fù)合體的耐熱性比野生型有明顯提高，但植酸酶野生型km值（0.30 mM）與突變型單體（3.89 mM）和突變型復(fù)合體（0.96 mM）相比明顯降低，表明耐熱性能的提高在一定程度上影響植酸酶與底物的結(jié)合。

關(guān)鍵詞：植酸酶；突變；畢赤酵母；復(fù)合體

植物性飼料成本低、來源廣、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值全面且容易被動(dòng)物吸收，應(yīng)用廣泛。植酸是從植物中提取的1種有機(jī)磷酸類化合物，主要存在于植物的種子、根干和莖中。磷是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的重要元素之一，植物性飼料中所含的磷只有一部分能被機(jī)體吸收利用，其余40％～70％的磷是以植酸磷的形式存在。豬、家禽以及一些魚類等單胃動(dòng)物其消化道內(nèi)缺乏水解植酸磷的酶類，僅能利用玉米中磷的10％～20％，豆餅中磷的25％～ 35％，典型的豬日糧中利用率也只有15％，其余則從糞便中排出，造成磷的浪費(fèi)，導(dǎo)致環(huán)境污染[1]。

植酸還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有較強(qiáng)的鰲合能力，能夠鰲合生物體所需的二價(jià)陽(yáng)離子，如Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+等，形成不溶性的鹽類，影響動(dòng)物對(duì)礦物質(zhì)元素的吸收[2]。植酸還能絡(luò)合蛋白質(zhì)，形成難溶解的復(fù)合物，其相互作用的能力與pH有很大關(guān)系：在低pH時(shí)植酸可以與蛋白質(zhì)分子的堿性基團(tuán)結(jié)合形成蛋白質(zhì)絡(luò)合物，抑制一些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和淀粉酶的活性；在高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH條件下，植酸以鈣鎂等陽(yáng)離子為“橋梁”，形成植酸-金屬離子-蛋白質(zhì)的復(fù)合物[3]。植酸絡(luò)合蛋白質(zhì)的性質(zhì)影響了動(dòng)物對(duì)一些重要蛋白質(zhì)的吸收，降低了蛋白質(zhì)、脂類和淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，進(jìn)一步影響了動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。

植酸酶是一種能夠水解植酸并釋放無(wú)機(jī)磷的磷酸酶類，廣泛存在于植物及微生物中，作為單胃動(dòng)物的飼料添加劑已得到世界范圍內(nèi)的廣泛認(rèn)可[4-7]。植酸酶分解植酸的性能對(duì)飼料工業(yè)的發(fā)展具有重要意義，飼料中添加植酸酶代替無(wú)機(jī)磷酸，不但可以解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高磷的利用率，降低飼料生產(chǎn)成本，更能夠減少磷資源的浪費(fèi)，從而降低因磷元素在環(huán)境中富集而造成的污染問題[8]。研究表明，向飼料中添加植酸酶，可以使磷的利用率提高40％～60％，減少糞便中磷的排放量達(dá)30％～50％。

植酸酶主要作為單胃動(dòng)物的飼料添加劑，其飼喂效果以及生產(chǎn)效益均已得到普遍的認(rèn)可。天然來源植酸酶生物酶含量水平低，難以大量生產(chǎn)且生產(chǎn)成本過高。天然的植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)不能滿足飼料工業(yè)的應(yīng)用，隨著分子生物技術(shù)的興起以及飼料工業(yè)的發(fā)展，利用基因重組技術(shù)獲得高產(chǎn)植酸酶產(chǎn)品可以解決這一難題。植酸酶在生產(chǎn)上的主要用途就是用作飼料添加劑以提高磷的利用率。飼用酶制劑在造粒的過程中需要經(jīng)過1個(gè)75～93℃的短暫高溫過程，而很多的植酸酶在這個(gè)過程中將會(huì)導(dǎo)致酶活性降低，甚至喪失活性。選擇具有高熱穩(wěn)定性，且能夠在動(dòng)物胃腸道環(huán)境中保持高活性的植酸酶作為飼料添加劑就顯得尤為重要。

來自于大腸桿菌的AppA植酸酶是一種新型的植酸酶，在單胃動(dòng)物胃腸道的酸性環(huán)境中適應(yīng)能力和分解植酸的能力都很強(qiáng)，是目前已知的活性最強(qiáng)的植酸酶，在大腸桿菌和畢赤酵母中都能獲得高效表達(dá)[9-12]。盡管AppA植酸酶pH特性較好，比活性也較高，但熱穩(wěn)定性較差，通過制粒高溫過程酶活將損失>70％，難以在主要的顆粒料中應(yīng)用。近年來研究表明，利用基因工程技術(shù)定向改造AppA植酸酶能夠明顯提高酶的熱穩(wěn)定性，Garrett等將來源于大腸桿菌的植酸酶基因AppA利用基因位點(diǎn)飽和突變技術(shù)（GSSM）進(jìn)行突變，篩選到能提高該植酸酶熱穩(wěn)定性的14個(gè)單突變位點(diǎn)，其中Q84W熱穩(wěn)定性提高最明顯[13]。以單突變位點(diǎn)Q84W為基礎(chǔ)，引入其余13個(gè)突變位點(diǎn)構(gòu)成雙突變，以雙突變?yōu)榛A(chǔ)再將其余12個(gè)突變引入構(gòu)成3突變，最后篩選到1個(gè)含有8個(gè)突變位點(diǎn)的酶，命名為Phy9x。其Tm值達(dá)到了75.7℃，比原酶高出12℃。

本研究純化了在畢赤酵母中高效表達(dá)和分泌的野生型AppA植酸酶和耐熱突變型Phy9x植酸酶，分別得到了純度較高的植酸酶，測(cè)定了野生型和突變型植酸酶的酶學(xué)參數(shù)km和Vmax，對(duì)純化的植酸酶進(jìn)行了熱穩(wěn)定性分析，初步探討了耐熱突變型植酸酶單體與聚合體的存在形式。

1　材料與方法

1.1儀器和耗材

蛋白純化系統(tǒng)AKTA purifier UPC100（GE life?sciences，Sweden），脫鹽預(yù)裝柱HiPrep 26/10 Desalt?ing Sephadex G- 25（26×100mm，GE lifesciences，Sweden），凝膠過濾預(yù)裝柱Hiload 16/60 Superdex 75 （16×600 mm，GE lifesciences，Sweden），低溫離心機(jī)Eppendorf Centrifuge 5810R，恒溫水浴鍋Fisher，755s紫外可見分光光度計(jì)，蛋白電泳儀Tanon EPS 300，Corning 10 kDa超濾離心管，0.22 μm無(wú)菌濾膜（Millipore Express PES Membrance，Germany），8％～16％預(yù)制膠Bio-Rad Criterion TGX Precast Gel，預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白Bio-Rad Precision Plus Protein Stan?dards，SDS-PAGE電泳緩沖液Laemmli Sample Buf?fer，Native-PAGE電泳緩沖液Native Sample Buffer。

1.2大腸桿菌AppA植酸酶在畢赤酵母的表達(dá)與分泌

大腸桿菌AppA和突變型phy9x適合畢赤酵母表達(dá)的基因片段由GeneArt合成。為了有效克隆到畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，限制性內(nèi)切酶序列SnaBI和NotI分別加到了基因片段的5'和3'端[13]?；蚩寺?、畢赤酵母轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)培養(yǎng)和重組蛋白的制備都按Invitrogen公司提供的方法操作。

1.3植酸酶的純化與濃縮

20 mL AppA植酸酶，經(jīng)4℃9 000 r·min-1離心30 min，分離出上清液并用0.22 μm無(wú)菌濾膜過濾。濾液分批上樣至26×100 mm的HiPrep 26/10 Desalt?ing Sephadex G-25脫鹽預(yù)裝柱，每次上樣5 mL，用3.0 mL·min-1流速的25 mM pH 8.5 Tris-HCl緩沖液洗脫并收集，第1步純化使AppA植酸酶置換到25 mM pH 8.5 Tris-HCl緩沖溶液中。取第1步純化的AppA植酸酶，分批上樣至16×600 mm的Hiload 16/60 Superdex 75凝膠過濾層析柱，每次上樣0.5 mL，在1.0 mL·min-1的25 mM pH 8.5 Tris-HCl緩沖液推動(dòng)下，AppA植酸酶中的蛋白按尺寸由大到小依次分離并收集，每管收集3 mL，共收集8管。根據(jù)AppA植酸酶凝膠層析圖的峰形，收集酶液，并用Corning超濾管濃縮純化的AppA植酸酶。

20 mL Phy9x植酸酶，4℃9 000 r·min-1離心30 min，分離出上清液并用0.22 μm無(wú)菌濾膜過濾。濾液分批上樣至26×100mm的HiPrep 26/10 Desalting Sephadex G-25脫鹽預(yù)裝柱，每次上樣5 mL，用3.0 mL·min-1流速的25 mM pH 8.5 Tris-HCl緩沖液洗脫并收集，第1步純化使Phy9x植酸酶置換到25 mM pH 8.5 Tris-HCl緩沖溶液中。取第1步純化的Phy9x植酸酶，分批上樣至16×600mm 的Hiload 16/60 Superdex 75凝膠過濾層析柱，每次上樣0.5 mL，在1.0 mL·min- 1的25 mM pH 8.5 Tris- HCl緩沖液推動(dòng)下，Phy9x植酸酶中的蛋白按尺寸由大到小依次分離并收集，每管收集3 mL，共收集8管。根據(jù)Phy9x植酸酶凝膠層析圖的峰分離情況，分組收集植酸酶各峰處的酶液，并用Corning超濾管濃縮純化的Phy9x植酸酶。

1.4植酸酶的凝膠電泳方法

分別取AppA植酸酶和Phy9x植酸酶純化過程中各收集管的酶液20 μL，加Laemmli sample buffer 20 μL搖勻，在沸水浴中煮沸5 min，冰水冷卻后，加樣20 μL至8％～16％的預(yù)制膠，通電160 V，40 mA，40 min，經(jīng)定型、考馬斯亮藍(lán)染色、脫色、成像后，得到與純化過程對(duì)應(yīng)的AppA植酸酶和Phy9x植酸酶SDS-PAGE圖。

取酶液20 μL，加native sample buffer 20 μL搖勻后，加樣20 μL至8％～16％的預(yù)制膠，通電160 V，40 mA，40 min，經(jīng)定型、考馬斯亮藍(lán)染色、脫色、成像后，得到植酸酶Native-PAGE圖。

1.5植酸酶蛋白濃度的測(cè)定

粗蛋白的濃度用Bradford試劑（Bio-Rad公司）測(cè)定，以血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。純化后的Ap?pA和Phy9x的濃度由UV280nm測(cè)得，其在1.0 mg· mL-1的UV280nm的光密度分別為1.142和1.145。

1.6植酸酶酶活分析方法

根據(jù)GB/T18634-2009飼用植酸酶活性的測(cè)定分光光度法，稀釋的植酸酶與底物植酸鈉在37℃、pH 5.5的條件下反應(yīng)30 min，用釩鉬酸銨溶液終止反應(yīng)并顯色，在415 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，依據(jù)磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出無(wú)機(jī)磷的量，代入公式1中計(jì)算出植酸酶的活性。

式中：X為試樣中植酸酶的活性，單位為U·g-1或U·mL-1；y為根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣液的吸光值由直線回歸方程計(jì)算出的無(wú)機(jī)磷的量，單位為μmol；t為酶解反應(yīng)時(shí)間，單位為min；n為試樣的稀釋倍數(shù)；m為試樣的量，單位為g或mL。

1.7植酸酶熱穩(wěn)定性分析

將純化的AppA植酸酶和Phy9x植酸酶，用250 mM pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋到500 U·mL-1，在酶活相同的條件下，每個(gè)樣品在60℃水浴中分別處理5、10、30和60 min后，至于冰水浴中保存，檢測(cè)植酸酶剩余活力。

1.8km與Vmax的計(jì)算

當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，植酸酶酶促反應(yīng)的速度（V）隨底物植酸鈉濃度（S）的增加而快速增加；隨著底物植酸鈉濃度的繼續(xù)增加，酶促反應(yīng)速度的增加開始減慢；當(dāng)?shù)孜镏菜徕c濃度增加到某一程度時(shí)，酶促反應(yīng)速度會(huì)達(dá)到一個(gè)極限值（Vmax）。底物植酸鈉的濃度與酶促反應(yīng)速度的這種關(guān)系可以用Michaelis-Menten方程式表示。米氏常數(shù)km等于酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，米氏常數(shù)km的單位為濃度單位（mmol·L-1或mM）。

方法為：用pH 5.5的緩沖液將酶稀釋到0.5 U·mL- 1；配置濃度為0.375、0.75、1.5、3.0、3.75、4.5、6.0和7.5 mM的植酸鈉底物溶液；在37℃、pH 5.5的條件下，不同濃度的底物分別與酶反應(yīng)30 min后，加入終止顯色液，415 nm下10 mm比色皿測(cè)吸光度值，依據(jù)磷酸二氫鉀的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)物的濃度；根據(jù)產(chǎn)物濃度，計(jì)算出酶反應(yīng)速度V；利用Linewearver-Burk雙倒數(shù)法作圖，繪制1/V對(duì)1/（S）的直線，直線在其橫軸上的截距為-1/km，縱截距為1/Vmax，可求出km與Vmax。

1.9二硫蘇糖醇處理Phy9x植酸酶

二硫蘇糖醇（DTT）常用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵。適量DTT能打開復(fù)合體內(nèi)的二硫鍵，釋放單體，去除DTT后，二硫鍵又重新鍵合形成復(fù)合體。對(duì)比DTT加入前后蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的變化，可以分辨蛋白是否存在復(fù)合體。向完成第1步純化的500 μL Phy9x植酸酶中加入1.0 mol·L- 1的DTT 50 μL，對(duì)照組中加ddH2O 50 μL，搖勻后放置于4℃冰箱待用。加DTT的Phy9x植酸酶500 μL與無(wú)DTT對(duì)照分別上樣至Hiload 16/60 Superdex 75凝膠過濾層析柱，進(jìn)行尺寸排阻色譜分離，UV280nm跟蹤蛋白洗脫位置。

2　結(jié)果與分析

2.1野生型AppA植酸酶

AppA植酸酶凝膠層析見圖1，AppA植酸酶SDS-PAGE見圖2。

圖1　AppA植酸酶凝膠層析

圖2　AppA植酸酶SDS-PAGE

由圖1～2可知，在5～7收集管處對(duì)應(yīng)一個(gè)峰形對(duì)稱的洗脫峰，凝膠層析分離SDS-PAGE中5～7管蛋白相對(duì)分子質(zhì)量集中在50 kDa以上，與羅會(huì)穎等研究一致[11]。把5～7管中的AppA植酸酶濃縮，計(jì)算出純化濃縮后的AppA植酸酶濃度為5.78 mg·mL-1。根據(jù)釩鉬酸銨法，測(cè)得野生型AppA植酸酶比活力為1 750 U·mg-1，與Golovan等測(cè)得的比活力1 700 U·mg-1接近，表明大腸桿菌AppA在畢赤酵母中能表達(dá)和分泌出與細(xì)菌表達(dá)相似的植酸酶[14]。

2.2突變型Phy9x植酸酶

Phy9x植酸酶凝膠層析圖見圖3，Phy9x植酸酶SDS-PAGE見圖4，Phy9x植酸酶Native-PAGE見圖5。

圖3　Phy9x植酸酶凝膠層析

圖4　Phy9x植酸酶SDS-PAGE

圖5　Phy9x植酸酶Native-PAGE

畢赤酵母表達(dá)和分泌突變型Phy9x植酸酶凝膠層析分離圖（圖3）中有1個(gè)肩峰和2個(gè)對(duì)稱的分離峰出現(xiàn)，凝膠層析分離SDS-PAGE（圖4）顯示兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)的蛋白條帶略有不同，第3管中50 kDa附近有兩條清晰的蛋白條帶，在第6和7管中50 kDa附近只有1條，第3管中還有>150 kDa的蛋白條帶，在第6和7管中未發(fā)現(xiàn)。對(duì)Phy9x植酸酶第3和7管收集進(jìn)一步做Native-PAGE（圖5），顯示第3管中蛋白集中在100 kDa附近，第7管中蛋白集中在44 kDa附近，50 kDa附近都有3條蛋白帶，這與畢赤酵母表達(dá)的植酸酶存在多個(gè)N-端糖基化位點(diǎn)有關(guān)[12]。

綜合以上結(jié)果，初步認(rèn)為突變型Phy9x植酸酶存在單體與復(fù)合體形態(tài)，且兩種形態(tài)之間存在動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系。把6、7管濃縮，作為純化的突變型Phy9x植酸酶單體，把突變型Phy9x植酸酶的3管濃縮，作為純化的突變型Phy9x植酸酶復(fù)合體。分別計(jì)算出Phy9x植酸酶單體和復(fù)合體的濃度為0.533 和0.497 mg·mL-1。釩鉬酸銨法測(cè)得Phy9x植酸酶單體比活力為994 U·mg-1，Phy9x植酸酶復(fù)合體比活力為1 082 U·mg-1。與AppA植酸酶相比，Phy9x植酸酶單體和復(fù)合體的比活力都有所降低。

2.3剩余酶活比較

植酸酶60℃熱穩(wěn)定性趨勢(shì)見圖6，純化植酸酶60℃熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見附表。

圖6　植酸酶60℃熱穩(wěn)定性趨勢(shì)

附表　純化植酸酶60℃熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)　U·mL-1

AppA植酸酶、Phy9x植酸酶單體和Phy9x植酸酶復(fù)合體60℃熱處理不同時(shí)間之后的剩余酶活數(shù)據(jù)見表1，趨勢(shì)圖見圖6。與野生型AppA植酸酶相比，8位點(diǎn)突變的AppA基因表達(dá)的Phy9x植酸酶的熱穩(wěn)定性明顯提高。Phy9x植酸酶單體和Phy9x植酸酶復(fù)合體60℃處理30 min后，剩余酶活比率均> 80％。熱穩(wěn)定性良好的突變型比較，單體比復(fù)合體耐高溫性能更好。

2.4雙倒數(shù)直線方程比較

AppA植酸酶Linewearver-Burk雙倒數(shù)圖見圖7，Phy9x植酸酶Linewearver-Burk雙倒數(shù)圖見圖8。

圖7　AppA植酸酶Linewearver-Burk雙倒數(shù)

圖8　Phy9x植酸酶Linewearver-Burk雙倒數(shù)

通過選擇不同濃度的底物植酸鈉[S]測(cè)定相應(yīng)的酶反應(yīng)初速度V，建立1/V對(duì)1/[S]的線性關(guān)系，利用縱橫軸的截距可方便地求出km與Vmax。AppA植酸酶的雙倒數(shù)直線方程為y=0.032x+0.107（r2= 0.995，n=5），計(jì)算出km為0.30 mM，Vmax為2022.1μmol·min-1·mg-1。Phy9x植酸酶單體的雙倒數(shù)直線方程為y=0.319x+0.082（r2=0.996，n=5），計(jì)算出km為3.89 mM，Vmax為1910.6 μmol·min- 1·mg- 1。Phy9x植酸酶復(fù)合體的雙倒數(shù)直線方程為y= 0.122x+ 0.127（r2=0.991，n=5），計(jì)算出km為0.96 mM，Vmax為1 326.3 μmol·min-1·mg-1。比較Phy9x植酸酶單體和復(fù)合體與AppA植酸酶的參數(shù)，發(fā)現(xiàn)km值均升高，Vmax值均降低，表明突變型Phy9x植酸酶對(duì)底物植酸鈉的結(jié)合能力和降解速度都有所降低。飼料原料通常含有0.2％～0.8％的植酸，在動(dòng)物胃腸道的含量應(yīng)為0.06％～0.25％，換算成摩爾濃度約為0.9～3.8 mM，野生型AppA植酸酶的km為0.30 mM，能比較完全地降解植酸的磷酯鍵，而突變型Phy9x植酸酶特別是突變型單體降解植酸磷酯鍵的程度將明顯受到影響[15-17]。

2.5DTT處理后的Phy9x植酸酶

Phy9x植酸酶DTT處理前與處理后凝膠層析圖見圖9。Phy9x植酸酶DTT處理后（1、2）與處理前（3、4）的Native- PAGE見圖10。Phy9x植酸酶SDS-PAGE（1、2）與Native-PAGE（3、4）見圖11。

圖9　Phy9x植酸酶DTT處理前與處理后凝膠層析

圖10　Phy9x植酸酶DTT處理前后的Native-PAGE

圖11　Phy9x植酸酶SDS-PAGE（1、2）與Native-PAGE（3、4）

疊加對(duì)比DTT處理前后Phy9x植酸酶的凝膠層析圖（圖9）可知，加DTT的Phy9x植酸酶色譜線（處理后）第二分離峰降低，第三分離峰增高。

圖10中加DTT前后Phy9x植酸酶的Native-PAGE中蛋白條帶的變化，也證明DTT使處于第二分離峰的Phy9x植酸酶復(fù)合體分解成了Phy9x植酸酶單體。圖10中3、4泳道中約100和200 kDa的蛋白條帶，在DTT還原的1、2泳道中這些分子量較大的蛋白條帶沒有出現(xiàn)，同時(shí)40～54 kDa區(qū)間的蛋白條帶增多。根據(jù)這些現(xiàn)象推斷，Phy9x植酸酶中約100和200 kDa的蛋白是以二倍體和四倍體形式存在的復(fù)合體。

圖11對(duì)比了Phy9x植酸酶的Native-PAGE和SDS-PAGE電泳圖，其中Phy9x植酸酶的SDSPAGE與DTT處理后的Native-PAGE略有不同，是由于DTT和2-MP對(duì)二硫鍵的還原能力不同導(dǎo)致的。

3　結(jié)論

試驗(yàn)純化了畢赤酵母高效表達(dá)的AppA植酸酶和突變型Phy9x植酸酶，分離提純時(shí)發(fā)現(xiàn)突變型Phy9x植酸酶存在單體和復(fù)合體，而且耐高溫突變型植酸酶單體和復(fù)合體的比活力以及與底物的親和力都不如野生型AppA植酸酶，這些特性的改變可能會(huì)影響植酸酶的使用效果。

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Characteristic Study on Escherichiacoli Phytase AppA and Thermostable Mutant

DUAN Yuanyuan,ZHAO Ying,ZHANG Min,LI Xinliang
（Shanghai Youtell Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai 201201,China）

Abstract:Escherichia coli phytase AppA and its thermostable mutant have been over-expressed and secreted from Pichia pastoris.Separation and purification of the wild-type and mutant enzymes revealed that the mutant en?zyme existed both single and polymeric forms while only single form was found from the wild-type enzyme.Biochem?ical analysis indicated that the polymeric form of the mutant resulted from disulfide bonds between single forms.The specific activities of wild-type,mutant single and polymeric form enzymes for phytate degradation were 1 750,994 and 1 082 U·mg(-1),respectively.The mutant forms were more thermostable but the km value for the wild-type(0.30 mM)was much lower than those for mutant single(3.89 mM)and polymeric form(0.96 mM),indicating that with the in?crease of thermostability,the combination of phytate and substrate became weak.

Key words:phytase; mutation; Pichia pastoris; polymeric form

作者簡(jiǎn)介：段園園（1984-），女，山西陽(yáng)泉人，碩士，主要從事蛋白質(zhì)純化研究。

收稿日期：2016-01-23

中圖分類號(hào)：R378.2+1；TQ925

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-0084（2016）03-0004-07