鉬對(duì)小鼠黃嘌呤氧化酶活性的影響

馬英英，張　磊

（1.河南省開(kāi)封市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南開(kāi)封　475000；2.河南省開(kāi)封市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南開(kāi)封　475000）

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鉬對(duì)小鼠黃嘌呤氧化酶活性的影響

馬英英1，張磊2

（1.河南省開(kāi)封市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南開(kāi)封475000；2.河南省開(kāi)封市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南開(kāi)封475000）

摘要：鉬是動(dòng)植物必需的微量元素之一，攝入過(guò)多，會(huì)引起中毒，導(dǎo)致動(dòng)植物的各種疾病。為探索長(zhǎng)期鉬暴露對(duì)動(dòng)物血清中鉬酶活性的影響，試驗(yàn)選取雌性小鼠40只和雄性小鼠20只（F0代），適應(yīng)5 d后，隨機(jī)分成4組，將每組10只雌性和5只雄性小鼠雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)，自由采食基礎(chǔ)日糧，飲水中加入不同劑量的鉬（以Na2MoO4·2H2O形式），分別是對(duì)照組（0 mg·L(-1)）、低鉬組（100 mg·L(-1)）、中鉬組（200 mg·L(-1)）、高鉬組（400 mg·L(-1)）。4周以后，雌雄合籠養(yǎng)，產(chǎn)仔后從每組仔鼠中隨機(jī)選出雌性小白鼠30只和雄性小白鼠15只按原分組給予不同劑量的鉬，8周后，再?gòu)拿拷M中隨機(jī)選取雌性小白鼠10只和5只雄性小白鼠合籠飼養(yǎng)。待其產(chǎn)仔，如此往復(fù)，使小鼠繁殖到第四代（F3代）。對(duì)第三代（F2代）、第四代（F3代）小鼠進(jìn)行眼球采血，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定血清中黃嘌呤氧化酶的吸光度值，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，鉬暴露F2代、F3代小鼠與對(duì)照組相比黃嘌呤氧化酶活性顯著降低（P<0.05），且隨鉬暴露劑量的提高呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)；同等劑量鉬暴露下，黃嘌呤氧化酶活性呈現(xiàn)F3代高于第F2代的趨勢(shì)，其中Mo-200組差異顯著（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：鉬；黃嘌呤氧化酶；中毒；代謝異常

鉬是動(dòng)植物必需的微量元素之一。鉬在動(dòng)物體內(nèi)含量為約1～4 mg·kg-1體重。動(dòng)物在腸道內(nèi)吸收六價(jià)水溶性鉬化合物非常迅速，一些不溶性鉬化合物也可在腸道內(nèi)吸收。鉬為反芻動(dòng)物消化道內(nèi)微生物生長(zhǎng)因子，可為微生物吸收而長(zhǎng)時(shí)間的滯留在消化道內(nèi)，瘤胃微生物的含鉬硝酸還原酶參與瘤胃中硝酸鹽的轉(zhuǎn)化，并為瘤胃中微生物消化飼料中粗纖維提供幫助。鉬銅比例失調(diào)會(huì)出現(xiàn)鉬中毒，牧草中鉬含量為10～12 ppm時(shí)，硫含量也較高，反芻動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)缺銅鉬中毒，牛表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，體重減輕等癥狀，綿羊則會(huì)出現(xiàn)腹瀉、骨和結(jié)締組織的病變，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)突發(fā)性骨折[1]。鉬對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育和遺傳起著重要作用。鉬的缺乏或過(guò)多將會(huì)導(dǎo)致腹瀉、生長(zhǎng)停滯、體質(zhì)下降等癥狀，對(duì)牛、羊的影響較大，對(duì)豬、禽的影響較小。飼料中鉬的含量一般在2～5 mg·kg-1，谷物、豆類和青草是鉬的良好來(lái)源，玉米及薯類中鉬含量偏低，豆餅和動(dòng)物副產(chǎn)品中的鉬則難以利用。植物原料中的鉬含量很大程度上取決于土壤pH，特別是當(dāng)鉬含量與土壤濕度都比較高時(shí)，隨著土壤pH增加鉬的含量會(huì)有所增加。

1938年，F(xiàn)erguson等首先報(bào)道在英國(guó)薩默塞特地區(qū)放牧的牛和綿羊流行1種原因不明的嚴(yán)重腹瀉，該病已有100多年的流行史，由于腹瀉為其主要癥狀，當(dāng)時(shí)定名為“腹瀉病”。1981年，樊璞等報(bào)道，贛南大余縣由于鎢鉬選礦廠含鉬尾砂水污染飲水及土壤，鉬逐漸沉積形成高鉬土壤，該地區(qū)生長(zhǎng)的青草，特別是稻草含鉬量過(guò)高，因而造成耕牛的“紅皮白毛癥”。該病臨床表現(xiàn)為持續(xù)性腹瀉，皮膚發(fā)紅，被毛褪色[2]。

本試驗(yàn)通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室條件下建立小鼠的鉬暴露模型，研究鉬長(zhǎng)期暴露條件下小鼠血清中黃嘌呤氧化酶（XOD）含量的變化及其代謝情況，以期為以后鉬中毒的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

選擇二月齡的清潔級(jí)小鼠60只，其中雌性40只和雄性20只（由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.1.2試驗(yàn)日糧配方

白面25％，麩皮18％，酵母粉1％，玉米面20％，骨粉3％，高梁面15％，魚(yú)粉4％，食鹽1％，豆餅面22％，雞蛋1％，魚(yú)肝油1％，骨肉粉2％，魚(yú)肝油1％。

1.1.3試驗(yàn)試劑

蒸餾水，鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O），XOD測(cè)定試劑盒（購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司）。

1.1.4試驗(yàn)器材

分光光度計(jì)，標(biāo)簽紙，燒杯，200 μL微量移液器及槍頭，水浴箱，離心機(jī)及離心管。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)動(dòng)物的處理

試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

F0代小鼠的飼養(yǎng)：健康的雌性小鼠40只和雄性小鼠20只，適應(yīng)5 d后，隨機(jī)分成4組，每組雌性10只和雄性小白鼠5只，雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)，自由采食，基礎(chǔ)日糧相同，飲水中加入不同劑量的鉬（以Na2MoO4·2H2O形式），分別是對(duì)照組（0）、低鉬組（100 mg·L- 1）、中鉬組（200 mg·L- 1）、高鉬組（400 mg·L-1）。4周以后，雌雄合籠養(yǎng)，產(chǎn)仔后從每組仔鼠中隨機(jī)選取雌性小白鼠30只和雄性小白鼠15只按原分組給予不同劑量的鉬，8周后，再?gòu)拿拷M中隨機(jī)選取雌性小白鼠10只和雄性小白鼠5只合籠飼養(yǎng)。待其產(chǎn)仔，如此往復(fù)，使小鼠繁殖到F3代。使其F2、F3代采取眼球血為試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2血清的獲取

試驗(yàn)采用眼球摘除采血法。將小鼠固定后，采血者的左手拇食兩指從背部較緊地握住小鼠的頸部（大鼠采血需帶上紗手套），應(yīng)防止動(dòng)物窒息。當(dāng)取血時(shí)左手拇指及食指輕輕壓迫動(dòng)物的頸部?jī)蓚?cè)，使眶后靜脈叢充血。右手持彎頭鑷子將一側(cè)凸出眼眶的眼球摘除，同時(shí)，助手持試管收集血液，在采血過(guò)程中可擠壓小鼠后軀以使血液回流，方便得到足夠血液量。若得到的血量不夠后，在小鼠死亡前可摘除另一側(cè)眼球。采取的血液以3 000～4 000 r·min-1的速度進(jìn)行離心10 min處理，放于-20℃的條件下進(jìn)行保存。

1.2.3黃嘌呤氧化酶的測(cè)定

XOD的測(cè)定方法見(jiàn)表2。

表2　黃嘌呤氧化酶的測(cè)定方法

血清中XOD活性計(jì)算方法見(jiàn)式1。血清在37℃轉(zhuǎn)化1 μmol·L-1·min-1的底物所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。

式1中，ODU為測(cè)定管U的吸光度值；ODB為空白管B的吸光度值；N為反應(yīng)液總體積/取樣量；C為光徑；t為反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，染毒組與對(duì)照組的檢查結(jié)果進(jìn)行兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1鉬暴露毒性

在飼喂小鼠過(guò)程中，未發(fā)現(xiàn)飼喂鉬的小鼠與正常組的小鼠有何差異，只是鉬400組小鼠在F2代之后產(chǎn)子數(shù)明顯減少，繁殖周期延長(zhǎng)且所產(chǎn)子成活率較低。在解剖過(guò)程中，只有高劑量組小鼠的肝脾腫大，其他組均未出現(xiàn)明顯的外觀變化。

2.2鉬暴露對(duì)小鼠黃嘌呤氧化酶活性的影響

鉬對(duì)小鼠血清X(qián)OD的影響見(jiàn)表3。

表3　鉬對(duì)小鼠血清黃嘌呤氧化酶的影響　U·L-1

由表3可知，鉬暴露F2代小鼠與對(duì)照組F2代相比黃嘌呤氧化酶活性顯著降低（P<0.05），且隨鉬暴露劑量的提高呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)；但鉬暴露組中Mo-200與Mo-400第F2代差異不顯著（P>0.05）；鉬暴露F3代小鼠與對(duì)照組F3代相比黃嘌呤氧化酶活性顯著降低（P<0.05），但鉬暴露組中Mo-100與對(duì)照組F3代差異不顯著（P>0.05），且隨鉬暴露劑量的提高呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)；同等劑量鉬暴露下，黃嘌呤氧化酶活性呈現(xiàn)F3代高于第F2代的趨勢(shì)，其中Mo-200組差異顯著（P<0.05）。

3　討論

3.1鉬暴露毒性分析

鉬暴露可影響小鼠生殖系統(tǒng)的正常功能，并可引起不育或畸形。有研究表明，鉬可直接作用于睪丸組織，作用于生精過(guò)程和精子的成熟過(guò)程，使精子形態(tài)發(fā)生異常改變，畸變精子異常增加。精子數(shù)目和形態(tài)的改變均可導(dǎo)致受孕力下降。其還可能通過(guò)損傷間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞，影響精子的生成、發(fā)育，造成生殖器官萎縮，性功能異常等。

張才等研究表明，攻鉬后的小鼠表現(xiàn)為尸體消瘦，脫水嚴(yán)重，內(nèi)臟器官顏色變淡，肝臟腫大、淤血，腎臟腫大、呈暗紅色、淤血等，試驗(yàn)中用的是飼料中更高劑量的鉬酸銨，而本試驗(yàn)采取的是飲用水中少劑量的鉬酸鈉，雖然在前兩代中小鼠臨床上沒(méi)有明顯的變化，但是在F2、F3出現(xiàn)了繁殖障礙與張才等的研究結(jié)果相似[3]。

3.2鉬暴露對(duì)黃嘌呤氧化酶的影響

DeRenzo等研究發(fā)現(xiàn)，飼料中的鉬含量對(duì)大鼠組織中黃嘌呤氧化酶的活性影響明顯，研究表明鉬是黃嘌呤氧化酶等的組分，并與其活性密切相關(guān)。XOD是一種需氧脫氫酶類。其由兩個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基含有1個(gè)鉬原子、兩個(gè)Fe2S2（SR）原子簇和1個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），該酶是核酸代謝的重要酶類，同功酶測(cè)定XOD不僅含有鉬和鐵，還含有銅，硫可以促進(jìn)鉬的吸收、儲(chǔ)存、排泄及生物學(xué)作用，其作用機(jī)理可能是MoO42-與代謝產(chǎn)生的S2-結(jié)合產(chǎn)生硫代鉬酸鹽，再結(jié)合銅形成難吸收的硫代鉬酸銅，從而減少了銅的吸收，加劇了鉬中毒。本試驗(yàn)研究表明，血漿中XOD均是隨著鉬劑量的增加而活性降低，說(shuō)明高劑量的鉬可能抑制了XOD某一組分的活性，所以XOD的降低有可能與XOD在高鉬環(huán)境下銅的大量消耗使銅儲(chǔ)備耗竭，使得活性下降。XOD產(chǎn)生于肝臟中，高劑量鉬使肝損傷，這也可能是造成XOD下降的一個(gè)原因。

4　小結(jié)

小鼠飲用高劑量的鉬，血清中XOD活性降低，表明高劑量的鉬干擾了小鼠的正常代謝[4-6]。本試驗(yàn)研究表明，含銅鉬酶的變化都與銅有一定的關(guān)系，多個(gè)鉬酶之間聯(lián)系還有待于進(jìn)一步研究。

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The Influence of Molybdenum on Xanthine Oxidase Activity in Mice

MA Yingying1,ZHANG Lei2
（1.Disease Control and Prevention Center,Kaifeng,475000,Henan China; 2.Detection and Test Center of Animal Products Quality,Kaifeng,475000,Henan China）

Abstract:Molybdenum is one of the essential trace minerals in the plants and animals.It can lead to various disease of plants and animals if the body content too much.To explore the long-term the influence of molybdenum in animal serum enzyme activity,selected 40 male mices and 20 female mices(F0),five days later,randomly divided into 4 groups,5 male and 10 female mices in each group,free based diet to gather the food,drinking water adding different doses of molybdenum(in the form of Na2MoO4·2H2O),randomly divided into four group:control group (0 mg·L(-1)),low molybdenum group(100 mg·L(-1)),molybdenum group(200 mg·L(-1)) and high molybdenum group (400 mg·L(-1)).After 4 weeks,male and female in captivity,randomly selected from each group of young rats af?ter parturition 30 males and 15 females,according to the original group given different doses of molybdenum.After eight weeks,female rats were randomly selected from each group of 10 and 5 male rats,and made mices bred to the fourth generation(F3generations).Of third generation (F2generation),and the fourth generation (F3) mice eyeball blood were collected,using ultraviolet spectrophotometer to determine the serum absorbance value,using SPSS 11.5 statistical software for statistical data analysis,the results showed that exposure of molybdenum F2and F3generation mice xanthine oxidase activity decreased significantly compared with control group(P<0.05),and it was downwardbook=37,ebook=42trend with the increase of molybdenum exposure dose; with the same molybdenum exposure dose,xanthine oxidase activity showed a trend of F3generation is higher than that in the F2generation,the Mo-200 group significant differ?ence (P<0.05).

Key words:molybdenum; yellow purine oxidase(XOD); poisoning,metabolic abnormalities

作者簡(jiǎn)介：馬英英（1986-），女，河南開(kāi)封人，助理獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫。

收稿日期：2016-01-18

中圖分類號(hào)：S858.91；Q55

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-0084（2016）03-0036-04