一種基于PCR技術(shù)快速篩選低能離子注入重組菌株的方法

錢衛(wèi)東， 周穎欣， 吳啟航， 蔡長(zhǎng)龍

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021； 2.西安工業(yè)大學(xué) 光電工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

?

一種基于PCR技術(shù)快速篩選低能離子注入重組菌株的方法

錢衛(wèi)東1， 周穎欣1， 吳啟航1， 蔡長(zhǎng)龍2

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安710021； 2.西安工業(yè)大學(xué) 光電工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：為拓展基于低能離子注入介導(dǎo)藥用植物基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母、構(gòu)建能生產(chǎn)天然產(chǎn)物的酵母重組菌的廣泛應(yīng)用，以目標(biāo)產(chǎn)物龍膽苦苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因(GGPPS，MECPS和MECT)為分子篩選標(biāo)記，以基于低能離子注入隨機(jī)轉(zhuǎn)化重組菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)其高通量初篩，利用HPLC方法對(duì)初篩所得菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測(cè).結(jié)果，從1 072株轉(zhuǎn)化酵母菌中初篩出12株候選酵母重組菌，經(jīng)HPLC復(fù)篩后，其中5株重組酵母菌的發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)出龍膽苦苷.研究表明，此PCR篩選方法，具有高效、簡(jiǎn)單、周期短、廉價(jià)、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于低能離子注入介導(dǎo)基因組DNA大分子隨機(jī)轉(zhuǎn)化酵母，構(gòu)建能生物合成天然產(chǎn)物的酵母重組菌的研究中.

關(guān)鍵詞：PCR快速篩選； 低能離子注入； 關(guān)鍵酶； 重組酵母菌

0引言

龍膽苦苷(Gentiopicroside)，為倍半萜屬裂環(huán)環(huán)烯萜苷類化合物，是中藥藥用植物秦艽(Gentiana Macrophylla Pall.)的主要次生代謝產(chǎn)物，研究表明，龍膽苦苷具有重要的藥理作用，其單一化合物粉針劑秦龍苦素，屬中藥一類新藥，在黃疸型病毒性肝炎的治療方面具有顯著的療效[1-3].但隨著臨床的需求量逐漸增加，秦艽野生資源也在急劇下降，現(xiàn)今已被列為國家三級(jí)野生保護(hù)藥材[4]，因此尋求并研究其新的藥源途徑成了一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[5].

近年來，合成生物學(xué)因其在尋求新型藥源和藥源種質(zhì)改良方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，逐漸成為當(dāng)今國際生藥學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一.Ro等[6]通過構(gòu)建酵母工程菌生產(chǎn)抗瘧疾藥物青蒿素(Artemisinin)前體-青蒿酸(Artemisic Acid)，產(chǎn)量達(dá)到約100 mg/L.Ajikumar等[7]將植物的催化酶引入上述工程菌中，產(chǎn)生大量抗癌藥紫杉醇(Taxol)前體紫杉二烯(Taxadiene)，產(chǎn)量高達(dá)1.02 g/L.因此，將藥用有效成分生物合成代謝基因?qū)胛⑸锼拗髦袠?gòu)建工程菌，實(shí)現(xiàn)其定向生產(chǎn)，這已成為生產(chǎn)藥用有效成分的重要途徑之一.

但利用合成生物學(xué)方法對(duì)微生物宿主進(jìn)行遺傳改造生產(chǎn)藥用有效成分，需要具備一個(gè)前提條件，即需要已知生物合成該藥用有效成分的分子機(jī)理.然而大多數(shù)藥用植物遺傳背景不清楚，代謝途徑信息缺乏，遺傳及功能基因的研究亦較為薄弱，致使常規(guī)的合成生物學(xué)方法目前主要應(yīng)用于構(gòu)建產(chǎn)具有高附加值天然產(chǎn)物的細(xì)胞工廠的研究中，如用于抗癌藥物紫杉醇.

近年來，低能離子注入技術(shù)在超遠(yuǎn)緣遺傳育種方面具有較為顯著地優(yōu)勢(shì)，其無需事先清楚藥用植物的次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和相關(guān)基因信息的情況下，對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)藥用植物代謝產(chǎn)物工程菌的成功構(gòu)建.呂杰等[8]運(yùn)用Ar+和N+注入介導(dǎo)藍(lán)麻黃(Ephedrae)基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母，獲得遺傳穩(wěn)定酵母工程菌，麻黃堿(Ephedrine)和偽麻黃堿(Pseudoephedrine)產(chǎn)量分別為18.85 mg/L和4.11 mg/L.

然而，低能離子注入技術(shù)轉(zhuǎn)化是一種無篩選標(biāo)記的分子遺傳育種方法，目前，篩選工程菌大多是根據(jù)目的產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)，利用定性標(biāo)識(shí)去篩選.該方法工作量大，步驟繁瑣，大大影響了目的工程菌的篩選效率.為此，本文以龍膽苦苷生物合成途徑[9,10]中3個(gè)關(guān)鍵酶基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，利用PCR技術(shù)建立了一種高通量初篩方法，再結(jié)合HPLC對(duì)初篩菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分析確定.該方法簡(jiǎn)單快捷、省時(shí)省力、廉價(jià)、準(zhǔn)確性高，大大提高了工作效率，降低了工作成本，為基于低能離子注入介導(dǎo)的合成生物學(xué)的廣泛應(yīng)用提供了有力支撐.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

多形漢遜酵母(Hansenula Polymorpha)DL-1菌株，來源于中國工業(yè)微生物保藏中心，編號(hào)為ATCC No.26012.

1.1.2酶和主要試劑

2×Taq PCR MasterMix購于天根生化科技有限公司，PCR 引物由上海生工公司合成，龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma 公司上海金穗生物科技有限公司.其它化學(xué)試劑均購于天津市科密歐化學(xué)試劑公司.

1.1.3主要儀器與設(shè)備

凝膠成像分析儀( UVP)，PCR儀(Eppendorf)，Ddevic1多功能離子束注入機(jī)(IBB，陜西省薄膜技術(shù)與光學(xué)檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，冷凍離心機(jī)(Sigma)，高效液相儀(美國Waters).

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)

選取萜類物質(zhì)生物合成途徑中的香葉基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)、2-甲基-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(2-C-methyl erythritol-2，4-cyclodiphosphate synthase，MECPS)、2-甲基赤蘚醇-4-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶(2-C-methyl erythritol-4-phosphate cytidyltransferase，MECT) 三個(gè)基因?yàn)楹Y選標(biāo)記.根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的氨基酸序列，根據(jù)其氨基酸序列組成，對(duì)其進(jìn)行blast序列比對(duì)，找出與其同源性較高的氨基酸序列3～5條，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件codehop對(duì)其分別設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的簡(jiǎn)并引物，如表1所示.

表1　PCR引物序列

1.2.2 秦艽基因組總DNA的提取

基因組提取[11,12]：取秦艽保存嫩葉剪碎，于液氮研磨至細(xì)粉狀，與預(yù)熱CTAB緩沖液研磨攪拌混勻，分裝，65 ℃水浴后冷卻.加入酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)，輕輕震蕩搖勻至乳白色，離心，取上清，再加入預(yù)冷異丙醇，混勻，有白色絮狀物析出，置-20 ℃冷卻30 min.離心取白色沉淀，75%乙醇洗滌數(shù)次，離心，棄上清，得DNA，65 ℃水浴烘干，TE溶解，-20 ℃保存，并用瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法分別檢測(cè)DNA質(zhì)量.

1.2.3PCR篩選體系的建立

以秦艽總基因組DNA為模板，分別用GGPPS、MECPS、MECT 3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.反應(yīng)體系20μL：2×Taq PCR MasterMix 10μL，引物(濃度為10μM)各1μL，模板2μL(濃度為2μg/mL )，ddH2O調(diào)整終體積為20μL.反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；循環(huán)35次：94 ℃ 30 s；Tm 45 s，72 ℃ 1 min；72 ℃ 7 min.為提高PCR擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物退火溫度，以57 ℃為基礎(chǔ)，以0.5 ℃遞加，直至62 ℃，確定其各自Tm值.PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析.

1.2.4低能離子注入介導(dǎo)秦艽總基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母

低能離子注入介導(dǎo)秦艽總基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母[13]：37 ℃活化菌種8～10 h，稀釋菌體濃度至1.0×107 CFU/mL.取100μL菌懸液均勻涂布于無菌玻璃平板中央，吹干形成菌膜.將其置于離子注入機(jī)，在10-3Pa 真空下脈沖10 s注入N+，立即將秦艽總基因組DNA涂于菌膜使其充分接觸，2 h后刮下菌膜涂布于YPD平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落.

1.2.5重組酵母菌株基因組DNA的提取

取1.5 mL酵母菌懸液，離心，收集菌體；無菌水洗滌2次，棄上清液，加入600μL細(xì)胞裂解液(200 mmol/L LiOAC、1% SDS溶液)，沸水浴中煮20 min.離心，取上清液，即得酵母基因組DNA模板，-20 ℃保存，備用.

1.2.6利用PCR方法高通量初篩重組酵母菌株

(1)以轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板和以GGPPS-F/GGPPS-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，選取含GGPPS基因的候選轉(zhuǎn)化子.

(2)以(1)所得候選菌株為研究對(duì)象，以其基因組DNA為模板和MECPS-F/MECPS-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析.獲得同時(shí)含有GGPPS、MECPS基因的轉(zhuǎn)化子.

(3)以(2)所得候選轉(zhuǎn)化子為研究對(duì)象，以其基因組DNA為模板和MECT-F/MECT-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析.獲得含有GGPPS、MECPS、MECT基因的候選轉(zhuǎn)化子.

1.2.7HPLC對(duì)候選重組酵母菌的復(fù)篩

將1.2.4所得候選重組酵母菌，進(jìn)行液體發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行提取分離，利用HPLC對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析.HPLC色譜條件[14,15]：C18(250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相為甲醇∶水(3∶7)；體積流量為1.0 mL/ min；柱溫:25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；進(jìn)樣量:10μL.

2結(jié)果與討論

2.1秦艽總基因組DNA提取

將秦艽基因組分別進(jìn)行OD值測(cè)定及電泳檢測(cè).結(jié)果其OD260/280比值為1.89，凝膠電泳條帶較為清晰，如圖1所示,表明所提秦艽基因組DNA質(zhì)量良好，無過多蛋白及RNA等雜質(zhì)影響.

圖1　秦艽總基因組DNA凝膠電泳圖

2.2PCR篩選體系的建立

以秦艽基因組為模板，分別以GGPPS、MECPS、MECT為分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增.優(yōu)化擴(kuò)增條件，結(jié)果確定其三個(gè)基因片段退火溫度依次為61 ℃、61 ℃、60 ℃.凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果依次得到相應(yīng)擴(kuò)增條帶，分別見圖2所示，片斷大小和理論預(yù)計(jì)大小相符,表明此PCR篩選體系成功建立，可用于重組菌株的篩選工作.

M泳道為Maker，1、5泳道為GGPPS基因擴(kuò)增條帶，2、3、4泳道為酵母陰性對(duì)照(a)GGPPS基因PCR電泳圖

M泳道為Maker，1、2泳道為MECPS基因擴(kuò)增條帶，3泳道為酵母陰性對(duì)照(b)MECPS基因PCR電泳圖

M泳道為Maker,2、4泳道為MECT基因擴(kuò)增條帶；1、3泳道為酵母陰性對(duì)照(c)MECT基因PCR電泳圖圖2　 GGPPS、MECPS、MECT基因PCR電泳圖

2.3PCR重組酵母菌株初篩

M泳道為Maker，2泳道為GGPPS基因的陽性轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增條帶，1、3泳道為GGPPS基因的陰性轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增條帶(a)轉(zhuǎn)化子GGPPS基因PCR篩選

M泳道為Maker，1、2、5泳道為MECPS基因的陽性轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增條帶，3、4泳道為MECPS基因的陰性轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增條帶(b)轉(zhuǎn)化子MECPS基因PCR篩選

M泳道為Maker，3、4、5泳道為MECT基因的陽性轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增條帶，1、2泳道為MECT基因的陰性轉(zhuǎn)化菌擴(kuò)增條帶(c)轉(zhuǎn)化子MECT基因PCR篩選圖3　轉(zhuǎn)化子GGPPS、MECPS、MECT基因PCR篩選

以基于低能離子注入介導(dǎo)秦艽總基因組轉(zhuǎn)化酵母獲得的1 072株重組酵母菌為研究對(duì)象，分別提取其基因組DNA，首先以GGPPS為目標(biāo)基因?qū)赀M(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，得到132株候選重組酵母菌；以上述132株重組酵母為研究對(duì)象，以MECPS為目標(biāo)基因分別對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，得到22株重組酵母菌株；再以上述22株重組酵母為研究對(duì)象，以MECT為目標(biāo)基因分別對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，得到12株重組酵母菌.凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果依次得到相應(yīng)擴(kuò)增條帶，分別見圖3所示，上述結(jié)果表明秦艽相關(guān)酶基因GGPPS、MECPS、MECT經(jīng)低能離子注入介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，其隨機(jī)整合到了酵母基因組中.

2.4HPLC對(duì)候選重組酵母菌的復(fù)篩

將12株重組酵母菌進(jìn)行YPD液體發(fā)酵，提取發(fā)酵液，利用HPLC進(jìn)行龍膽苦苷產(chǎn)物檢測(cè)分析.如圖4所示，有5株重組酵母菌的發(fā)酵液中檢測(cè)到目標(biāo)產(chǎn)物龍膽苦苷.結(jié)果表明，PCR方法可高通量用于基于低能離子注入介導(dǎo)的植物基因組轉(zhuǎn)化酵母、構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物的酵母重組菌中.

(a)龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測(cè)圖譜

(b)重組酵母菌發(fā)酵液HPLC檢測(cè)圖譜圖4　重組菌株發(fā)酵液的HPLC檢測(cè)圖譜

3結(jié)論

目前，基于離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建重組菌株的篩選方法是根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)特性進(jìn)行檢識(shí)篩選，例如毛培宏等[16]利用顏色反應(yīng)對(duì)低能離子注入介導(dǎo)麻黃基因組轉(zhuǎn)化酵母中重組菌株進(jìn)行篩選，研究人員從3000多株重組菌中篩選獲得9株產(chǎn)麻黃堿酵母重組菌株，表明，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)設(shè)計(jì)的篩選方法用于篩選重組菌株存在篩選效率低、工作量大、檢測(cè)限高、篩選周期長(zhǎng)等問題.在本研究中，我們將檢測(cè)限較高的化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殪`敏度非常高的PCR方法，來實(shí)現(xiàn)重組菌株的高通量初篩，這極大地提高了篩選效率.

此外，針對(duì)大多數(shù)天然產(chǎn)物生物合成途徑尚未解析的背景下，利用藥用植物的次生代謝產(chǎn)物的屬性，如盡管龍膽苦苷的生物合成途徑尚不清楚，且相關(guān)生物合成基因信息未知的情況下，依據(jù)龍膽苦苷屬于萜類化合物的特性，根據(jù)萜類化合物的生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因信息，創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選.這為基于低能離子注入技術(shù)介導(dǎo)藥用植物基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物的酵母重組菌提供了新方法，為拓展低能離子注入介導(dǎo)的合成生物學(xué)的廣泛應(yīng)用提供了新途徑.

參考文獻(xiàn)

[1] 陳雷,王海波,孫曉麗,等.龍膽苦苷鎮(zhèn)痛抗炎藥理作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008，20(5):903-906.

[2] 陳長(zhǎng)勛,劉占文,孫崢嶸,等.龍膽苦苷抗炎藥理作用研究[J].中草藥,2003,34(9):814-816.

[3] Y Wang,L Y Yang.In vitro inhibition and induction of human liver cytochrome P450 enzymes by gentiopicroside:Potent effect on CYP2A6[J].Drug Metab Pharmacokinet,2013,28(4):339-344.

[4] 張海龍.基于生態(tài)位模型的傳統(tǒng)中藥秦艽潛在地理分布研究[D].西安：陜西師范大學(xué),2014.

[5] Tiwari R K,M Trivedi M,Guang Z C,et al.Genetic transformation of Gentiana macrophylla with agrobacterium rhizogenes:Growth and production of secoiridoid glucoside gentiopicroside in transformed hairy root cultures[J].Plant Cell Rep,2007,26(2):199-210.

[6] Dae Kyun Ro，Eric M.Paradise，Mario Ouellet，et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast[J].Nature,2006,440(1 038):940-943.

[7] Ajikumar P K,Xiao W H,Tyo K E,et al.Isoprenoid pathway optimization for taxol precursor overproduction in escherichia coli[J].Science,2010,330(6 000):70-74.

[8] 呂杰,金湘.氮離子注入介導(dǎo)麻黃基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母菌[J].中草藥,2008,39(8):1 227- 1 230.

[9] 王彩云,張曉東,沈濤,等.龍膽苦苷生物合成途徑研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(3):4-10.

[10] 劉萬宏,陳敏,廖志華,等.銀杏內(nèi)酯的生物合成途徑及生物技術(shù)研究進(jìn)展[J].中草藥,2007,38(6):941-945.

[11] 羅意,范海闊,黃綿佳,等.3種椰子基因組DNA提取方法的比較[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(27):154-158.

[12] 張娟，吳煒亮，譚嘉力,等.植物源性轉(zhuǎn)基因食品DNA 提取技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2015,36(7):396-400.

[13] 付云芳.低能N+注入介導(dǎo)秦艽基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母的研究[D].西安：陜西科技大學(xué),2013.

[14] 趙瑞芝,梁偉杰,丘小惠,等.龍膽藥材中龍膽苦苷的提取工藝研究[J].中國藥房,2005,16(12):956-957.

[15] 郝保華,孫文基,支朝暉,等.超聲提取HPLC法測(cè)定秦艽中龍膽苦苷的含量[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,34(1):81-84.

[16] 毛培宏,馬向東,金湘,等.氬離子注入介導(dǎo)麻黃基因組DNA轉(zhuǎn)化獲得產(chǎn)麻黃堿重組酵母菌[J].微生物學(xué)報(bào),2007,47(5):905-909.

【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

A new method for rapid screening of low energy ion injected recombinant strain by PCR technology

QIAN Wei-dong1， ZHOU Ying-xin1， WU Qi-hang1， CAI Chang-long2

(1.School of Food and Biological Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China；2.College of Optoelectronic Engineering， Xi′an Technological University， Xi′an 710021， China)

Abstract:To expand application widely based on low energy ion beam mediating medicinal plants transformed yeast genomic DNA and constructing capable of producing natural products in recombinant yeast strains.In this paper,gentiopicroside biosynthetic pathway of key enzyme genes (GGPPS,MECPS and MECT) act as molecular screening marker.Recombinant strains DNA was amplificated for PCR,which transformed to obtain as a template based on inject ation low energy ions to achieve high throughput screening for recombinant yeast strains.And the fermentation products abtained by screening strain were analyzed in HPLC.12 candidate recombinant yeast strains were screened from 1 072 transformed yeast by HPLC repeat screening, and 5 strains of fermentation product was detected gentiopicroside.The result showed the PCR screening method was efficient,simple,short cycle,the advantages of low-cost,easy operation, which was suitable for low energy ion beam mediated genomic DNA molecules randomly transformed yeast,and applied in biosynthesis of natural products for yeast recombinant strains.

Key words:PCR rapid screening； low energy ion implantation； key enzyme； recombinant yeast

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2016)02-0139-05

作者簡(jiǎn)介:錢衛(wèi)東(1980-)，男，安徽蕪湖人，副教授，博士，研究方向：高附加值、天然產(chǎn)物資源開發(fā)與利用

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11575149); 西安工業(yè)大學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(ZSKJ201405)

收稿日期:2015-12-13