鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)及重新分離方法初探*

李翠，楊世發(fā)，林樹乾，李桂明，趙增成，黃中利，傅劍，宋敏訓(xùn)，馮敏燕**

（1.山東師范大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250355）

鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)及重新分離方法初探*

李翠1，2，楊世發(fā)2，林樹乾2，李桂明2，趙增成2，黃中利2，傅劍2，宋敏訓(xùn)2，馮敏燕2**

（1.山東師范大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250355）

本文通過以不同比例及在不同時間接種鴨疫里黙氏桿菌和大腸桿菌，共同培養(yǎng)一段時間后用鑒別培養(yǎng)平板對共同培養(yǎng)物實施分離，從而建立了鴨疫里黙氏桿菌和大腸桿菌共同培養(yǎng)并重新分離的方法，為體外研究鴨疫里黙氏桿菌和大腸桿菌共同感染引起的家禽疾病的耐藥性解決了技術(shù)難題。

鴨疫里默氏桿菌；大腸桿菌；混合培養(yǎng)；分離

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是引起鴨疫里默氏桿菌?。≧iemerella anatipestifer infection）的病原菌。鴨疫里默氏桿菌病引起幼鴨急性或慢性敗血性傳染，是嚴(yán)重危害全世界養(yǎng)鴨業(yè)的一種主要疾病[1]。大腸桿菌是已報道造成家禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的細(xì)菌病的病原體。臨床上鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌?；旌细腥荆瑑刹【苁共煌贩N、日齡及性別的鴨感染發(fā)病，以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎為特征性病理變化，臨床診斷很難將兩者區(qū)分開來，并且死亡率高，淘汰率高，對養(yǎng)鴨業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失[2，3]。隨著抗生素的大量使用，兩種菌的抗藥性和耐藥譜不斷擴(kuò)大。臨床治療雖然在藥敏試驗的基礎(chǔ)上指導(dǎo)用藥，然而往往實際治療效果不佳，其原因很可能是因為這兩種菌多混合感染，且擁有各自不同的耐藥譜，抗藥性發(fā)生了種間的水平傳遞，這就使得每種菌的抗藥性都增加，抗菌譜更加擴(kuò)大，導(dǎo)致治療失敗。為了研究鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌在體外混合培養(yǎng)條件下菌株間是否發(fā)生了耐藥性水平傳遞，首先要共同培養(yǎng)這兩種菌。因為RA和E.coli兩種細(xì)菌的培養(yǎng)條件相差很大，體外共同培養(yǎng)時大腸桿菌具有生長優(yōu)勢，確定兩種菌能共同生長并發(fā)生耐藥性傳遞的培養(yǎng)條件并建立這兩種細(xì)菌的體外共同培養(yǎng)及重新分離的方法，是要解決的一大技術(shù)難題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗儀器 超凈工作臺、恒溫振蕩器、CO2培養(yǎng)箱、高壓鍋、電子天平、冰箱。

1.1.2 試驗藥物 藥敏片均購自杭州天和微生物試劑有限公司。慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制劑品檢定所。

1.1.3 試驗試劑 麥康凱瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。麥康凱瓊脂平板、含4%血清胰蛋白胨大豆瓊脂平板、慶大霉素抗性平板按常規(guī)方法配制。

1.1.4 試驗菌株 鴨疫里默氏桿菌P3菌株，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株8099，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種復(fù)蘇 取凍干保存的鴨疫里默氏桿菌P3菌株，取1ml生理鹽水溶解混勻，將混合物接種于TSA平板（加4%血清），CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h，挑取單個菌落接種于TSB培養(yǎng)基中（加4%血清），搖床培養(yǎng)24h。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株活化，同上[4]。1.2.2 藥敏試驗 采用藥敏試紙片法 （k-B法），選取氨基糖苷類及喹諾酮兩大類共9種抗生素按常規(guī)進(jìn)行藥敏試驗[5]。RA P3菌株接種在含4%血清的 TSA平板上，置 CO2培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng) 16～20h；大腸桿菌8099菌株在普通瓊脂平板上培養(yǎng)，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)16～18h。

1.2.3 藥物最小抑菌濃度測定 采用試管雙倍稀釋法測定RA及大腸桿菌對慶大霉素的MIC[5]。

1.2.4 鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)與分離

1.2.4.1 大腸桿菌和RA以不同比例同時接種 將RA以5、10、20、40μl量分別接種于4ml含 4%血清的TSB培養(yǎng)基中，每管再接入5μl大腸桿菌混合，形成大腸桿菌和 RA以1:1、1:2、1:4、1:8不同比例接種量，37℃搖床振蕩培養(yǎng)16～20h，增菌后的混合菌液用生理鹽水稀釋至 3×103CFU/ml和 6× 102CFU/ml，分別取100μl涂布麥康凱平板、含4%血清的TSA平板、慶大霉素抗性板（慶大霉素含量為10μg/ml），CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)20h，觀察結(jié)果，統(tǒng)計菌落個數(shù)。

1.2.4.2 大腸桿菌和RA以不同時間接種 先將5μl RA P3菌株接種于4ml含4%血清的TSB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng) 14～18h之間剛見渾濁時，將 5μl大腸桿菌接種于上述培養(yǎng)基中混合，37℃搖床振蕩培養(yǎng)6、9、12、18h后，按上述方法稀釋涂板，CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)20h，觀察結(jié)果，統(tǒng)計菌落個數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗 鴨疫里默氏桿菌P3菌株對慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、鏈霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氟沙星均為耐藥；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株均為敏感，結(jié)果見表 1。

表1 鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌對化學(xué)藥物的敏感性（抑菌圈直徑：mm）

2.2 藥物最小抑菌濃度（MIC） 試管雙倍稀釋法測得大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株8099對慶大霉素的MIC為5μg/ml，RA對慶大霉素的MIC為 40μg/ml，因此選取10μg/ml的慶大霉素制備抗性板。

2.3 鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌混合培養(yǎng)與分離

2.3.1 大腸桿菌和RA以不同比例同時接種 大腸桿菌和RA以不同比例同時接種，混合培養(yǎng)20h后，稀釋涂板，培養(yǎng)20h后，均無鴨疫里默氏桿菌生長，只有大腸桿菌生長。結(jié)果見表2。

表2 混合菌液稀釋度為3×103CFU/ml和6×102CFU/ml的菌落個數(shù)統(tǒng)計

2.3.2 大腸桿菌和RA以不同時間接種 混合培養(yǎng) 6、9、12h后鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌均生長，繼續(xù)培養(yǎng)18h后混合菌液中只有大腸桿菌，無鴨疫里默氏桿菌生長，結(jié)果見表3。

表3 混合培養(yǎng)6h、9h、12h、18h后不同稀釋度的菌落個數(shù)統(tǒng)計

3 小結(jié)與討論

在臨床上，鴨疫里默氏桿菌病和大腸桿菌病往往在同一個鴨群中混合感染，并且兩者從臨床癥狀與剖檢病變上難以區(qū)分，給治療造成一定困難。本文通過不同比例及不同時間接種對鴨疫里默氏桿菌與大腸桿菌進(jìn)行體外混合培養(yǎng)，通過鑒別培養(yǎng)平板分離混合培養(yǎng)物來優(yōu)選體外混合培養(yǎng)條件。

將大腸桿菌和RA以不同比例同時接種到含4%血清的TSB培養(yǎng)基中，混合培養(yǎng)16～20h后分離檢測，皆無RA生長。這可能與這兩種菌對營養(yǎng)成分要求不同有關(guān)，大腸桿菌對營養(yǎng)成分要求比較低，在普通營養(yǎng)瓊脂上就可以生長旺盛，而鴨疫里默氏桿菌對營養(yǎng)成分及培養(yǎng)條件要求比較高，一般在血液瓊脂或胰蛋白胨大豆瓊脂上生長良好，對營養(yǎng)要求苛刻的菌株需在胰蛋白胨大豆瓊脂中添加0.05%酵母提取物和4%新生牛血清，并且需要增加CO2濃度。同時接種時，大腸桿菌存在競爭優(yōu)勢，與RA進(jìn)行營養(yǎng)競爭，迅速繁殖而造成RA無法增殖。

改變兩種菌的接種時間，先將RA接種到含4%血清的TSB中，搖床培養(yǎng)剛見渾濁時再接入大腸桿菌，混合培養(yǎng)?；旌吓囵B(yǎng)6、9、12h后鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌均生長，而繼續(xù)培養(yǎng)至18h后，因大腸桿菌的競爭優(yōu)勢混合菌液中只有大腸桿菌，無鴨疫里默氏桿菌生長。

因此，體外混合培養(yǎng)鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌時，可以先接種RA培養(yǎng)至剛見渾濁時再接種大腸桿菌，混合培養(yǎng)12h左右為宜。

本研究解決了大腸桿菌和鴨疫里黙氏桿菌共同培養(yǎng)的技術(shù)難題，為下一步研究大腸桿菌和鴨疫里黙氏桿菌的耐藥性轉(zhuǎn)移建立了基礎(chǔ)。

[1] Y.M.Saif.禽病學(xué)[M].高福，索勛，譯.第12版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2012:893.

[2] 倪粒瓊.鴨源大腸桿菌與鴨疫里默氏桿菌原生質(zhì)體融合及其融合子研究 [D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[3] 張大丙，郭玉璞.1999.北京地區(qū)鴨傳染性漿膜炎的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，21（4）:260～263.

[4] 楊靈芝.鴨疫里默氏桿菌的液體培養(yǎng)技術(shù)及免疫原性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[5] 陳東科，孫長貴.實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.1:767-775.

S858.324.4+3

B

1673-1085（2016）04-0006-03

2016-03-08

*項目支撐： 山東省青年自然科學(xué)基金（ZR2012CQ042）， 山 東 省 重 點 研 發(fā) 計 劃（2015GNC113004），山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目資助（編號：SDAIT-13-011-01），山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所基金（2014SJJ02）。

**通訊作者。