L A MP技術(shù)在家禽病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用

宋玉財(cái)，李鵬，王彬，王官曉，唐麗華，梁雪，于小川

（1.山東省煙臺(tái)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東 煙臺(tái) 264000；2.煙臺(tái)市牟平區(qū)龍泉鎮(zhèn)獸醫(yī)站，山東 煙臺(tái) 264112；3.萊陽(yáng)市畜牧獸醫(yī)局，山東 煙臺(tái) 264003）

L A MP技術(shù)在家禽病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用

宋玉財(cái)1，李鵬2，王彬1，王官曉1，唐麗華3，梁雪3，于小川1

（1.山東省煙臺(tái)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東 煙臺(tái) 264000；2.煙臺(tái)市牟平區(qū)龍泉鎮(zhèn)獸醫(yī)站，山東 煙臺(tái) 264112；3.萊陽(yáng)市畜牧獸醫(yī)局，山東 煙臺(tái) 264003）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是由Notomi等建立的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠在63～65℃的等溫條件下擴(kuò)增特定DNA序列,并在30～60min內(nèi)可以觀察到結(jié)果。LAMP已經(jīng)成功用于許多病毒的檢測(cè)，在本文中，主要概述LAMP技術(shù)原理及其在家禽病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用。

LAMP技術(shù)；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；家禽病毒病

1 LAMP技術(shù)原理

1.1 LAMP引物相關(guān) LAMP反應(yīng)需要4條引物，分別針對(duì)靶序列上6個(gè)不同位置，包括一對(duì)外引物F3、B3，另外一對(duì)為內(nèi)引物FIP（Forward inner primer）和BIP（Backward inner primer）。FIP由F1C區(qū)和F2區(qū)構(gòu)成，BIP由B1c區(qū)和B2區(qū)構(gòu)成[1]。圖1為各引物所在位置示意圖。

圖1 LAMP引物位置示意圖

引物設(shè)計(jì)是LAMP反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵，現(xiàn)在通常使用日本榮研株式會(huì)社的在線LAMP引物設(shè)計(jì)程序 PrimerExplore（http://www.primerexplorer. jp/e/）完成設(shè)計(jì)工作，Tm值、引物末端穩(wěn)定性、GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物間距等幾個(gè)方面都會(huì)影響到引物的品質(zhì)。之后的報(bào)道證實(shí)在添加一對(duì)環(huán)狀引物后，可縮短大約一半的LAMP反應(yīng)時(shí)間。

1.2 LAMP反應(yīng)擴(kuò)增原理 在LAMP反應(yīng)的開(kāi)始，F(xiàn)IP引物中的F2片段首先與模板F2c區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，在Bst DNA聚合酶作用下，由模板鏈的3'端向5'端延伸，而后F3引物與模板的F3c結(jié)合，因?yàn)锽st DNA聚合酶具有鏈置換的功能，沿著F3引物擴(kuò)增出的新鏈將之前的互補(bǔ)鏈置換下來(lái)。接著B(niǎo)IP引物的B2片段再與這條被置換下的互補(bǔ)鏈的B2c區(qū)結(jié)合，過(guò)程與之前的F引物相同。一個(gè)循環(huán)下來(lái)就可以得到LAMP反應(yīng)的起始莖環(huán)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2）。在起始結(jié)構(gòu)形成后，循環(huán)便只需要兩條內(nèi)引物參與進(jìn)行，最終產(chǎn)物是一系列含有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA混合物（見(jiàn)圖3）。

圖2 LAMP反應(yīng)的起始結(jié)構(gòu)

圖3 含不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA示意

2 LAMP的產(chǎn)物檢測(cè)

LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)多種方式來(lái)獲得驗(yàn)證。首先最基本的，它和PCR產(chǎn)物一樣可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的方式，與PCR產(chǎn)物電泳后呈現(xiàn)確定大小的單一條帶不同，LAMP產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)下呈現(xiàn)出特有的階梯狀條帶。但是如果僅僅這樣，那LAMP在病原檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)也就不會(huì)那么受人推崇。

第二種，也是最適用于基層臨床檢測(cè)的判斷方法，我們可以向LAMP產(chǎn)物中添加SYBR GreenI等核酸染料，當(dāng)下即能直接通過(guò)肉眼來(lái)觀察結(jié)果。以SYBR Green I為例，不擴(kuò)增的情況反應(yīng)管內(nèi)液體為橙紅色，而有擴(kuò)增產(chǎn)物的情況，反應(yīng)管內(nèi)的液體則是黃色的。如果肉眼觀察還不能肯定結(jié)果，只需將反應(yīng)管置于紫外燈下，在黑暗中呈現(xiàn)明亮熒光的說(shuō)明模板發(fā)生了擴(kuò)增。

第三，在核酸合成過(guò)程中，dNTP不斷析出焦磷酸根離子，剛好與體系中的Mg2+作用生成焦磷酸鎂沉淀，這本來(lái)是副反應(yīng)的產(chǎn)物，卻再次提供了一個(gè)肉眼判斷結(jié)果的方式。LAMP反應(yīng)完成之后，將反應(yīng)管離心，如果在管底側(cè)發(fā)現(xiàn)白色沉淀，即代表了陽(yáng)性結(jié)果。因?yàn)槿庋塾^察總有誤差，2001年日本研制出專用的終點(diǎn)濁度儀來(lái)代替肉眼確定結(jié)果，此后又設(shè)計(jì)出了LAMP實(shí)時(shí)濁度儀，對(duì)定量觀察反應(yīng)各時(shí)刻的擴(kuò)增情況提供了條件。

3 LAMP技術(shù)在家禽病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用

LAMP是2000年由日本學(xué)者Notomi等人開(kāi)發(fā)出的一種新型體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，它能在1h內(nèi)65℃左右的等溫條件下把數(shù)拷貝的DNA擴(kuò)增到至少109拷貝。該報(bào)道還驗(yàn)證了LAMP技術(shù)同時(shí)適用于RNA為模板的情況，添加反轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶共同作用即可。2002年，Nagamine等發(fā)現(xiàn)多增加一對(duì)環(huán)引物（LF、LB）可以加速LAMP反應(yīng)進(jìn)程，其中LF位于模板F1c區(qū)和F2c區(qū)之間，而LB位于B1c區(qū)和B2c區(qū)之間[2]。

LAMP技術(shù)自發(fā)明之后，在動(dòng)植物病原微生物檢測(cè)、動(dòng)物胚胎性別確定以及轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)等多個(gè)方面都開(kāi)展了進(jìn)一步的應(yīng)用。其中在家禽病毒病檢測(cè)方向，侯佳蕾等[3]根據(jù) GenBank中的H5亞型禽流感病毒(H5-AIV)血凝素基因序列，設(shè)計(jì)了1套特異識(shí)別HA基因序列中6個(gè)不同區(qū)段的環(huán)介導(dǎo)恒等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)引物，并以此套引物建立了一種基于LAMP技術(shù)的H5亞型禽流感病毒診斷方法。結(jié)果表明，該方法對(duì)H5-AIVRNA的最小檢測(cè)限為10-6，靈敏性高于一步RT-PCR方法；全部反應(yīng)可在 1.5h內(nèi)完成；在反應(yīng)體系中添加SYBRGREENⅠ染料后，可通過(guò)肉眼觀察有無(wú)熒光直接判定結(jié)果。靈敏性及特異性試驗(yàn)證明，該方法靈敏度高、特異性好，能夠作為H5亞型禽流感病毒的快速診斷方法。

羅思思等[4]根據(jù)GenBank中雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的基因保守序列，設(shè)計(jì)一套環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)特異性引物，建立了IBVRT-LAMP可視化檢測(cè)方法。該法對(duì)IBV RNA最小檢測(cè)限為10fg，而常規(guī)RT-PCR為1pg。靈敏度高于常規(guī)PCR法100倍。對(duì)其他常見(jiàn)雞病原體檢測(cè)結(jié)果均為陰性?？赏ㄟ^(guò)肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果。其建立的IBVRT-LAMP方法簡(jiǎn)便、快捷、特異、靈敏，且只需一個(gè)可控溫的水浴鍋在1h內(nèi)即可完成全部反應(yīng)。更適合基層業(yè)務(wù)部門(mén)及養(yǎng)殖場(chǎng)的檢測(cè)，為IBV感染的快速檢測(cè)提供新方法。

鞠小軍等選取鴨源新城疫病毒NP基因的相對(duì)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物，并優(yōu)化了RTLAMP反應(yīng)體系，能夠在63℃下1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸區(qū)域大量擴(kuò)增。建立的副黏病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法具有快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。Li和Song等根據(jù)已公布的鴨甲型肝炎病毒3D基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物并優(yōu)化LAMP各種反應(yīng)條件，能檢測(cè)出0.3pg的核酸量。謝麗基等針對(duì)鴨甲型肝炎病毒的非編碼基因設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，在61～63℃的水浴中60min即可完成檢測(cè)過(guò)程，并且檢測(cè)的靈敏度高，是常規(guī)RT-PCR的100倍。

尚毅等根據(jù) GenBank中登錄的鵝細(xì)小病毒（GPV）VP3基因序列，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)1套特異識(shí)別VP3基因序列中6個(gè)不同區(qū)段的LAMP引物，建立了一種快速檢測(cè)GPV的LAMP檢測(cè)方法，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好。

康忠惠針對(duì)禽白血病病毒（ALV）gp85區(qū)段設(shè)計(jì)了兩組分別用于檢測(cè) A、B亞群禽白血病的LAMP引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，建立實(shí)現(xiàn)了對(duì)A、B亞群禽白血病的可視化快速檢測(cè)。董嘉文等根據(jù)GenBank中登錄的禽呼腸孤病毒（ARV）S1基因序列，設(shè)計(jì)了特異對(duì)應(yīng)靶序列中的6個(gè)基因區(qū)段的4條引物，以此建立了一種快速、準(zhǔn)確的ARV RT-LAMP檢測(cè)方法。

4 小結(jié)

LAMP技術(shù)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。與其他檢測(cè)方法相比該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增高效、快速、步驟簡(jiǎn)單、鑒定簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。但LAMP技術(shù)的原理較為復(fù)雜，特別是引物的設(shè)計(jì)相當(dāng)專業(yè)；由于敏感性高，假陽(yáng)性困擾結(jié)果的判定；無(wú)法做多重?cái)U(kuò)增；在定量能力方面不如熒光定量PCR等。隨著對(duì)LAMP研究的深入，該技術(shù)將進(jìn)一步優(yōu)化、完善，LAMP技術(shù)將會(huì)在病原微生物，特別是家禽病毒病檢測(cè)方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

[1] Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loopmediated isothermal amplification of DNA [J]. Nucleic Acids Res,2000,28(12):E63.

[2] Nagamine K,Hase T,NotomiT.Accelerated reaction by loop -mediated isothermal amplification using loop primers [J].Mol Cell Probes.2002,16(3):223-229.

[3] 侯佳蕾，羅開(kāi)健，樊惠英等.H5亞型禽流感病毒RTLAMP快速檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2008, 38(12)：1070-1074.

[4] 羅思思，謝芝勛，龐耀珊，等.雞傳染性支氣管炎病毒 RT-LAMP可視化檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012.20.

Application of LAMP technology in poultry virus disease detection

SONG Yu-cai1，LI Peng2，WANG Bin1，WANG Guan-xiao1，TANG Li-hua3，LIANG-Xue3，YU Xiao-chuan1
(1.Yantai Animal Health Authority in Shandong，shandong yantai 264000,China；2.Muping Longquan veterinary station in Yantai，shandong yantai 264112,China；3.Laiyang Animal Husbandry and Veterinary Bureau,，shandong yantai 264003,China；)

Loop-mediated isothermalamplification （LAMP） isan amplification method developed by Notomi et al and has been applied successfully for the detection of many viruses. This paper introduced LAMP technology principle and its application in poultry virus disease detection.

Loop-mediated isothermal amplification;poultry virus disease.

S858.314.4+3

A

1673-1085（2016）04-0053-03

2016-03-16