絲素蛋白降解菌株的篩選及降解效果研究

[摘 要] 從土壤中分離篩選到2株能降解絲素蛋白的放線菌，對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明：產(chǎn)絲素蛋白酶的最佳溫度為30℃，培養(yǎng)基最佳起始pH值是8.0，接種培養(yǎng)12 h的種子液，產(chǎn)酶量較高，以2%的接種量接種酶活較高。

[關(guān) 鍵 詞] 產(chǎn)絲素蛋白酶；菌株篩選；絲素蛋白降解

[中圖分類號(hào)] Q93-33 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [文章編號(hào)] 2096-0603（2016）21-0076-02

蠶絲是人類最早利用的天然蛋白質(zhì)纖維之一。蠶絲中蛋白質(zhì)含量高達(dá)98%以上，主要是由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，其中，絲素蛋白是蠶絲蛋白的主要組成部分，其水解中間產(chǎn)物為絲肽，具有較好的血壓調(diào)節(jié)作用、防止腦老化作用、降血糖活性及抑菌活性等功效。當(dāng)前，絲素蛋白水解可以采用中性鹽解法、酸堿水解法及酶解法等。其中，酶法水解制備絲素肽，因具備成本低、生產(chǎn)條件溫和、高安全性、高選擇性、高穩(wěn)定性和可控性等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的青睞。

在自然界中，存在著各種各樣可以水解蛋白質(zhì)的蛋白酶，但由于絲素蛋白是一種典型的β-角蛋白，很難被普通的蛋白酶降解。土壤中存在著豐富的微生物資源，目前認(rèn)為環(huán)境中至少 90%以上的微生物還沒(méi)有進(jìn)行分離培養(yǎng)。我們注意到，蠶繭、絲綢在土壤中很快會(huì)腐爛、降解，這說(shuō)明其中存在著可以降解、利用絲素蛋白的微生物。

本文主要以土壤為來(lái)源，通過(guò)大量取樣，旨在分離篩選出可降解絲素蛋白的菌株。并從產(chǎn)酶溫度、培養(yǎng)基起始pH、菌株種齡、接種量等方面初步研究該菌株對(duì)絲素蛋白降解效果。力爭(zhēng)為絲素纖維的高效降解轉(zhuǎn)化提供一定的菌種資源和研究依據(jù)。

一、材料

（一）土壤來(lái)源

浙江省各轄市隨機(jī)選取富含枯枝落葉的土壤。

（二）培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基及液體發(fā)酵培養(yǎng)基均參照文獻(xiàn)配方制作。

二、方法

（一）降解絲素蛋白的菌株初篩

初篩得到的菌株用滅菌牙簽點(diǎn)接到鑒別培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48h，選擇菌落周圍產(chǎn)透明圈的菌株，進(jìn)行液體發(fā)酵并測(cè)定酶活。

（二）降解絲素蛋白的菌株復(fù)篩

將產(chǎn)透明圈的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃下160r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每隔24h取樣，3500r/min，離心10min，收集上清液測(cè)定酶活，篩選出纖維素酶高產(chǎn)放線菌菌株，并進(jìn)行酶活的測(cè)定。

（三）菌株產(chǎn)酶條件研究

研究不同溫度、培養(yǎng)基初始pH值、菌株種齡和接種量對(duì)產(chǎn)絲素蛋白酶的影響。

（四）菌株絲素蛋白降解效果的影響

降解率的測(cè)定：將篩選菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)以2%的接種量接種于以絲素蛋白為唯一碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃下160r/min搖床振蕩培養(yǎng)96h，把所得發(fā)酵液過(guò)濾并水洗以除去菌體，干燥后稱重并計(jì)算降解率：

降解率=（降解前質(zhì)量-降解后殘?jiān)|(zhì)量）/降解前質(zhì)量×100%。

三、結(jié)果與討論

（一）絲素蛋白降解菌株的分離純化與篩選

經(jīng)過(guò)初篩，分離純化出18個(gè)菌株，從中篩選出具有酶活性的菌株12株。最后將這12個(gè)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵測(cè)定酶活，最終從樣品中分離篩選出2株能較好地降解絲素蛋白的菌株，并初步判斷2株均為放線菌。2株菌的酶活定量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為96h時(shí)，N6菌株可以達(dá)到90.55U的酶活力，高于N1菌株。所以，可以初步判定，在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，N6菌株酶活力較好。

（二）不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

將菌株N1和N6，同時(shí)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同培養(yǎng)溫度（20℃，25℃，30℃，35℃，40℃）條件下，160r/min，培養(yǎng)96h后，取樣測(cè)酶活，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可知，在溫度為20℃～30℃之間，兩株菌株產(chǎn)酶酶活隨著溫度升高而逐漸增強(qiáng)，30℃～40℃之間，產(chǎn)酶酶活隨著溫度升高而逐漸減弱，并且，在發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，產(chǎn)酶酶活均達(dá)到最高值。由此可知，兩株菌株產(chǎn)酶最佳溫度均為30℃，當(dāng)生長(zhǎng)溫度低于或高于30℃時(shí)，菌體生長(zhǎng)均會(huì)受到限制，生長(zhǎng)量將大大減少，因此，產(chǎn)酶會(huì)減少，酶活亦大大降低。

此外，還可以發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在哪個(gè)溫度條件下培養(yǎng)，N6菌株產(chǎn)酶的酶活均要高于N1菌株。為此，我們可以選擇30℃作為菌株培養(yǎng)的最佳溫度，而選擇N6菌株可以得到較高的酶活。

（三）不同培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

將菌株N1和N6同時(shí)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同初始pH（pH6.0，pH7.0，pH8.0，pH9.0，pH10.0）條件下，160r/min，培養(yǎng)96h后，取樣測(cè)酶活，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可知，培養(yǎng)基初始pH為8時(shí)，菌株產(chǎn)酶酶活力最高，并且可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH為7～9范圍內(nèi)時(shí)，絲素蛋白酶酶活力變化不明顯，但當(dāng)pH低于7或高于9時(shí)，酶活出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。此外，亦可以發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在哪個(gè)pH條件下培養(yǎng)，N6菌株產(chǎn)酶的酶活均要明顯高于N1菌株。為此，我們可以選擇初始pH8作為菌株培養(yǎng)最佳初始pH，而選擇N6菌株可以得到較高的酶活。

（四）不同種齡對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

選擇不同種齡的菌株N1和N6（12h，24h，36h，48h，60h），同時(shí)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，160r/min，培養(yǎng)96h后，取樣測(cè)酶活，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，隨著種齡的增加，N1菌株和N6菌株產(chǎn)酶酶活反而逐漸下降。當(dāng)種齡為12h時(shí)，兩株菌株的酶活均達(dá)到最大值，尤其是N6菌株酶活顯著高于N3，已達(dá)到90U。根據(jù)以上結(jié)果，可選擇培養(yǎng)12h的N6菌株，可達(dá)到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得較高酶活的產(chǎn)絲素蛋白酶。

（五）不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

選擇不同接種量（1%，2%，3%，4%，5%），將菌株N1和N6，同時(shí)接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，160r/min，培養(yǎng)96h后，取樣測(cè)酶活，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，當(dāng)接種量為2%時(shí)，N1菌株和N6菌株產(chǎn)酶酶活均達(dá)到最高值。當(dāng)接種量大于2%時(shí)，隨著接種量增加，酶活反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)，為此，可以選擇2%作為最佳接種量。此外，無(wú)論何種接種量，N6菌株的酶活均顯著高于N1菌株。

（六）不同菌株對(duì)絲素蛋白的降解效果

將篩選出的2株放線菌菌株N1和N6分別接種于以絲素為唯一碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)7d，N1菌株的降解率為68%，N6菌株的降解率為82%，差異不是特別明顯，但N6菌株產(chǎn)酶降解率略微高于N1菌株，這與以上研究產(chǎn)酶條件時(shí)得出的結(jié)果基本相符。

本研究分離篩選出2株產(chǎn)絲素蛋白酶能力較強(qiáng)的放線菌菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，產(chǎn)絲素蛋白酶的最佳溫度為30℃，培養(yǎng)基最佳起始pH值是8.0，接種培養(yǎng)12h的種子液，產(chǎn)酶量較高，以2%的接種量接種酶活較高。本實(shí)驗(yàn)只是進(jìn)行初步研究，要獲得更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，還需開(kāi)展后續(xù)更深入的探究。

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