強(qiáng)筋小麥分子標(biāo)記多重PCR體系的應(yīng)用分析

摘 要 小麥的面筋強(qiáng)度與其高低分子量的谷蛋白亞基種類的組合有著密切的關(guān)系。選取12個(gè)已知的亞基基因所組成的品種為對照，以基因（位點(diǎn)）Dx5、Bx7OE、Ax1、Glu-B3i、Glu-B3與Glu-A3d的標(biāo)記，來構(gòu)建多重的PCR體系。已知基因型與構(gòu)建的多重PCR體系所檢查對照的結(jié)果完全一致，一次的PCR可同時(shí)檢測6個(gè)和強(qiáng)筋有關(guān)的基因（位點(diǎn)）Dx5、Axl/Ax2*、Bx7OE、Glu-B3i、Glu-B3與Glu-A3d。對58個(gè)某省的小麥品種檢查的結(jié)果表明，優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋的亞基基因（位點(diǎn)）Dx5、Axl/Ax2*、Glu-B3i、Glu-B3與Glu-A3d的比例分別是9.5%、56.6%、1.7%、64.3%、33.8%，檢查的58個(gè)品種均不含有Bx7OE基因（位點(diǎn)），攜帶0個(gè)、1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)及以上的基因（位點(diǎn)）品種所占的百分比分別為6.4%、33.8%、48.4%和11.2%。這表明對于強(qiáng)筋亞基基因（位點(diǎn)）的品種，通過聚合優(yōu)質(zhì)亞基基因的育種，可以改善小麥品種的面筋強(qiáng)度和品質(zhì)。研究的強(qiáng)筋小麥分子標(biāo)記多重PCR體系的檢測結(jié)果可靠和穩(wěn)定，可用于強(qiáng)筋小麥品種的選育和小麥品種資源的快速選擇。

關(guān)鍵詞 強(qiáng)筋小麥；小麥品種；PCR體系；亞基基因

中圖分類號：S512；Q812 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.14.001

面筋強(qiáng)度是我國既是全世界小麥育種改良的重要指標(biāo)之一，也是評價(jià)小麥面粉的品質(zhì)的最重要內(nèi)容。小麥面粉的主要成分是醇溶蛋白和麥谷蛋白，他們的組成和含量決定著小麥品質(zhì)的優(yōu)劣，尤其是麥谷蛋白的亞基種類和組成，決定著面制食品的品性。因此，快速檢測與小麥面筋強(qiáng)度品質(zhì)有關(guān)的麥谷蛋白的亞基基因的組成技術(shù)體系的研究和利用，對強(qiáng)筋小麥的育種和評價(jià)有著重要的意義和依據(jù)。目前，已構(gòu)建起的一些與小麥品種相關(guān)性狀的基因檢測的多重的體系，很少涉及基因LMW-GS的檢測，尤其是檢測編碼麥谷蛋白的5個(gè)位點(diǎn)上的強(qiáng)筋亞基基因多重PCR的體系很少有人研究[1]。小麥?zhǔn)窃撌〉闹匾Z食作物，其優(yōu)質(zhì)品種的育成對全國的小麥糧食產(chǎn)量有著重要的作用。因此，本研究選取與面筋強(qiáng)度正相關(guān)基因（位點(diǎn)）的6個(gè)分子標(biāo)記來構(gòu)建多重的PCR體系，用來鑒定該省小麥品種的相關(guān)基因（位點(diǎn)）的是已知的12份的基因型材料。為小麥品種的分子聚合育種和優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源提供高效的方法和途徑，為小麥育種的遺傳基因改良提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小麥品種

選取Glu-A1、Glu-A3、Glu-B1、Glu-B3、Glu-D1位點(diǎn)以及12份1B·1R易位上所包含的各種等位的變異類型材料用來多重PCR體系的驗(yàn)證和開發(fā)。以58個(gè)該省目前所推廣的品種為待測材料。

1.2 測試過程

以已知的對照材料的目標(biāo)基因標(biāo)記和組成來引物擴(kuò)增特異條帶的大小為依據(jù)，用標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系來構(gòu)建多重的PCR體系，對構(gòu)建多重的PCR體系時(shí)，所涉及的Dx5、Bx7OE、Ax1、Glu-B3i、Glu-B3與Glu-A3d的標(biāo)記進(jìn)行退火溫度中梯度PCR來確定每個(gè)基因（位點(diǎn)）標(biāo)記引物適宜退火溫度區(qū)間[2]。（見表1）

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR體系的建立

確立構(gòu)建PCR體系涉及的6對引物基因具有相同的退火溫度后，按照DNA聚合酶、DNTP、原有引物等用量來配制多重PCR體系，進(jìn)行電泳檢測和擴(kuò)增。然后結(jié)合擴(kuò)增結(jié)果，主要從退火溫度、循環(huán)數(shù)、引物用量和延伸時(shí)間等方面進(jìn)行調(diào)試優(yōu)化[3]。通過不斷的調(diào)試優(yōu)化，最終構(gòu)建成了能同時(shí)檢測6個(gè)目標(biāo)基因的PCR體系。

2.2 多重PCR體系的鑒定

在58個(gè)小麥品種中，有20個(gè)品種基因片段擴(kuò)增出968 bp的條帶，25個(gè)品種基因片段擴(kuò)增出919 bp的條帶，37個(gè)品種基因片段擴(kuò)增出637 bp的條帶，1個(gè)品種基因片段擴(kuò)增出619 bp的條帶，5個(gè)品種基因片段擴(kuò)增出449 bp的條帶。

2.3 58種小麥品種的優(yōu)質(zhì)位點(diǎn)的分布與組成

58種小麥品種中發(fā)現(xiàn)12種目標(biāo)基因位點(diǎn)的組合類型，其頻率為1.5%～25.7%。具體見表2。

3 討論

小麥的面筋強(qiáng)度主要受LMW-GS和HMW-GS的組成及表達(dá)量等因素的影響。開發(fā)和研究一種高效的、不受季節(jié)限制以及能在小麥發(fā)育的早期就能檢測LMW-GS和HMW-GS組成的方法，能大大加快小麥品質(zhì)基因遺傳改良的進(jìn)度[4]。

從本研究的檢測結(jié)果看，優(yōu)質(zhì)的亞基基因Axl/Ax2*在Glu-A1位點(diǎn)的頻率高于國內(nèi)其他地區(qū)的育成品種頻率，但Glu-D1的位點(diǎn)對優(yōu)質(zhì)貢獻(xiàn)最大的亞基基因在提供實(shí)驗(yàn)品種中的頻率最低，僅為9.8%，在Glu-B1位點(diǎn)未見攜帶基因Bx7OE的品種。但在Glu-A3位點(diǎn)有著姣好的面筋強(qiáng)度所具有的亞基Glu-A3d基因的頻率明顯高于我國西北和東北地區(qū)的春小麥種植的區(qū)域。該省小麥的1B·1R易位品種頻率與黃淮流域小麥區(qū)域小麥品種檢測的頻率基本一致。

本文的數(shù)據(jù)表明，該省的小麥品種以攜帶1個(gè)和2個(gè)目標(biāo)基因（位點(diǎn)）的組合類型為主，含有3個(gè)和4個(gè)優(yōu)質(zhì)亞基基因組合的品種較少，不存在含有5個(gè)以及5個(gè)以上基因組合類型的品種。由于該省缺乏強(qiáng)筋小麥的品種，所以對引入國內(nèi)外優(yōu)質(zhì)基因的種質(zhì)資源應(yīng)引起高度重視，并且與當(dāng)?shù)氐母弋a(chǎn)和廣適性品種進(jìn)行雜交，利用本研究所構(gòu)建的多重的PCR體系進(jìn)行位點(diǎn)基因檢測，利用分子標(biāo)記聚合基因，加快品種改良和育種。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建的涉及Dx5、Bx7OE、Ax1、Glu-B3i、Glu-B3與Glu-A3d基因的分子標(biāo)記多重PCR體系的實(shí)驗(yàn)成本較低，并且鑒定結(jié)果可靠，可用于強(qiáng)筋小麥品種的選育和小麥品種資源的快速選擇。利用多重PCR體系檢測的58份小麥品種中，以攜帶1個(gè)和2個(gè)目標(biāo)基因（位點(diǎn)）的組合類型為主，含有3個(gè)和4個(gè)優(yōu)質(zhì)亞基基因組合的品種較少，不存在含有5個(gè)以及5個(gè)以上基因組合類型的品種。

參考文獻(xiàn)

[1]趙會(huì)賢，胡勝武，吉萬全，等.麥谷蛋白Glu-1和Glu-3位點(diǎn)基因等位變異對籽粒聚合體蛋白粒度分布的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，31（1）：69-75.

[2]張曉科，夏先春，王忠偉，等.小麥品質(zhì)性狀分子標(biāo)記多重PCR體系的建立[J].作物學(xué)報(bào)，2007，33（10）：1703-1710.

[3]穆培源，劉麗，陳鋒，等.CIMMYT人工合成小麥改良品系的HMW-GS和LMW-GS組成及其對面筋品質(zhì)的影響[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2008，28（4）：607-612.

[4]萬映秀，張曉科，夏先春，等.多重PCR的建立及黃淮麥區(qū)主要品種品質(zhì)相關(guān)基因的鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（3）：643-653.

（責(zé)任編輯：趙中正）