CCL2 高表達(dá)與低級別膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的相關(guān)性

黃志杰，馬月龍，陳雅娟

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108）

低級別膠質(zhì)瘤（low-grade gliomas，LGG）又稱腦膠質(zhì)瘤，簡稱膠質(zhì)瘤，是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)上皮腫瘤[1]，具有進(jìn)展快、預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高、致死率高的特點(diǎn)。2021 年世界衛(wèi)生組織將膠質(zhì)瘤從Ⅰ級（最低級別）到Ⅳ級（最高級別）進(jìn)行分類，LGG通常包括Ⅰ級膠質(zhì)瘤和Ⅱ級膠質(zhì)瘤[2]。LGG 約占原發(fā)性腦腫瘤的20%，典型的LGG 患者為年齡在30～40 歲的年輕人，多因癲癇發(fā)作而就醫(yī)[3]。LGG 患者具有生存期長、自然病史長、彌散性生長、臨床預(yù)后差異性大等特點(diǎn)，使得觀察與積極干預(yù)的治療決策至關(guān)重要。促使LGG 獲得全面高效治療的措施成為目前神經(jīng)腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。趨化因子是一類能夠趨化細(xì)胞定向移動的小分子分泌蛋白，趨化因子配體2 [chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2]又名單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1），是趨化因子中的一員，由于其在癌癥免疫治療中起著重要的作用[4]，因此成為趨化因子中CC 亞族的重要成員。CCL2 于1989 年從單核細(xì)胞中純化和克隆得到[5]。研究表明，CCL2 不僅對單核細(xì)胞，還對巨噬細(xì)胞[6]、記憶T 細(xì)胞[7]、自然殺傷（NK）細(xì)胞都具有趨化活性，從而將這些細(xì)胞募集到組織損傷和炎癥反應(yīng)的部位[8]。CCL2 在許多類型的細(xì)胞中表達(dá)，這些細(xì)胞在外周循環(huán)和組織中的抗病毒免疫反應(yīng)中具有重要作用[9]。近年來，關(guān)于趨化因子與癌癥進(jìn)展之間關(guān)系的報(bào)道日益增多。CCR2 是CCL2 在人體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的最主要受體。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，CCL2-CCR2 在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、創(chuàng)造腫瘤微環(huán)境（TME）過程中具有多種作用。且已有研究表明，CCL2-CCR2 信號軸參與了包括乳腺癌[11]、前列腺癌[12]、肺癌[13]、肝細(xì)胞癌[14]、胰腺癌[15]、膀胱癌[6]、鼻咽癌[16]和腎癌[17]的發(fā)生和進(jìn)展。因此，許多臨床研究已將CCL2-CCR2 軸確定為早期診斷和不良預(yù)后的預(yù)測依據(jù)[18]。同時(shí)也有研究在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中趨化因子的表達(dá)中檢測到CCL2 信使RNA[19]。但目前CCL2 在LGG 進(jìn)展中的具體作用機(jī)制以及預(yù)后價(jià)值尚缺乏相關(guān)的研究報(bào)道。本研究主要關(guān)注CCL2 在LGG 中的表達(dá)及預(yù)后，同時(shí)研究CCL2 共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)，分析其在LGG 中的潛在作用機(jī)制，構(gòu)建CCL2 相關(guān)基因的LGG 患者預(yù)后模型，旨在為LGG 臨床預(yù)后診斷提供支持。

1 資料與方法

1.1 CCL2 基因表達(dá)分析 基于GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）的TCGA 癌癥數(shù)據(jù)分析LGG 組織與正常組織中CCL2 基因的mRNA 表達(dá)差異（http://gepia.cancer-pku.cn/）。其中LGG 組織樣本有518 例，正常組織有207 例。|log2FC≥1|和P＜0.05 被認(rèn)為存在顯著性差異。

1.2 CCL2 基因生存分析 下載TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中的LGG 樣本信息，使用R包“survival”進(jìn)行CCL2 表達(dá)的生存分析，并通過“survivalROC”分析ROC 曲線。其中用于生存分析具有完整臨床信息的樣本有506 例。對數(shù)秩檢驗(yàn)P值（Log-rankP）＜0.05 被認(rèn)為存在顯著性差異。

1.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）使用R 語言中的“WGCNA”包進(jìn)行分析。選擇β=5 的冪和無標(biāo)度R2=0.95作為軟閾值參數(shù)，構(gòu)建共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)。

1.4 CCL2 相關(guān)基因功能富集分析 為了進(jìn)一步分析CCL2 共表達(dá)基因的潛在功能，本研究利用DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 通路分析和GO-BP 功能富集分析。

1.5 預(yù)后模型構(gòu)建 通過TCGA 數(shù)據(jù)庫中的LGG 數(shù)據(jù)，應(yīng)用最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）構(gòu)建CCL2 相關(guān)基因特征。一個CCL2 相關(guān)基因特征的風(fēng)險(xiǎn)評分公式是通過包括由其LASSO Cox 系數(shù)加權(quán)的個體歸一化基因表達(dá)值來建立的：∑iCoefficient（mRNAi）×Expression（mRNAi）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用t檢驗(yàn)分析LGG 與癌旁組織中CCL2 基因的差異表達(dá)。P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCL2 在LGG 組織中的表達(dá)與LGG 患者預(yù)后相關(guān)性GEPIA 網(wǎng)站分析 CCL2 在LGG 患者組織及正常組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示CCL2 在LGG 患者組織中的表達(dá)顯著高于正常組織（圖1A）；TCGA 數(shù)據(jù)庫中的LGG 患者樣本進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示CCL2 高表達(dá)患者的生存時(shí)間顯著低于CCL2 低表達(dá)患者的生存時(shí)間，見圖1B。

圖1 CCL2 在LGG 患者中的表達(dá)及預(yù)后分析

2.2 構(gòu)建CCL2 基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 通過WGCNA 對TCGA 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，以分析LGG 組織中與CCL2 存在共表達(dá)關(guān)系的基因。結(jié)果顯示與CCL2 存在共表達(dá)關(guān)系的有1333 個基因，屬于blue module，見圖2A、圖2B。為進(jìn)一步研究CCL2 共表達(dá)基因與腫瘤信號通路的關(guān)系，利用DAVID 網(wǎng)站對這些基因進(jìn)行KEGG-pathway 及GO-BP 富集分析，KEGGpathway 結(jié)果顯示，以上基因富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、結(jié)核、破骨細(xì)胞分化、金黃色葡萄球菌感染、用于IgA 生產(chǎn)的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、Th17細(xì)胞分化、B 細(xì)胞受體信號通路、炎癥性腸?。↖BD）、T 細(xì)胞受體信號通路及PD-L1 在癌癥中的表達(dá)和PD-1 檢查點(diǎn)通路，見圖2C。GO-BP 分析結(jié)果表明以上基因富集在防御反應(yīng)、細(xì)胞活化、免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、對生物刺激的反應(yīng)、免疫效應(yīng)過程、免疫系統(tǒng)過程的正向調(diào)節(jié)、參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞活化、骨髓白細(xì)胞活化、T 細(xì)胞活化及T 細(xì)胞增殖，見圖2D。

圖2 WGCNA 鑒定CCL2 共表達(dá)基因

2.3 構(gòu)建CCL2 相關(guān)基因的LGG 患者風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型 利用Cytoscape 及MCODE 分析了1333 個CCL2 相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示在1333個相關(guān)基因的蛋白互作圖中與CCL2 存在互作的蛋白有55 個，見圖3。

圖3 MCODE 分析CCL2 的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建CCL2 互作基因在LGG 中的Cox 單因素生存模型 為了建立CCL2 相關(guān)的LGG 患者的風(fēng)險(xiǎn)模型，對55 個CCL2 互作基因在LGG 中的預(yù)后進(jìn)行Cox 單因素生存分析。結(jié)果顯示有45 個基因與LGG患者預(yù)后相關(guān)，見圖4A。

在這45 個基因中，通過LASSO Cox 回歸分析進(jìn)一步選擇潛在的預(yù)后模型相關(guān)基因?；?0 倍交叉驗(yàn)證，選擇值0.0066 作為λ 的最小標(biāo)準(zhǔn)見圖4B，并且獲得了31 個非零系數(shù)的基因，見圖4C?；诰哂蟹橇阆禂?shù)的基因，根據(jù)每個基因表達(dá)的線性組合乘以LASSO 系數(shù)計(jì)算每個患者的風(fēng)險(xiǎn)評分（risk score）：（1.2573×MYD88）+（-0.1165×CCL19）+（0.1020 ×TNFRSF1A）+（0.0581 ×TLR3）+（0.3917 ×CCR5）+（-0.0110 ×TLR7）+（1.3521 ×FCGR2A）+（1.2823 ×IL18）+（0.1340 ×CD44）+（-0.2169 ×ITGAM）+（0.0312 ×CLEC7A）+（0.1311 ×CD80）+（0.1553×CD40LG）+（-1.099×CYBB）+（0.1760×PTPRC）+（0.0346 ×TLR1）+（0.1268 ×PDCD1）+（-0.6524×C3AR1）+（-0.0112× CD163）+（0.3862×ITGAX）+（-0.3563 ×LILRB2）+（-0.1905 ×ICAM1）+（1.1956 ×CD274）+（-0.2380 ×CCL2）+（-0.1926 ×CCR1）+（0.1894 ×IL10）+（-1.8321 ×CXCL12）+（0.3136×VCAM1）+（-1.3497×SPI1）+（0.2727 ×IL1A）+（-0.3267×CXCR4）。將患者按照人數(shù)平均分為高風(fēng)險(xiǎn)評分組和低風(fēng)險(xiǎn)評分組。生存分析結(jié)果表明，高風(fēng)險(xiǎn)評分與LGG 患者的不良預(yù)后相關(guān)，見圖4D。

此外，進(jìn)行時(shí)間依賴性ROC 分析，以評估CCL2相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)評分模型的區(qū)分能力。結(jié)果顯示，1、3 和5 年生存率的AUC（ROC 曲線下面積）值分別為0.900、0.890 和0.860，說明該模型具有較好的預(yù)后區(qū)分能力，見圖4E。

圖4 基于LGG 中CCL2 相關(guān)基因的風(fēng)險(xiǎn)評分模型

2.5 風(fēng)險(xiǎn)評分相關(guān)的nomogram 構(gòu)建 使用R 軟件包rms，整合生存時(shí)間、生存狀態(tài)和4 個特征（risk score、age、sex 和tumor grade）的數(shù)據(jù)，利用Cox 方法建立了nomogram，評估這些特征在LGG 樣本中的預(yù)后顯著性，見圖5A。nomogram 的1、3 和5 年生存率的AUC 值分別為0.930、0.910 和0.888，顯示該模型具有較好的預(yù)后區(qū)分能力見圖5B。

圖5 Nomogram 的構(gòu)建及其ROC 曲線

3 討論

CCL2 是趨化因子家族中研究最多的成員之一，并且已被證明是治療各種疾病的潛在干預(yù)點(diǎn)[4]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CCL2 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后中扮演著重要角色，其在腫瘤發(fā)展和進(jìn)展中的一個重要的作用是它與腫瘤微環(huán)境中的各種正常宿主細(xì)胞的相互作用。CCL2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤脈管系統(tǒng)的發(fā)育[20]，除了將巨噬細(xì)胞募集到各種癌癥的腫瘤微環(huán)境中，還能夠招募各種免疫細(xì)胞（如髓源性抑制細(xì)胞MDSCs 等）形成免疫抑制微環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視并支持腫瘤細(xì)胞增殖[10]。CCL2 在腫瘤微環(huán)境中對癌癥生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。例如在三陰性炎性乳腺癌中，CCL2 過表達(dá)并通過激活Src 和Erk1/2 信號通路調(diào)節(jié)蛋白水解活性，從而導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。另有研究顯示[22]，CCL2 在單核細(xì)胞誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞侵襲中充當(dāng)介質(zhì)，同時(shí)增加NF-κB 活性，二者都參與介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的侵襲。一項(xiàng)對處于不同階段的前列腺癌患者的研究顯示，血清CCL2升高與骨轉(zhuǎn)移有關(guān)，這表明使用血清CCL2 作為預(yù)后生物標(biāo)志物的可能性。另有研究報(bào)道[23]，CCL2 在人類肝癌中過表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后有關(guān)。

以上研究提示，腫瘤中異常表達(dá)的CCL2 可作為預(yù)后、診斷和靶向治療的分子標(biāo)志物。本研究利用生物信息學(xué)分析，重點(diǎn)關(guān)注CCL2 在LGG 中的表達(dá)及潛在功能分析，結(jié)果顯示CCL2 在LGG 組織中的表達(dá)高于正常組織；生存分析結(jié)果顯示，CCL2 的高表達(dá)患者的生存時(shí)間低于CCL2 低表達(dá)患者，表明高表達(dá)的CCL2 是LGG 患者的不良預(yù)后因素。同時(shí)進(jìn)一步分析了CCL2 的共表達(dá)基因，獲得1333 個共表達(dá)關(guān)系基因，并且在通路和功能分析的結(jié)果中顯示，CCL2 的共表達(dá)基因主要富集在免疫信號通路，表明CCL2 主要參與LGG 進(jìn)展中的免疫相關(guān)途徑。此外，為了確定與CCL2 相關(guān)基因的蛋白互作關(guān)系，從1333 個基因中篩選得到55 個相關(guān)基因，在經(jīng)過建模分析后，又從中獲得了31 個非零系數(shù)的基因作為LGG 預(yù)后分子標(biāo)記物。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分模型將LGG 患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，同時(shí)生存分析結(jié)果表明，高風(fēng)險(xiǎn)評分與LGG 患者的不良預(yù)后呈現(xiàn)相關(guān)性。

隨著生命科學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅猛發(fā)展，生物信息分析越來越多地被用于篩選與腫瘤預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物。綜上所述，CCL2 高表達(dá)與LGG 預(yù)后不良密切相關(guān)，是評估LGG 預(yù)后的有效指標(biāo)，本研究成功構(gòu)建用于評估LGG 患者預(yù)后的CCL2 相關(guān)基因預(yù)后模型。