WWP1、p53在瘢痕疙瘩和正常皮膚中的差異表達(dá)及意義

王 輝，桑鵬飛，王 敏，張錦松，朱 飛

WWP1、p53在瘢痕疙瘩和正常皮膚中的差異表達(dá)及意義

王 輝，桑鵬飛，王 敏，張錦松，朱 飛

目的探討 E3泛素連接酶 WWP1、p53在人正常皮膚及瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)差異，分析其與瘢痕疙瘩發(fā)生是否相關(guān)。方法選取臨床切取的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織標(biāo)本各 10例，采用免疫組織化學(xué)法和 RT-PCR法分別對(duì)組織中 WWP1、p53蛋白及 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并通過Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)定組織蛋白染色后累計(jì)光密度值、以 β-actin為參照計(jì)算 mRNA相對(duì)定量，進(jìn)而比較分析兩組標(biāo)本中 WWP1、p53表達(dá)是否有差異性。結(jié)果免疫組化染色結(jié)果提示，瘢痕疙瘩標(biāo)本中 p53蛋白表達(dá)明顯低于正常皮膚，而 WWP1蛋白沉積明顯高于正常皮膚，同時(shí) p53及WWP1 mRNA RT-PCR檢測(cè)證實(shí)同樣結(jié)果，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論E3泛素連接酶 WWP1及抑癌基因p53與瘢痕疙瘩的形成有相關(guān)性，可作為瘢痕疙瘩形成機(jī)制及治療靶點(diǎn)研究的方向。

WWP1；p53；瘢痕疙瘩；正常皮膚

瘢痕疙瘩是一種表現(xiàn)為皮膚侵襲性生長(zhǎng)的病理性修復(fù)，與腫瘤有類似的生物學(xué)特性，有一定的遺傳傾向，由多基因多因素共同作用所致。該疾病好發(fā)于胸骨區(qū)、肩部、面頸部及耳部等色素沉積的部位，常見于損傷后的 3個(gè)月 ～1年，輕微創(chuàng)傷即出現(xiàn)瘢痕疙瘩的極有可能有家族史。研究［1］表明 E3泛素連接酶 NEDD4-1基因可能與瘢痕疙瘩有關(guān)。E3泛素連接酶為 NEDD4蛋白家族成員之一，已被證實(shí)在多種 腫 瘤 中 表 達(dá) 異 常。研 究［2］顯 示 肝 癌 細(xì) 胞WWP1高表達(dá)，而 WWP1基因敲除后，肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探究WWP1、p53與瘢痕疙瘩之間的關(guān)系，該實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)法和 RT-PCR法分別檢測(cè)瘢痕疙瘩與正常皮膚組織 WWP1、p53表達(dá)并比較是否有差異，進(jìn)而探討二者與瘢痕疙瘩形成是否相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 選取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的經(jīng)副主任以上醫(yī)師確診為瘢痕疙瘩的瘢痕疙瘩標(biāo)本 10例，年齡 10～52（33.1± 9.7）歲，其中男 6例，女 4例；正常皮膚標(biāo)本 10例（取自非瘢痕疙瘩植皮患者取皮區(qū)的正常皮膚），年齡 10～52（31.8±7.4）歲。按照我院倫理委員會(huì)的準(zhǔn)則，以上標(biāo)本均在獲得患者知情同意并簽署知情同意書的基礎(chǔ)上進(jìn)行手術(shù)切除。切取標(biāo)本患者術(shù)前均無長(zhǎng)期外用防治瘢痕藥物史，不伴有腫瘤等其他嚴(yán)重疾病。所取標(biāo)本分為2部分（其中瘢痕疙瘩標(biāo)本取中心部位），一部分行實(shí)時(shí)定量 PCR（Real-time PCR，RT-PCR）檢測(cè)標(biāo)本切取后立即置于 -80℃冰箱保存，另一部分作免疫組化染色標(biāo)本于 4%中性甲醛固定。

1.1.2主要試劑 兔抗人泛素轉(zhuǎn)移酶 E3 WWP1多克隆抗體、兔抗人 p53蛋白多克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體（Santa Cruz公司，美國）；DAB顯色試劑盒（博奧森生物科技有限公司，北京）；RT-PCR試劑盒（Promega公司，美國）；目的片段及內(nèi)參引物（上海生工生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中 WWP1、p53蛋白表達(dá) 3μm連續(xù)切片，經(jīng)過脫蠟后，置于枸櫞酸溶液中，在 270℃下抗原修復(fù)；以 3%雙氧水清除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗后加兔抗人泛素轉(zhuǎn)移酶E3多克隆抗體及 p53蛋白多克隆抗體孵育過夜；PBS沖洗，山羊抗兔 IgG抗體于 37℃孵育 30 min，PBS沖洗后，使用 DAB試劑盒按照說明書顯色。設(shè)立陰性對(duì)照（不與一抗孵育）。脫水封片后顯微鏡下觀察并拍照。使用 Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，測(cè)定泛素轉(zhuǎn)移酶 E3及 p53蛋白累積光密度 （integrated optical density，IOD）值。光 密 度（optical density，OD）是指光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度與該光線通溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度比值的對(duì)數(shù)，而 IOD則是陽性目標(biāo)所有像素點(diǎn)OD值的累計(jì)，可以反映目標(biāo)中總的表達(dá)強(qiáng)度，其值越高，說明目標(biāo)總表達(dá)強(qiáng)度越高。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)組織中 WWP1、p53 mRNA表達(dá) 從 -80℃液氮罐中取出瘢痕疙瘩組織、正常皮膚組織各約 100mg分別放入用0.1%DEPC水浸泡并消毒過的勻漿器中，向勻漿器內(nèi)加入 1 ml TRIzol RNA提取液，置于冰上。以 TRIzol法提取組織中總 RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè) RNA濃度和純度 （OD260／OD280＞1.8）。根 據(jù) 濃 度 取 1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn) 行 PCR 擴(kuò) 增。人 β-actin上 游 引 物：5′-GGG ACCTGACTGACTACCTC-3′，下 游 引 物：5′-ACTCGTCATACTCCTGCTTG-3′，擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng) 度 546 bp；WWP1上游引物：5′-ACAGTGGCAATCTCAGCG-3′，下游引物：5′-GGCACAAATAACGGAAGT-3′，擴(kuò)增片段 長(zhǎng)度 413 bp；p53上 游 引 物：5′-GTCTACCTCCCGCCATAA-3′，下 游 引 物：5′-CATCTCCCAAACATCCCT-3′，擴(kuò)增片 段長(zhǎng)度 316 bp；擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，72℃終末延伸 10 min，共 35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠分析系統(tǒng)觀察并照相，每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料 ˉx±s表示，組間差異采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 E3泛素連接酶WWP1、p53蛋白免疫組化染色對(duì) p53蛋白染色顯示，瘢痕疙瘩組織內(nèi)少見陽性細(xì)胞，見圖1。瘢痕疙瘩組織中 p53蛋白染色 IOD值顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。對(duì)瘢痕疙瘩及正常皮膚組織泛素連接酶 E3 WWP1染色結(jié)果分別進(jìn)行觀察，泛素連接酶 E3 WWP1染色陽性者胞漿存在棕黃色顆粒沉著，鏡下顯示正常皮膚組織內(nèi)少見陽性細(xì)胞，見圖1。與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩組織泛素轉(zhuǎn)移酶 E3 WWP1染色 IOD值顯著增加（P＜0.05），見表 1。

表1 正常皮膚及瘢痕疙瘩組織 p53、WWP1免疫組化染色 IOD值測(cè)定結(jié)果

2.2 E3泛素連接酶WWP1、p53的mRNA RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩組織泛素連接酶 E3 WWP1 mRNA表達(dá)水平顯著增加，p53 mRNA的表達(dá)情況顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、3。

圖1 瘢痕疙瘩及正常皮膚組織 p53及 WWP1免疫組化染色結(jié)果 DAB×400A：瘢痕疙瘩；B：正常皮膚；1：p53；2：WWP1

圖2 正常皮膚及瘢痕疙瘩組織中 p53、WW P1 mRNA及內(nèi)參 β-actin PCR產(chǎn)物電泳圖1～3：正常皮膚組織及對(duì)應(yīng)內(nèi)參的目的條帶；4～6：瘢痕疙瘩組織及對(duì)應(yīng)內(nèi)參的目的條帶

圖3 正常 皮膚 及瘢 痕疙瘩 組織 中 p53、WWP1 m RNA表達(dá) 水平與正常皮膚比較：*P＜0.05；**P＜0.01

3 討論

瘢痕疙瘩是以局部創(chuàng)傷修復(fù)組織進(jìn)行性生長(zhǎng)并伴有膠原纖維過度產(chǎn)生和沉積為表現(xiàn)的一種嚴(yán)重病理性瘢痕，有腫瘤的某些特征，并有一定遺傳傾向，探索腫瘤相關(guān)基因及細(xì)胞因子對(duì)瘢痕疙瘩形成有重要意義。

WWP1基因位于 8q21，NEDD4家族部分蛋白已被證實(shí)通過泛素化過程參與多種細(xì)胞信號(hào)通路及腫瘤形成。目前關(guān)于瘢痕疙瘩中 WWP1發(fā)病機(jī)制的研究極少。本研究利用免疫組化及 RT-PCR方法發(fā)現(xiàn) WWP1在瘢痕疙瘩中表達(dá)增多，這與在乳腺癌［3］、前列腺癌［4］等腫瘤所發(fā)現(xiàn)的情況一致。Cao et al［5］體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞研究顯示，WWP1通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì) p27進(jìn)行調(diào)控參與細(xì)胞周期調(diào)控，WWP1與 p27之間的變化呈負(fù)相關(guān)。已知p27是一種細(xì)胞周期依賴的蛋白激酶抑制劑，通過細(xì)胞間接觸抑制來完成細(xì)胞周期的阻滯作用（G0／G1期）。WWP1過度表達(dá)時(shí) p27水平降低，細(xì)胞凋亡延遲，敲除該基因后成纖維細(xì)胞出現(xiàn)復(fù)制性衰老，p27蛋白增高［6-7］。此外，Cheng et al［2］發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞 WWP1表達(dá)水平升高，同時(shí)細(xì)胞凋亡水平明顯降低，利用 siRNA轉(zhuǎn)染敲除 WWP1基因后細(xì)胞凋亡水平明顯升高，p53表達(dá)上調(diào)。p53除有抑制腫瘤的作用外還能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此推測(cè) WWP1是通過對(duì)其下游的 p53調(diào)控參與細(xì)胞的增值、凋亡。本研究同樣證實(shí)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞 WWP1表達(dá)增多，推測(cè)可能也與其對(duì)下游調(diào)節(jié)因子的泛素化異常使成纖維細(xì)胞增殖凋亡異常有關(guān)。

p53基因是一種公認(rèn)的抑癌基因，位于染色體17q13.1，既往與腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究眾多。對(duì)瘢痕疙瘩 p53基因差異性的研究結(jié)論尚未統(tǒng)一，但普遍認(rèn)為 p53功能的缺失可能促使成纖維細(xì)胞凋亡異常［8］。本實(shí)驗(yàn)顯示瘢痕疙瘩組織中 p53表達(dá)較正常皮膚減少，這可能正是 p53蛋白無法執(zhí)行細(xì)胞凋亡致成纖維細(xì)胞有較高增殖活性的原因。WWP1表達(dá)水平增高的同時(shí) p53表達(dá)降低并非偶然，Laine et al［9］對(duì)老鼠纖維母細(xì)胞 WWP1、p53基因研究表明，WWP1通過泛素化介導(dǎo) p53蛋白從細(xì)胞核輸出，p53發(fā)揮促細(xì)胞凋亡及抑癌作用是在細(xì)胞核內(nèi)完成，因此泛素化抑制了 p53基因的轉(zhuǎn)錄活性，此外 WWP1對(duì) p53的調(diào)節(jié)獨(dú)立于 MDM2。這種泛素化為非經(jīng)典的泛素化途徑，結(jié)果并非將蛋白降解，而是通過泛素化修飾 p53蛋白并增加其穩(wěn)定性，但泛素化了的p53蛋白無生物功能。

本實(shí)驗(yàn)就 WWP1、p53在瘢痕疙瘩的表達(dá)進(jìn)行研究，表明 p53表達(dá)減少，而 WWP1表達(dá)增多。p53功能缺失在乳腺癌、胃癌［10］等腫瘤常見，p53多以突變體形式存在，且這種突變體表達(dá)明顯升高，但本研究顯示瘢痕疙瘩中 p53表達(dá)較正常組織明顯減少，這至少說明在瘢痕疙瘩中 p53功能缺失，實(shí)驗(yàn)對(duì)WWP1水平檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)明顯增高，這一現(xiàn)象在其他腫瘤中亦存在［11］，且有證據(jù)表明 WWP1通過泛素化修飾 p53蛋白，因此推測(cè)瘢痕疙瘩的形成中成纖維細(xì)胞異常增殖可能與 p53功能缺失有關(guān)，而WWP1能夠通過對(duì) p53的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的控制，除此之外是否還有其他途經(jīng)作用于 p53使其功能缺失尚無確切證據(jù)，待將來有關(guān)此方面的研究更加深入。

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Different expression and significance of WWP1 and p53 in keloid and normal skin

Wang Hui，Sang Pengfei，Wang Min，et al
（Dept of Plastic Surgery，The First Affiliated Hopital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective The purpose of the study was to detect the expression of E3 ubiquitin ligase WWP1 and p53 in human normal skin and keloid tissues and its correlation with the occurrence of keloid.Methods 10 cases of keloid tissues and 10 cases of normal skin were recruited.The expressions of WWP1 and p53 in the keloid group and the controlsweremeasured using immunohistochemicalmethods.And themRNA expression ofWWP1 and p53 in the two groups were detected by RT-PCR methods.We also measured integrated optical density（IOD）of the proteins by Image-Pro Plus analysis system，and calculated the relative quantity ofmRNA refering toβ-actin，then made a comparative analysis of the two groups for the expressions ofWWP1，p53.Resu lts The immunohistochemical results showed that the expression of p53 protein in keloid was significantly lower compared with the controls，and WWP1 protein deposition was significantly higher than that of normal skin.The mRNA expression of p53 and WWP1 was detected by RT-PCR and confirmed the same results.All the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion E3 ubiquitin ligase WWP1 and anti oncogene p53 is related to the formation of keloid，which provides a new direction of themechanism and new targets for the treatment of keloid.

WWP1；p53；keloid；normal skin

R 619.6

A

1000-1492（2016）02-0247-04

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.044.htm l

2015-11-23接收

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30973124）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：KJ2014A108）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，合肥 230022

王 輝，男，碩士研究生；

朱 飛，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hfzfzx＠163.com