膠質(zhì)瘤中 IGF-1和 IGFBP-3的表達(dá)及臨床意義研究

葉 昀，牛朝詩，楊 洋，李冬雪，鮑得俊，范 振

膠質(zhì)瘤中 IGF-1和 IGFBP-3的表達(dá)及臨床意義研究

葉 昀1，2，牛朝詩1，楊 洋1，李冬雪1，鮑得俊1，范 振1

目的檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3（IGFBP-3）在膠質(zhì)瘤患者術(shù)前、術(shù)后外周血血清中的含量及變化和膠質(zhì)瘤組織局部的表達(dá)情況，探討發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其在輔助診斷、危險(xiǎn)性預(yù)測(cè)和治療中的臨床意義。方法運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組和對(duì)照組患者術(shù)前、術(shù)后 外 周血血清 中 IGF-1、IGFBP-3的水 平；正常腦組織（顱腦損傷手術(shù)時(shí)的腦組織）和腫瘤組織行 IGF-1、IGFBP-3免疫組化染色檢查，顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。結(jié)果對(duì)照組 血 清中 IGF-1及 IGFBP-3術(shù) 前 及術(shù)后無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而膠質(zhì)瘤患者血清中 IGF-1及 IGFBP-3表達(dá)水平在術(shù)后較術(shù)前均明顯下降（P＜0.05）。無論術(shù)前術(shù)后，IGF-1和 IGFBP-3在不同 級(jí)別膠 質(zhì)瘤患者的血清學(xué)表達(dá)與級(jí)別無顯著相關(guān)性。膠質(zhì)瘤組織中，IGF-1表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05），IGFBP-3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)亦高于對(duì)照組（P＜0.05）。膠質(zhì)瘤級(jí)別越高，膠質(zhì)瘤組織中IGF-1和 IGFBP-3的 表達(dá) 越 高，與 病 理 級(jí)別 呈 正 相 關(guān) （P＜0.01）。結(jié)論IGF-1和 IGFBP-3可能在促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要作用，檢測(cè)其水平變化對(duì)膠質(zhì)瘤的診斷、判斷預(yù)后有重要意義。

膠質(zhì)瘤；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3

膠 質(zhì) 瘤，尤 其 是 膠 質(zhì) 母 細(xì) 胞 瘤 （glioblastoma multiforme，GBM），目前仍然是死亡率最高的惡性腫瘤之一。GBM的外科手術(shù)治療、影像學(xué)診斷以及放化療已取得一定的進(jìn)展。但是，由于膠質(zhì)瘤有高度侵襲性，手術(shù)治療往往無法完全切除，而且手術(shù)復(fù)發(fā)率高，尤其是 GBM 患者仍預(yù)后極差［1］。胰島素樣生長(zhǎng)因 子 （insulin-like growth factor，IGF）是 一 類多肽，可參與脊椎動(dòng)物細(xì)胞增殖分化、組織修復(fù)及生長(zhǎng)發(fā)育，有胰島素樣合成代謝作用，包括 IGF-1、IGF-2及其受體 IGF-1R、IGF-2R，以及 6種高結(jié)合蛋白（IGFBPs）和 IGFBP蛋 白酶。在 胚 胎 期 和 胎 兒 期IGF-2發(fā)揮，但在出生后，其作 用被 IGF-1替代［2］。IGFBPs作為 IGF-1在循環(huán)系統(tǒng)中的載體，可以決定IGFs的生物利用度，IGFBP-3在 IGFBPs中占有主要作用。研究［3］顯示，IGF-1血清學(xué)表達(dá)水平高的人群，患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)要遠(yuǎn)高于 IGF低表達(dá)人群。在膠質(zhì)瘤方面，IGF-1和 IGFBP-3的相關(guān)研究還較少。該研究通過分析 60例各級(jí)別膠質(zhì)瘤患者 IGF-1和 IGFBP-3的血清學(xué)表達(dá)、腫瘤組織中蛋白水平表達(dá)及其與病理級(jí)別的相關(guān)性，探討 IGF-1和 IGFBP-3作為膠質(zhì)瘤預(yù)后指標(biāo)的可能性，也為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤的分子靶向治療提供了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑IGF-1測(cè)定試劑盒及 IGFBP-3測(cè)定試劑盒均購于西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；IGF-1兔抗人單克隆抗體（bs-4588R）、IGFBP-3抗體（bs-1434R）購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔二步法檢測(cè)試劑盒（PV-6001）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 病例資料選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)外科 2014年 5月 ～2015年 5月間行手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤患者血液標(biāo)本和腫瘤組織標(biāo)本，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診。其中女 26例，男 34例；年齡 6～63歲，中位年齡 36歲。膠質(zhì)瘤患者均為初發(fā)病例，術(shù)前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。根據(jù) WHO 2007中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類及分級(jí)：Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí) 9例，Ⅲ級(jí) 15例，Ⅳ級(jí) 30例。15例正常血液標(biāo)本取自三叉神經(jīng)痛、面肌痙攣患者，經(jīng)檢查排除惡性腫瘤、惡病質(zhì)等疾病，血液標(biāo)本的采集均經(jīng)過患者本人同意并簽署知情同意書。6例正常腦組織標(biāo)本取自顱腦損傷行內(nèi)減壓術(shù)的患者，術(shù)后病理檢查為正常腦組織，因入院時(shí)患者已昏迷，由其法定代理人簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1血清采集及檢測(cè) 選取無菌干燥管，于清晨空腹抽取患者靜脈血4 ml，迅速置于冷凍離心機(jī)上，4℃，1 500 r／min離心 10 min。然后選取上清液置于冰箱（-25℃）冷凍保藏待檢查。若血液標(biāo)本溶血?jiǎng)t需重新采血離心處理。按化學(xué)發(fā)光免疫分析法步驟測(cè)定 IGF-1、IGFBP-3血清學(xué)中的含量。

1.3.2標(biāo)本取材和制備 60例膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本及6例正常腦組織標(biāo)本均浸泡在甲醛液中，并立即包埋石蠟塊，室溫下保存待常規(guī) HE切片染色及免疫組化染色檢查。

1.3.3免疫組化染色 取膠質(zhì)瘤和正常腦組織組織標(biāo)本，常規(guī)石蠟切片，烤箱 70℃脫蠟 2 h后，酒精梯度水化，置于檸檬酸中高溫高壓修復(fù)，分別加入IGF-1和 IGFBP-3單克隆抗體，4℃過夜。第二天取出，加入二抗室溫孵育 20 min，甩干，加入 DBA顯色、復(fù)染、脫水、封片、光鏡下觀察，以 PBS代替一抗作用性對(duì)照，已知陽性切片作陽性對(duì)照。IGF-1及IGFBP-3免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：IGF-1以胞質(zhì)染色為棕褐色顆粒者為陽性反應(yīng)細(xì)胞，IGFBP-3以細(xì)胞核、胞質(zhì)和（或）包膜內(nèi)染色為棕褐色顆粒者為陽性反應(yīng)細(xì)胞，400倍顯微鏡下，每張玻片記數(shù) 500個(gè)細(xì)胞，依據(jù)染色陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞的百分比及染色強(qiáng)弱分類：① -：標(biāo)本中無陽性反應(yīng)細(xì)胞或陽性反應(yīng)細(xì)胞 ＜10%，染色淡；② +：陽性反應(yīng)細(xì)胞占10%～25%，染色淡；③ ?：陽性反應(yīng)細(xì)胞占 26% ～50%，染色清晰；④ ?：陽性反應(yīng)細(xì)胞 ＞50%，染色強(qiáng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，定量資料使用 ˉx±s表示。采用 t檢驗(yàn)、單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較，定性資料采用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，等級(jí)資料兩變量相關(guān)性采用 Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前術(shù)后膠質(zhì)瘤血清中IGF-1和IGFBP-3的表達(dá)對(duì)照組血清中 IGF-1及 IGFBP-3術(shù)前及術(shù)后無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而膠質(zhì)瘤患者血清中 IGF-1及 IGFBP-3表達(dá)水平在術(shù)后較術(shù)前均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=19.71，17.61，P＜0.05）。見表 1。

表1 血清 中 IGF-1和 IGFBP-3術(shù) 前術(shù) 后的表 達(dá)（ˉx±s）

2.2 IGF-1血清學(xué)表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤級(jí)別的相關(guān)性研究無論術(shù)前術(shù)后，IGF-1和 IGFBP-3在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的血清學(xué)表達(dá)與級(jí)別無顯著相關(guān)性。見表2。

2.3 膠質(zhì)瘤組織中IGF-1和IGFBP-3的表達(dá)與對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤組織中 IGF-1表達(dá)水平顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-2.37，P＜0.05）。IGFBP-3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)亦高于對(duì)照組（Z=-2.37，P＜0.05）。見表 3、圖1。

圖1 IGF-1、IGFBP-3在正常腦組織和各級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)免疫組化 ×4001：IGF-1；2：IGFBP-3；A：正常腦組織中表達(dá)（-）；B：星形細(xì)胞瘤Ⅰ級(jí)組織中表達(dá)（+）；C：星形細(xì)胞瘤Ⅱ級(jí)組織中表達(dá)（?）；D：星形細(xì)胞瘤Ⅲ級(jí)組織中表達(dá)（?）；E：星形細(xì)胞瘤 IV級(jí)組織中表達(dá)（?）

表2 各級(jí) 別膠質(zhì)瘤血 清中 IGF-1和 IGFBP-3術(shù) 前術(shù) 后的表 達(dá)（ˉx±s）

表3 IGF-1及 IGFBP-3在對(duì)照組和膠質(zhì)瘤組組織中表達(dá)水平比較

2.4 各級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中IGF-1和IGFBP-3的表達(dá)膠質(zhì)瘤級(jí)別越高，膠質(zhì)瘤組織中 IGF-1和 IGFBP-3的表達(dá)水平越高，與病理級(jí)別呈正相關(guān)（rs= 0.74、0.68，P＜0.01）。見表 4。

表4 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組組織中 IGF-1及 IGFBP-3表達(dá)水平的比較

3 討論

大腦的形成和發(fā)展有許多特定環(huán)節(jié)，包括神經(jīng)胚形成、神經(jīng)發(fā)生、分化為神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、遷移、樹突和軸突生長(zhǎng)、突觸發(fā)生和髓鞘形成等，IGF-1幾乎在每個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用［3-4］。研究［5］顯示，在人類腫瘤發(fā)生中，IGF-1過度增多可發(fā)揮“致瘤”作用，可促進(jìn)增殖及侵襲性，并有抗凋亡作用，主要通過 PI3K-AKT-mTOR實(shí)現(xiàn)抗凋亡作用，而通過上調(diào)促血管生成因子完成促血管生成作用。目前研究表明，肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)病率與循環(huán)中 IGF-1水平異常升高呈明顯正相關(guān)。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于膠質(zhì)瘤與 IGF-1相關(guān)性的大樣本報(bào)道較少，本研究表明 IGF-1膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著高于Ⅰ、Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤，提示 IGF-1作為癌 基因可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，IGF-1血清學(xué)檢測(cè)可能作為膠質(zhì)瘤篩查指標(biāo)，為膠質(zhì)瘤的臨床診斷提供參考。

IGFBPs家族包括 6個(gè)成員（IGFBP1～6），通過結(jié)合并調(diào)控 IGFs而發(fā)揮作用。研究［6］報(bào)道，IGFBP-3在許多腫瘤中發(fā)揮重要作用，GBM血清學(xué)檢測(cè)高表達(dá) IGFBP-3的膠質(zhì)瘤手術(shù)患者生存期更長(zhǎng)。miRNA可參與調(diào)節(jié) mRNA的穩(wěn)定性，影響 mRNA翻譯，為一類非編碼小 RNA。近年來，人們?cè)絹碓街匾昺iRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到的作用［7-11］。miR-21是膠質(zhì)瘤重要的致癌基因，可靶向作用于轉(zhuǎn)化因子 β、p53以及線粒體凋亡腫瘤抑制通路中的多個(gè)組分，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和增殖能力［11-12］。

研究［1］顯示，IGFBP-3高表達(dá)可抑制 GBM細(xì)胞增殖，并且提示預(yù)后更佳。而 IGFBP-3正是 miR-21的靶基因，通過對(duì) GBM 細(xì)胞系的研究表明，miR-21通過靶向抑制 IGFBP-3表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及致瘤性。一旦敲減 GBM細(xì)胞中的 miR-21，則 IGFBP-3表達(dá)升高，GBM細(xì)胞的致瘤性受到抑制。提示 IGFBP-3可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。本研究顯示 IGF-1及 IGFBP-3在膠質(zhì)瘤患者手術(shù)前后的血清學(xué)檢測(cè)存在差異，術(shù)后均顯著下降；繼續(xù)通過免疫組化，表明在膠質(zhì)瘤組織中，IGF-1及 IGFBP-3均高表達(dá)表達(dá)，并且與病理級(jí)別呈正相關(guān)。

IGF-1有作為膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)的可能性，但 IGFBP-3的抑癌作用及相關(guān)機(jī)制尚未完全清楚。進(jìn)一步研究 IGF家 族的內(nèi)在關(guān)系，尤 其 是 IGFBP-3及IGF-1的對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的影響，可能對(duì)膠質(zhì)瘤的基因靶向治療提供新的思路。

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Research of expression and clinical significance of IGF-1 and IGFBP-3 in glioma

Ye Yun1，2，Niu Chaoshi1，Yang Yang1，et al
（1Dept of Neurosurgery，Anhui Province Key Laboratory of Brain Function and Brain Disease，Anhui Provincial Stereotactic Neurosurgical Institute，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Neurosurgery，People’s Hospital of Shuchen，Shuchen 231300）

Objective To explore the exact roles of IGF-1 and IGFBP-3 in the development of glioma and analyze their clinical significance in auxiliary diagnosis，risk prediction and therapy.Methods Chemiluminescencemethod was used to detect the contents and their change of IGF-1 and IGFBP-3 in serum of glioma group and control group pre and post operation.Immunohistochemistry was used to detect the expressions of IGF-1 and IGFBP-3 in glioma tissues and normal brain tissues.Results Compared to pre operation，the postoperation contents of IGF-1 and IGFBP-3 in glioma group significantly decreased（P＜0.05），while the data of the control group had no obvious difference.Nomatter pre or postoperation，the expressions of IGF-1 and IGFBP-3 in serum were irrelevant to the pathologic gradation of glioma.The expressions of IGF-1 and IGFBP-3 significantly increased（P＜0.05）and were positively correlated with the pathologic gradation（P＜0.01）.Conclusion IGF-1 and IGFBP-3 might promote the development of glioma and detect the contents and their changes have important value in the diagnosis and prognosis.

glioma；insulin-like growth factor-1；insulin-like growth factor binding protein-3

R 739.41

A

1000-1492（2016）02-0231-04

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.036.htm l

2015-11-17接收

安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室績(jī)效考核補(bǔ)助項(xiàng)目 （編號(hào)：1306c083028）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)外科、腦功能與腦疾病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、安徽省腦立體定向神經(jīng)外科研究所，合肥 230001

2舒城縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，舒城 231300

葉 昀，男，碩士研究生；

牛朝詩，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：niuchaoshi＠163.com