通過呼氣鑒定乳腺癌分子分型的可能性研究

花慶嶺，張 偉，石大友，丁 露，徐珍琴，宋 琪，秦 濤，宋 耕，劉 虎

通過呼氣鑒定乳腺癌分子分型的可能性研究

花慶嶺1*，張 偉2*，石大友3，丁 露4，徐珍琴5，宋 琪6，秦 濤7，宋 耕8，劉 虎2

目的探討通過人體呼出氣體鑒定乳腺癌分子分型的可能性。方法篩選出 251例符合入組標(biāo)準(zhǔn)的研究對(duì)象，每人收集2份呼氣樣本，分別經(jīng)熱脫附 -氣相色譜 -質(zhì)譜（TD-GC-MS）技術(shù)及納米傳感器技術(shù)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 13種可揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）濃度在人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2）過表達(dá)型乳腺癌與非 HER-2過表達(dá)患者間存在顯著差異 （P＜0.05），三陰型乳腺癌與非三陰型乳腺癌間5種，Luminal B型 乳腺癌與非 Luminal B型 乳腺癌間 1種，Luminal A型乳腺癌與非 Luminal A型乳腺癌 間 0種。納米傳感器經(jīng)留一法交叉驗(yàn)證判別各分子分型的乳腺癌時(shí)亦獲得較高的精確度（73.64% ～90.70%）、靈敏度（40.00% ～93.75%）與特異度（73.77% ～93.42%）。結(jié)論“呼氣檢測(cè)”可作為一種新型的鑒定乳腺癌分子分型的無創(chuàng)檢查方法。

乳腺癌；分子分型；呼氣；氣相色譜質(zhì)譜；納米傳感器

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居女性腫瘤發(fā)病率前列［1］。在乳腺癌的臨床治療中，其分子分型是選擇治療模式的重要依據(jù)。目前臨床上，乳腺癌的分子分型主要為 Luminal A型、Luminal B型、人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）過表達(dá)型、三陰型等4型，每型有其獨(dú)特的生物學(xué)行為特征［2-3］。乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后的分子分型常較原發(fā)灶發(fā)生改變，甚至后續(xù)治療過程中亦可多次發(fā)生改變［4-6］，因此要求及時(shí)方便地檢測(cè)其分子分型。乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時(shí)，臨床上多采用活檢 +病理 +免疫組化 +基因檢測(cè)進(jìn)行轉(zhuǎn)移灶分子分型的鑒定，但對(duì)于轉(zhuǎn)移灶部位不易活檢的患者，目前尚缺乏有效的檢測(cè)手段?！昂魵鈾z測(cè)”作為一種新型的無創(chuàng)檢查方法，在多種疾病的診斷中顯示出廣闊的應(yīng)用前景。本課題組對(duì)肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌等的呼氣分析都曾做過有益的嘗試［7-10］。本研究擬采用熱脫附 -氣相色譜-質(zhì) 譜 （thermal desorption-gas chromatography-mass spectrometry，TD-GC-MS）技術(shù)對(duì)乳腺癌各分子分型患者呼 氣 中 的 揮 發(fā) 性 有 機(jī) 化 合 物 （volatile organic compounds，VOCs）進(jìn)行分析比較，檢測(cè)各型間的差異，并進(jìn)一步考察納米傳感器對(duì)各型乳腺癌的鑒別效力，以期建立一種新型的分子分型檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集乳腺外科及普外科的乳腺癌及良性乳腺病住院患者的呼氣標(biāo)本，入選標(biāo)準(zhǔn)要求無肺部疾病及其他腫瘤疾病史，無呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病、糖尿病、脂肪肝、腎病、活動(dòng)性感染等合并癥，無吸煙史或已戒煙1年以上。受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑GC-MS聯(lián)用儀（GC-MSQP 2010）、熱脫 附 系 統(tǒng) （TD20）購(gòu) 自 日 本 Shimadzu公司；SLB-5MS毛細(xì)管柱 （30.0 m×0.25 mm ×0.5 μm）、Tenax吸附管、配套的吸附管切刀及鐵氟龍?zhí)坠苜?gòu)自美國(guó) Sigma公司；Tedlar采氣袋購(gòu)自大連德霖氣體包裝有限公司；納米傳感器由以色列理工學(xué)院研制。

1.3 呼氣收集方法受試者均術(shù)前采集，晚間 12時(shí)后禁食，晨起后在安靜、通風(fēng)的環(huán)境下深吸氣后屏住呼吸 3 s，然后向 Tedlar袋中緩慢呼氣，直到袋子充滿為止，共收集約 3 L氣體，每人采集 2份氣體。同時(shí)采集病房環(huán)境氣體作對(duì)照。利用切刀將吸附管兩端打開，利用鐵氟龍?zhí)坠軐⑵渑c Tedlar采樣袋和吸附管連接，將 Tedlar采樣袋中氣體標(biāo)本按照 180 m l／min的流速濃縮至吸附管，蓋好兩端密封蓋后置于5℃處保存。所有樣品分2批進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 色譜與質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)

1.4.1色譜與質(zhì)譜條件 將吸附管裝載入 TD20系統(tǒng)，其中 VOCs經(jīng)熱脫附后進(jìn)入 GC-MS系統(tǒng)。GC柱箱初溫：35℃；柱箱程序升溫：35℃保持 5min，以5℃ ／min速度升至 180℃，再以 13.5℃ ／min升至290℃，保持 1 min。MS離子源溫度 200℃，掃描范圍 30～400 m／z。

1.4.2定量方法與實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，根據(jù)目標(biāo) VOCs成分最大和最小色譜峰值面積配置相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)氣體，后配置該范圍內(nèi)3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)氣體，檢測(cè)色譜峰面積值，每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的色譜峰面積測(cè)兩次，計(jì)算其平均值。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，研究對(duì)象呼出氣體的 VOCs的濃度 =呼氣中 VOCs濃度 -相應(yīng)環(huán)境中的 VOCs濃度。

1.5 納米傳感器實(shí)驗(yàn)進(jìn)行標(biāo)本分析前，將納米傳感器的進(jìn)樣口真空處理 5 min，再進(jìn)行 5 min的氣體分析，再次進(jìn)行真空處理，重復(fù)3～5次，以測(cè)試儀器的重復(fù)性。分析過程通過數(shù)據(jù)記錄裝置（安捷倫34980型數(shù)字多用表）記錄整個(gè)過程中傳感器電阻的變化。記錄的范圍至少持續(xù)2個(gè)循環(huán)。整個(gè)系統(tǒng)操作過程由自定義的 LabVIEW 電腦程序控制。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理色譜與質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)部分采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，選用線性回歸建立回歸方程，篩選差異性 VOCs采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的 Wilcoxon／Kru-skal-Wallis檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05）。納米傳感器 實(shí) 驗(yàn) 部 分 采 用 判 別 因 子分 析 （discriminant factor analysis，DFA）作為統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別算法。

2 結(jié)果

2.1 樣本收集過程分兩個(gè)階段，共篩選出 251例研究對(duì)象，收集 502份呼氣樣本。受試者均為女性，其中 Luminal A型乳腺癌 25例，年齡 29～68（45± 6）歲；Luminal B型乳腺癌 87例，年齡 31～64（42± 9）歲；HER-2過表達(dá)型乳腺癌 26例，年齡 35～60（47±2）歲；三陰型乳腺癌28例，年齡 33～65（45± 4）歲；良性乳腺病 55例，年齡 28～70（39±8）歲；健康者30例，年齡 26～60（48±6）歲。乳腺癌及良性乳腺病均為初治患者，診斷均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，各組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表 1。所有樣本分兩批進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 呼氣的色譜與質(zhì)譜的分析按照步驟 1.4中的 GC-MS條件對(duì)呼氣樣本進(jìn)行檢測(cè)，選取保留時(shí)間在 0～43 min的總離子流程圖，通過 NIST 05數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析。結(jié)果在所有呼氣標(biāo)本中共檢出 500余種 VOCs，進(jìn)一步分析表明 132種 VOCs存在于超過 80% 的 呼 氣 樣 本 中。 定 量 后，經(jīng) Wilcoxon／Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析共有 28種 VOCs的濃度在人呼氣與環(huán)境氣體間存在明顯差異（P＜0.05）。表明此28種 VOCs由人體產(chǎn)生，可作為潛在標(biāo)志物。其中，25種 VOCs在健康人與乳腺疾病患者（包括良性乳腺病及乳腺癌）間存在明顯差異（P＜0.05）；良性乳腺病與乳腺癌患者間 2種：丙酮（P=0.014 6）、碳酸二甲酯（P=0.021 3）；HER-2過表達(dá)型乳腺癌與非 HER-2過表達(dá)型乳腺癌患者間 13種；Luminal B型乳腺癌患者與非 Luminal B型乳腺癌患者間 1種：環(huán)戊烷（P=0.049）；三陰型乳腺癌患者與非三陰型乳腺癌患者間 5種，Luminal A型乳腺癌患者與非 Luminal A型乳腺癌患者間未見明顯差異。見表2。

表1 研究對(duì)象分組及分階段檢測(cè)人數(shù)

2.3 呼氣的納米傳感器檢測(cè)按照步驟 1.5對(duì)呼氣樣本進(jìn)行檢測(cè)，使用 LabVIEW電腦程序?qū)κ占降男盘?hào)進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)換出數(shù)據(jù)模型。將數(shù)據(jù)輸入SPSS軟件進(jìn)行 DFA判別分析。第一步，判別健康人與乳腺疾病患者間差異。結(jié)果經(jīng)留一法交叉驗(yàn)證，納米傳感器判別乳腺疾病與正常的精確度達(dá)92%，敏感度與特異度分別為 92.86%、83.30%。受試者工作特征曲線 （receiver operating characteristic curve，ROC）分析顯示其曲線下面積（area under the curve，AUC）為 0.96。第二步，在乳腺疾病患者中判別其良惡性。DFA判別分析后經(jīng)留一法交叉驗(yàn)證，結(jié)果顯示納米傳感器判別乳腺疾病良惡性的精確度 72.36% ～80.95%，敏感度與特異度分別達(dá)68.75% ～72.97%與 72.09% ～82.73%。ROC分析顯示AUC為0.71～0.80。第三步，在乳腺癌患者間進(jìn)行分子分析的判別，見表 3、4。

表2 差異性 VOCs在各組研究對(duì)象的二分類比較結(jié)果

3 討論

人呼氣中含有數(shù)百種 VOCs，通過檢測(cè)其組分的改變可以診斷疾?。?］。呼氣 VOCs分析簡(jiǎn)單無創(chuàng)、快捷方便，正逐漸成為腫瘤的一項(xiàng)新興篩查方法。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)篩查出部分與腫瘤相關(guān)的揮發(fā)性標(biāo)志物作為疾病的參考診斷指標(biāo)［8-10］。

本研究使用 TD-GC-MS及納米傳感器檢測(cè)乳腺癌患者、良性乳腺病、健康人呼氣。TD-GC-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同分子分型乳腺癌間存在差異性 VOCs，它們包括烷類、醇類、醛類、酮類、酯類等，其中多種亦見于其 他 報(bào) 道［7-10］。經(jīng)定量分 析 后 表明 25種VOCs在健康人與乳腺疾病患者間存在明顯差異；2種在良性乳腺病與乳腺癌患者間存在明顯差異；13種在 HER-2過表達(dá)型乳腺癌與非 HER-2過表達(dá)患者間存在明顯差異；1種在 Luminal B型乳腺癌與非Luminal B型乳腺癌間存在明顯差異；5種在三陰型乳腺癌與非三陰型乳腺癌間存在明顯差異。而 Luminal A型乳腺癌與非 Luminal A型乳腺癌間未見明顯差異。

表3 納米傳感器判別研究對(duì)象類型的效力

表4 納米傳感器判別研究對(duì)象類型的效力

呼氣中異常 VOCs一般認(rèn)為由細(xì)胞膜中多不飽和脂肪酸與氧自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生［11］。腫瘤細(xì)胞中氧自由基活性增加［12］，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致 VOCs生成較正常細(xì)胞明顯增多。本研究中，乳腺疾病患者與健康人之間差異顯著，原因可能為患病者細(xì)胞氧化應(yīng)激水平與健康人明顯不同。而乳腺癌與良性乳腺疾病間差異相對(duì)較小，可以解釋為兩者氧化應(yīng)激水平差異較小。值得注意的是，HER-2過表達(dá)型乳腺癌與非 HER-2過表達(dá)患者間同樣存在巨大差異，提示 HER-2表達(dá)情況與細(xì)胞氧化應(yīng)激水平可能存在一定的關(guān)系。

考慮 TD-GC-MS設(shè)備龐大、操作復(fù)雜、不適于臨床應(yīng)用，本研究同時(shí)采用納米傳感器檢測(cè)呼氣樣本以判別各型患者。這些納米傳感器的核心部分是金納米顆粒，當(dāng)氣體通過傳感器時(shí)，氣體中的小粒子將在碳層堆積，使傳感器中的金納米顆粒相互靠近，繼而使傳感器的電阻變化。由于每種小粒子具有其獨(dú)特的阻抗效應(yīng)，每個(gè)金納米顆?？梢苑从吵鲆幌盗械?VOCs。通過主成分分析，對(duì)金納米顆粒的電阻變化進(jìn)行篩選，篩選出最能概括出檢測(cè)標(biāo)本最具特征的因素作為主成分，從而建立診斷模型，與其他研究對(duì)象鑒別區(qū)分開來［9］。納米傳感器相對(duì)于 GC-MS技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì)：不需要對(duì)樣本進(jìn)行除濕以及預(yù)富集處理、分析快速、檢測(cè)靈敏度高、分析數(shù)據(jù)前不必對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行選擇就可以將各測(cè)試組區(qū)分開，并且不受性別、年齡及吸煙等因素影響。

本研究中，納米傳感器判別健康人與乳腺疾病患者間差異的結(jié)果經(jīng)留一法交叉驗(yàn)證，其精確度達(dá)92%，敏感度與特異度分別為 92.86%與 83.30%。ROC分析顯示 AUC為0.96。兩組間典型變量值有明顯差異。在乳腺疾病患者中判別其良惡性的結(jié)果顯示其精確度達(dá) 72.36% ～80.95%，敏感度與特異度分別為 68.75% ～72.97%與 72.09% ～82.73%。ROC分析顯示其 AUC為 0.71～0.80。在判別各分子分型的乳腺癌時(shí)亦獲得較高的精確度、靈敏度與特異度。值得一提的是 Shuster et al［13］曾在使用納米傳感器鑒別乳腺影像學(xué)陰性的良性乳腺病與乳腺癌的研究中獲得相似的結(jié)果。納米傳感器通過對(duì)呼氣的檢測(cè)，對(duì)乳腺癌有較高的診斷價(jià)值、良好的應(yīng)用前景［9-10］。

本研究試圖探索呼氣中 VOCs用于鑒別乳腺癌各分子亞型的效力，研究方法同時(shí)采用了傳統(tǒng)的GC-MS方法和新型納米檢測(cè)設(shè)備，結(jié)果提示呼氣對(duì)乳腺癌分子分型的鑒別具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。由于本研究是小樣本的探索性研究，在呼氣診斷真正進(jìn)入臨床前仍需大樣本、多中心的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

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The feasibility of discrim inating themolecular sub-types of breast cancer by exhaled breath

Hua Qingling1，Zhang Wei2，Shi Dayou3，et al
（1Deptof Oncology，The Yijishan Hospital ofWannan Medical College，Wuhu 241001；2Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022；3The First People’s Hospital of Jiujiang，Jiujiang 332000）

Objective To explore the feasibility of discriminating the molecular sub-types of breast cancer（BC）by exhaled breath.Methods The exhaled breath sampleswere collected from 251 volunteers.The samples were analyzed by thermal desorption-gas chromatography-mass spectrometry（TD-GC-MS）and nano-sensor respectively. Resu lts Apparent differences of 13 volatile organic compounds（VOCs）were found between HER-2 over-expression BC patients and non-HER-2 over expression BC patients（P＜0.05）；5 between triple-negative BC patients and non-triple-negative BC patients；1 between Luminal B BC patients and non-Luminal B BC patients，0 between Luminal A BC patients and non-Luminal A BC patients.High accuracy（73.64% ～90.70%），sensitivity（40.00%～93.75%），specificity（73.77% ～93.42%）alsowere found to distinguish themolecular sub-types of BC by the testusing nano-sensor.Conclusion “Breath test”may be a new noninvasive diagnosticmethod for discriminating themolecular sub-types of BC.

breast cancer；molecular sub-types；breath；GC-MS；nano-sensor

R 737.9

A

1000-1492（2016）02-0226-05

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.034.htm l

2015-11-17接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1508085MH171）

1皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，蕪湖 241001

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，合肥 2300223九江市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，九江 3320004合肥市第二人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，合肥 2300005安慶市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安慶 2460006銅陵市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，銅陵 2440007滁州市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，滁州 2390008安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，合肥 230000

花慶嶺，男，碩士研究生；

張 偉，男，碩士研究生；

劉 虎，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任

作者，E-mail：drliuhu＠gmail.com

*對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)