急性白血病患者外周血T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測及臨床意義

張司琪，葛 健，夏瑞祥

急性白血病患者外周血T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測及臨床意義

張司琪，葛 健，夏瑞祥

目的了解急性白血病（AL）患者外周血 T淋巴細(xì)胞亞群、自然殺傷（NK）細(xì)胞和調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（Treg）的水平及不同時期的變化，并探討其臨床意義。方法采用流式細(xì)胞術(shù)對 AL初診患 者 （93例 ）、異 基因 造 血 干細(xì) 胞 移 植 （Allo-HSCT）者（9例）及正常健康對照者（30例）外周血 CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+／CD8+比值、NK細(xì)胞和 CD4+CD25+CD127lowTreg進(jìn)行 檢測。結(jié)果初診 AL患者 CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4+／CD8+比值和 NK細(xì)胞低于正常對照者（P＜0.05），Treg細(xì)胞高于正常對照者（P＜0.05）；AL患者治療后達(dá)完全緩解（CR）者 CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4+／CD8+比值、NK細(xì)胞及 Treg細(xì)胞可逐漸恢復(fù)，但 NK細(xì)胞恢復(fù)緩慢，Treg細(xì)胞在緩解早期較治療前增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Allo-HSCT患者 CD4+T細(xì)胞水平和 CD4+／CD8+比值明顯低于正常對照者（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞水平明顯高于正常對照者（P＜0.05）。結(jié)論AL患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂，動態(tài)檢測 T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及 Treg對了解 AL患者細(xì)胞免疫功能及免疫調(diào)節(jié)治療有一定的臨床價值。

急性白血??；T淋巴細(xì)胞亞群；NK細(xì)胞；調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是起源于造血干細(xì)胞的克隆性惡性血液病，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫紊亂密切相關(guān)，尤其是細(xì)胞免疫異常。T淋巴細(xì)胞和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是細(xì)胞免疫的重要組成部分，在抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）有免疫調(diào)節(jié)功能，在腫瘤環(huán)境中能夠抑制抗腫瘤免疫。該研究對93例初診 AL患者、9例異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）患者和 30例健康對照者進(jìn)行外周血 T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及 Treg細(xì)胞水平進(jìn)行檢測，并動態(tài)觀察其在AL患者治療前后的變化。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取 2014年 7月 ～2015年 6月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科確診的93例初診 AL患者（AML 73例，ALL 17例，MPAL 3例），其中男 56例，女 37例，年齡 14～84（50.7± 17.57）歲；9例 AL Allo-HSCT者，其中男 7例，女 2例，年齡 25～43（30.67±6.38）歲。正常對照者 30例，其中男 17例，女 13例，年齡 21～54（32.13± 10.00）歲，均為醫(yī)院體檢中心健康體檢者。

1.2 主要試劑和儀器鼠抗人單克隆抗體：CD4-PB、CD8-APC、CD3-FITC／CD（16+56）PE、CD45-KO、CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE，溶血素，磷酸鹽緩沖液（PBS），水平離心機(jī)，旋窩振蕩器，Navios流式細(xì)胞儀（美國 Beckman Coulter公司）。

1.3 標(biāo)本的制備清晨收集研究對象空腹外周靜脈血 3 ml，置于肝素抗凝管中，混勻后取 2 ml于離心管，置離心機(jī)中，1 500 r／min離心 5 min，吸除最上層血漿后充分混勻。取兩支 BECKMAN離心管，各加入混勻的去血漿抗凝血 100μl，分別編號為試管 1和試管 2，試管 1中加入 10μl CD4-PB、CD8-APC、CD3-FITC／CD（16+56）PE、CD45-KO，試管 2中加入 10μl CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE，渦旋混勻，室溫避光放置 15 min。取出后向兩支試管中各加入 1 ml溶血素，旋窩混勻，避光放置 15 min。取出置離心機(jī)中，1 500 r／min離心 5 min后，棄去上清液，各加入 0.5 ml PBS溶液旋窩混勻后直接上機(jī)，每管收集 2 000個淋巴細(xì)胞。

1.4 T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的檢測方法（試管1）首先在 FSC-SSC散點圖上圈定淋巴細(xì)胞群，以CD45+／SSC射門，選擇 CD45陽性且SSC較小的細(xì)胞區(qū)，其中 CD3陽性且 CD4陽性者為CD4+T細(xì)胞群，CD3陽性且 CD8陽性者為 CD8+T細(xì)胞群，CD3不表達(dá)且 CD（16+56）高表達(dá)者為 NK細(xì)胞，檢測結(jié)果以各類細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分率表示。

1.5 Treg的檢測方法（試管2）首先在 FSC-SSC散點圖上圈定淋巴細(xì)胞群，再以 CD4+／SSC射門，選擇 CD4陽性且 SSC較小的細(xì)胞區(qū)，其中 CD25陽性而 CD127低表達(dá)者為 CD4+CD25+CD127lowTreg。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用 ˉx±s表示；多組均數(shù)的比較采用方差分析，方差齊時采用 LSD檢驗，方差不齊采用 Dunnett′s T3檢驗兩兩比較各組間差異。

2 結(jié)果

2.1 AL患者基本情況93例初診 AL患者誘導(dǎo)治療后完全緩解（CR）者 55例，部分緩解（PR）者 9例，未緩解者 19例，死亡者 3例，放棄治療者 7例。55例 CR者為 AL CR（1個月）組。3個月后仍 CR者 49例，復(fù)發(fā)兩例，失訪 4例，該 49例為 AL CR（3個月）組。19例未緩解者為 AL未緩解組。

2.2 A llo-HSCT者基本情況9例 AL Allo-HSCT者為 AL移植組，均為移植 3～18個月后來我院復(fù)查患者，其造血干細(xì)胞來源分別為親緣全相合6例，親緣非全相合移植 2例，非親緣臍血干細(xì)胞移植 1例。檢測時患者均處于 CR狀態(tài)，其中 3例患有慢性移植物抗宿主?。╟hronic graft-versus-host disease，cGVHD），兩例表現(xiàn)以皮疹為主，1例表現(xiàn)以腹瀉及肝功能異常為主。

2.3 T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果初診 AL組、AL CR（1個月）組、AL CR（3個月）組、AL未緩解組、AL移植組和正常對照組 T細(xì)胞亞群的具體檢測結(jié)果見表 1，其中 CD3+T細(xì)胞水平、CD4+T細(xì)胞水平和 CD4+／CD8+比值滿足方差齊性，6組間均數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.538、28.513、17.348，P＜0.05），CD8+T細(xì)胞水平不滿足方差齊性，6組間均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.498，P＜0.05）。組間兩兩比較結(jié)果顯示：初診 AL組和 AL未緩解組CD3+T細(xì)胞百分比、CD4+T細(xì)胞百分比、CD4+／CD8+比值均明顯低于正常對照組（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞百分比均高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；AL CR（1個月）組及 AL CR（3個月）組患者T淋巴細(xì)胞亞群與正常對照組無明顯差異，CD3+T細(xì)胞百分比、CD4+T細(xì)胞百分比、CD4+／ CD8+比值均高于初診 AL組（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞百分比低于初診 AL組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；AL移植組 CD3+T細(xì)胞百分比與正常對照組無明顯差異，CD4+T細(xì)胞百分比、CD4+／CD8+比值均明顯低于正常對照組（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞百分比明顯高于正常對照組（P＜0.05）。見表1。

2.4 NK細(xì)胞檢測結(jié)果各組 NK細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的 百 分 率 分 別 為：初 診 AL組 （11.84% ± 6.65%），AL CR（1個月）組（12.34% ±7.18%），AL CR（3個月）組（14.96% ±7.40%），AL未緩解組 （11.87% ±7.22%），AL移 植 組 （16.33% ± 6.67%），正常對照組（16.30% ±6.10%），滿足方差齊性，6組間均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.319，P＜0.05）。組間兩兩比較結(jié)果示：初診 AL組和 AL未緩解組NK細(xì)胞百分比均明顯低于正常對照組（P＜0.05）；AL CR（1個月）組 NK細(xì)胞百分比仍低于正常對照組（P＜0.05）；初診 AL組和 AL CR（1個月）組 NK細(xì)胞水平無明顯差異；AL CR（3個月）組NK細(xì)胞百分比接近正常對照組，高于初診 AL組（P＜0.05）；AL移植組 NK細(xì)胞百分比與正常對照組無明顯差異。見表1。

2.5 Treg檢測結(jié)果各組 Treg細(xì)胞占 CD4+T細(xì)胞的百分率分別為：初診 AL組（8.31% ±3.74%），ALCR（1個月）組（9.67% ±3.81%），AL CR（3個月）組（6.69% ±2.99%），AL未緩解組（10.33% ± 3.52%），AL移植組（6.83% ±3.85%），正常對照組（6.33% ±2.62%），不滿足方差齊性，6組間均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.536，P＜0.05）。組間兩兩比較結(jié)果示：初診 AL組、AL CR（1個月）組及 AL未緩解組 Treg百分比明顯高于正常對照組（P＜0.05）；AL CR（1個月）組及未緩解組 Treg百分比均高于初診 AL組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；AL CR（3個月）組 Treg百分比與正常對照組無明顯差異，明顯低于 AL CR（1個月）組（P＜0.05）及 AL未緩解組（P＜0.05）；AL移植組 Treg水平與正常對照組無明顯差異。見表1。

3 討論

T淋巴細(xì)胞有輔助功能、殺傷功能和抑制功能，其各亞群之間的平衡狀態(tài)與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。CD3是 T細(xì)胞表面的重要標(biāo)志，CD3+細(xì)胞可用于計數(shù) T淋巴細(xì)胞總數(shù)。T細(xì)胞亞群包括 CD4+T細(xì)胞群和 CD8+T細(xì)胞群。CD4+T細(xì)胞亞群有免疫協(xié)調(diào)功能，CD8+T細(xì)胞亞群有免疫抑制作用和殺傷靶細(xì)胞的功能，CD4+／CD8+比例穩(wěn)定對維持細(xì)胞免疫反應(yīng)平衡至關(guān)重要。本實驗結(jié)果顯示 AL患者CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD4+／CD8+比值均明顯低于正常對照組，提示 AL患者存在 T淋巴細(xì)胞平衡紊亂，細(xì)胞免疫功能受到抑制。AL CR患者 T細(xì)胞亞群各抗原比例接近正常，提示機(jī)體細(xì)胞免疫功能得到一定程度的恢復(fù)?；熓侵委?AL的常規(guī)手段，Allo-HSCT是 AL患者長 期存活 的有效 治療方法。研究［1］顯示，化療對細(xì)胞免疫有抑制作用，免疫調(diào)節(jié)劑（如 IL-2）能夠改善化療后白血病患者 T細(xì)胞亞群水平。Allo-HSCT患者通過大劑量化療預(yù)處理，再回輸供者造血干細(xì)胞，重建免疫系統(tǒng)，并且需長期使用激素和免疫抑制劑，以防治 GVHD。國內(nèi)外研究［2-3］顯示，Allo-HSCT患者移植后 CD8+T細(xì)胞恢復(fù)較快，CD4+T細(xì)胞恢復(fù)較慢，導(dǎo)致 CD4+／CD8+比值 長 期 倒 置。本 實 驗 結(jié) 果 顯 示 AL Allo-HSCT患者 CD4+T細(xì)胞比值明顯降低，CD8+T細(xì)胞比值明顯增高，CD4+／CD8+比值嚴(yán)重倒置，與研究［2-3］結(jié)果一致，提示 AL患者移植后機(jī)體細(xì)胞免疫功能長期處于抑制狀態(tài)。

表1 AL患者 T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及 Treg水平（ˉx±s）

NK細(xì)胞有細(xì)胞毒功能和免疫調(diào)節(jié)功能，是感染和抗腫瘤免疫的第一道天然防線［4］。一項對 42例 AL患兒的研究［5］顯示，AL患兒在疾病發(fā)生和治療過程中存在細(xì)胞免疫功能異常，治療并獲得 CR后，患兒細(xì)胞免疫功能可逐漸恢復(fù)，但 NK細(xì)胞水平恢復(fù)緩慢，獲得 CR一年后 NK細(xì)胞水平仍未達(dá)到正常。本研究結(jié)果顯示 AL初診患者 NK細(xì)胞水平低于正常對照者，提示初診 AL患者 NK細(xì)胞免疫功能受損，AL CR患者誘導(dǎo)治療 1個月后 NK細(xì)胞水平未見明顯升高，誘導(dǎo)治療 3個月后接近正常，提示NK細(xì)胞恢復(fù)速度相對緩慢，與上述研究［5］結(jié)果一致。

Treg有免疫抑制性和免疫無能性，其增高或減低與多種機(jī)體病理狀態(tài)相關(guān)。Treg細(xì)胞高表達(dá)可能與多種惡性腫瘤性的不良預(yù)后相關(guān)［6］，而低表達(dá)則與免疫性血小板減少癥、潰瘍性結(jié)腸炎等多種免疫相關(guān)性疾病相關(guān)［7-8］。研究［9］表明 Treg可以抑制抗腫瘤免疫。本研究顯示 AL初診患者 Treg較正常對照者明顯增高，提示 AL患者抗腫瘤免疫受到抑制。而本研究中 ALCR（1個月）組及 AL未緩解組Treg細(xì)胞均高于治療前水平，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示AL患者誘導(dǎo)治療后機(jī)體免疫可能進(jìn)一步受抑?？赡苁且驗榛煴旧韺C(jī)體免疫功能有負(fù)作用。Treg細(xì)胞水平還與 aGVHD相關(guān)。Magenau et al［10］的臨床實驗提示 Treg細(xì)胞水平可作為 aGVHD的生物預(yù)測標(biāo)志。傅華睿 等［11］發(fā)現(xiàn)，Allo-HSCT患者在血象恢復(fù)后3～5 d，Treg／CD4+T細(xì)胞比例小于7% 時，發(fā) 生 aGVHD 的 風(fēng) 險 增 大。本 實 驗 Allo-HSCT者均為移植 3個月后 AL患者，其 Treg水平與正常對照者無明顯差異，可能是因為病例數(shù)較少，以及未對移植患者進(jìn)行無 GVHD和 cGVHD分組比較相關(guān)。早期和動態(tài)監(jiān)測移植患者 Treg細(xì)胞水平可進(jìn)一步了解 Allo-HSCT患者免疫重建過程及細(xì)胞免疫水平。

Treg細(xì)胞可能參與 T細(xì)胞亞群和 NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)。研究［12］顯示，Treg可以通過促進(jìn) CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，抑制 NK細(xì)胞免疫應(yīng)答，參與急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展。本實驗結(jié)果顯示 AL初診組 Treg細(xì)胞水平高于正常對照組，NK細(xì)胞水平低于正常對照組，AL CR（3個月）組 Treg細(xì)胞及 CD8+T細(xì)胞水平降低，NK細(xì)胞水平升高。但 AL CR（1個月）組Treg細(xì)胞百分比較治療前稍升高，而 NK細(xì)胞水平未見下降，CD8+T細(xì)胞水平未見升高，提示 Treg細(xì)胞與 CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞并非絕對相關(guān)，其之間的關(guān)系及機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，AL患者在疾病發(fā)生及治療過程中存在細(xì)胞免疫功能紊亂，經(jīng)治療并獲得 CR后細(xì)胞免疫功能可逐漸恢復(fù)。動態(tài)檢測 T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及 Treg可反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫水平，臨床上對了解患者細(xì)胞免疫功能及免疫調(diào)節(jié)治療有一定價值。治療過程中根據(jù)患者 T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及Treg水平，適當(dāng)應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑可能有助于患者恢復(fù)。

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Detection of T lymphocyte subsets，NK cells，regulatory T cells in peripheral blood of patientswith acute leukem ia and its clinical significance

Zhang Siqi，Ge Jian，Xia Ruixiang
（Dept of Hemotology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To study the levels of T lymphocyte subsets，NK cells，regulatory T cells in peripheral blood of patients with acute leukemia，and the changes in different periods，and to explore its clinical significance. Methords To detect the level of peripheral blood of CD3+T cells，CD4+T cells，CD8+T cells，CD4+／CD8+ratio，NK cells and CD4+CD25+CD127lowTreg in 93 newly diagnosed AL patients，9 AL patients after Allo-HSCT and 30 normal controls by using flow cytometry.Resu lts The percentages of CD3+T cells，CD4+T cells，NK cells and the ratio of CD4+／CD8+in newly diagnosed AL patients were much lower than the normal controls（P＜0.05），and Treg in newly diagnosed AL patientswasmuch higher than the normal controls（P＜0.05）.The levels of CD3+T cells，CD4+T cells，CD4+／CD8+ratio，NK cells and Treg in the patients achieved CR were gradually close to the normal controls.But the recovery rate of NK cells was slow，and the level of Treg in early CR period was increased than that of before induction therapy，but it had no statistically significant difference.The level of CD4+T cells and the ratio of CD4+／CD8+in the group of Allo-HSCTwere significantly lower than the normal controls（P＜0.05），and the level of CD8+T cells in the group of Allo-HSCT was significantly higher than the normal controls（P＜0.05）.Conclusion Cellular immune function is disordered in patientswith AL.Dynamic detection of T lymphocyte subsets，NK cells，regulatory T cells are clincially value on investigating cellular immune function and immune regulation therapy in patientswith AL.

acute leukemia；T lymphocyte subsets；NK cells；regulatory T cells

R 733.71

A

1000-1492（2016）02-0218-04

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.030.htm l

2015-11-06接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81200371）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金聯(lián)合資助課題（新教師類聯(lián)合資助課題）（編號：20123420120011）；安徽省自然 科學(xué)基金（編號：1208085QH154）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 230022

張司琪，女，碩士研究生；

葛 健，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：gejian77＠m(xù)edmail.com.cn；

夏瑞祥，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xrx2041＠163.com