BMP-4對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)歸影響的實(shí)驗(yàn)研究

李海太，申才良，宋旆文，劉曉穎，楊 昆，杜 寧，王漢邦

BMP-4對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)歸影響的實(shí)驗(yàn)研究

李海太1，申才良1，宋旆文1，劉曉穎2，楊 昆1，杜 寧1，王漢邦1

目的探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP-4）對經(jīng)過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）共同培養(yǎng)后的大鼠神經(jīng)干 細(xì)胞（NSCs）的存活和分化的影響。方法建立 BMSCs與 NSCs共培養(yǎng)模型，在共同培養(yǎng)體系中加入 BMP-4，采用流式細(xì)胞儀檢測 NSCs的存活率，同時(shí)利用細(xì)胞免疫熒光和 Western blot法鑒定 NSCs的分化情況，通過比較 NSCs的存活率和分化率，進(jìn)而分析 BMP-4對共培養(yǎng)后 NSCs的存活及分化的影響。結(jié)果共培養(yǎng)體系加入 BMP-4后，大鼠 NSCs的細(xì)胞存活率低于對照組（P＜0.05），BMP-4促進(jìn)了 NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化而阻礙其向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，而分化后的神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性表達(dá)蛋白神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞酸性纖維蛋白（GFAP）的表達(dá)率高于對照組（P＜0.05），少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白髓鞘堿性蛋白（MBP）表達(dá)率低于對照組（P＜0.05）。結(jié)論BMP-4阻礙了 MSCs促進(jìn) NSCs有效分化的效應(yīng)。

共培養(yǎng)；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；分化；神經(jīng)干細(xì)胞；存活

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指表現(xiàn)為損傷脊髓平面以下的感覺以及運(yùn)動(dòng)功能完全或部分喪失為的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重性創(chuàng)傷疾?。?］。目前針對該疾病的主要治療方法在疾病后期通過細(xì)胞移植來進(jìn)行 細(xì)胞的替 代 的 神經(jīng)營養(yǎng)的 補(bǔ) 充［2］。研究［3］表明利用干細(xì)胞的多向分化潛能，特別是某些神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）能夠分化為特定的神經(jīng)細(xì)胞，使脊髓的功能恢復(fù)以及 SCI修復(fù)成為可能。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（bone morphogenetic protein-4，BMP-4）是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中必不可少的形態(tài)蛋白［4］，可以通過多種信號通路來完成對神經(jīng)系統(tǒng)的生長和發(fā)育的調(diào)控［4］。該實(shí)驗(yàn)采用體外分離培養(yǎng)出 NSCs，分析 BMP-4對 NSCs存活及分化的影響，為臨床治療 SCI提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級大鼠新生雌鼠 1只。SD雌性大鼠 1只，4～6周齡，100 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑 DMEM低糖細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；DMEM／F12細(xì)胞培養(yǎng)液（美國 Gibco公司）；小鼠抗大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞酸性纖維蛋白（glial fibrillaryacidic protein，GFAP）、兔抗小鼠抗微管相 關(guān) 性 蛋 白 2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）抗體、兔抗大鼠細(xì)胞髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）、小鼠抗大 鼠 細(xì) 胞 巢 蛋 白 抗 體（Nestin）、FITC標(biāo)簽的山羊抗小鼠 IgG抗體 （美國Santa Cruz公司）；堿性細(xì)胞成纖維生長因子（basic fibrob lastgrowth factor，bFGF）、細(xì)胞表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和 B-27細(xì) 胞 因 子 （美國 PeproTech公司）；Triton X-100、TRITC標(biāo)簽山羊抗兔 IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；包被用 左 旋 氏 多 聚 賴 氨 酸 （Poly-L-Lysine）（美 國Sigma公司）；ECL蛋白顯影液試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒（美國 Pierce公司）；Transwell培養(yǎng)板（美國 Corning公司）；Hoechst33442、免疫熒光一抗稀釋液、免疫熒光二抗稀釋液、青／鏈霉素溶液（× 100）、即用型胰蛋白酶細(xì)胞消化液、抗熒光淬滅封片液（上海碧云天公司）；BMP-4（美國 Peprotech公司）；AnnexinV-PI凋亡試劑盒（美國 BD公司）。

1.2 方法

1.2.1體外分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs） 本實(shí)驗(yàn)從大鼠股骨和脛骨骨髓中分離出 BMSCs后采取骨髓貼壁法培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基由含 100 U／m l青鏈霉素及10%胎牛血清的 DMEM（低糖）組成，放置于含 5%CO2、37℃細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中，每隔 2～3 d更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后，進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞傳至第3代后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測分析細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物（CD90、CD29、CD34），并結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠 BMSCs。

1.2.2體外培養(yǎng)大鼠 NSCs 取 SD大鼠新生鼠，脫臼處死。浸泡在 75%酒精中 5 min后斷頭，依次分離出全腦組織并將腦膜及殘余血管剝除。用剪刀充分剪碎全腦組織，放入 1 ml即用型胰酶細(xì)胞消化液，放置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，時(shí)間為 8～10 min，加入含血清的 NSCs培養(yǎng)液以終止消化，轉(zhuǎn)移至篩網(wǎng)，過濾為細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)至 15 m l離心管，800 r／min離心 5 min。棄除管內(nèi)上清液，加入 2 ml的無血清NSCs完全培養(yǎng)基并再次重復(fù)離心。加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為 105個(gè)／ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔 3 d采取半量換液法更換培養(yǎng)基 1次，培養(yǎng) 7 d后傳代。傳至第 2代后，行免疫細(xì)胞化學(xué)熒光檢測 NSCs特異性蛋白（Nestin巢蛋白），證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為大鼠 NSCs。

1.2.3BMSCs與 NSCs共同培養(yǎng) 將第 3代后的BMSCs以 1×106／m l的細(xì)胞密度接種于共培養(yǎng)板的下室，在培養(yǎng)板上室內(nèi)接種第 2代 NSCs，接種密度與下室細(xì)胞密度相同，保證培養(yǎng)液能夠在培養(yǎng)板上下室間相互通融，以后每隔 3 d進(jìn)行換液，共培養(yǎng) 7 d，建立起大鼠 NSCs與 BMSCs的共同培養(yǎng)體系。

1.2.4BMP-4對 NSCs存活率影響實(shí)驗(yàn) 采用 AnnexinV-PI細(xì)胞凋亡試劑盒，利用流式細(xì)胞術(shù)測定誘導(dǎo)凋亡后的 NSCs的存活率，步驟如下：① 將 NSCs分為 4組并進(jìn)行編號后分別接種于 24孔板中，每孔約 1 ml，其中第 3組和第 4組為共培養(yǎng)的 NSCs，第 1組和第 2組細(xì)胞為獨(dú)立培養(yǎng)的 NSCs，② 第 2組（H2O2組）加入 100μmol／ml的 H2O2，第 1組（對照組）加入等量的 PBS，第 3組（H2O2+共培養(yǎng)組）加入 100μmol／ml的 H2O2，第 4組（H2O2+共培養(yǎng) + BMP-4組）加 入 100μmol／m l的 H2O2和 2 ng／ml BMP-4，溫箱培養(yǎng) 4 h；③ 將細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以 1 000 r／min離心 4 min，棄去上清液，加入適量的 PBS緩沖液重懸上述細(xì)胞；④ 取細(xì)胞懸液 1 ml，1 000 r／min離心 4 min，去 除 上 清液后加入 100μl的 Binding Buffer，重懸細(xì)胞，加入 5μl經(jīng)熒光標(biāo)記的 Annexin-V試劑，充分混勻，避光條件下孵育 20 min；⑤ 加入5μl的 PI試劑后避光下孵育 5 min；⑥ 加入 400μl的細(xì)胞重懸液，混勻后立刻行流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn) 將共培養(yǎng)后的 NSCs接種于經(jīng) 0.1%多聚賴氨酸包被的玻片，實(shí)驗(yàn)組加入 2 ng／m l BMP-4，對照組加入等量的 PBS，貼壁培養(yǎng) 7 d后，細(xì)胞形態(tài)上出現(xiàn)了明顯的分化，各蓋玻片大部分鋪滿細(xì)胞，以 GFAP（神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物）、MBP（少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白標(biāo)志物）和MAP-2（神經(jīng)元特異性標(biāo)志物）行細(xì)胞免疫熒光染色檢測。用 PBS洗 3次，每次 5 min，常溫下使用免疫熒光染色固定液固定 20 min；吸去殘液后用 PBS緩沖液洗 3次，每次 5 min；0.1%Triton X-100中孵育20 min；PBS緩沖液洗 3次，每次 5 min。用正常山羊血清封閉液于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中封閉 1 h，將免疫熒光一抗抗體 MAP-2、MBP、GFAP抗體均按1∶100稀釋混合均勻后分別依次加入各培養(yǎng)孔內(nèi)，在4℃冰箱條件下孵育過夜；第 2天放置常溫下 2 h，PBS緩沖液洗 3次，每次 5 min；后加入 TRITC標(biāo)簽山羊抗兔 IgG（1∶100）及 FITC標(biāo)簽的山羊抗小鼠 IgG抗體（1∶100），于 37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育 1 h；用 PBS緩沖液漂洗 3次，每次 5 min。Hoechst染色 5 min后 PBS漂洗 3次，每次 5 min?？篃晒獯銣绶馄悍馄篑R上用免疫熒光顯微鏡觀察同時(shí)拍照。

1.2.6Western blot法檢測細(xì)胞分化后 MBP、MAP-2、GFAP蛋白的表達(dá) BMSCs與 NSCs共同培育后，將 NSCs接種在經(jīng) 0.1%多聚賴氨酸包被的大玻片上，其中實(shí)驗(yàn)組加入 2 ng／ml BMP-4，對照組加入等量的 PBS，貼壁培養(yǎng)7 d。提取各組細(xì)胞分化后的總蛋白，用 BCA蛋白定量檢測試劑盒測定各組蛋白含量，確定電泳上樣量為 20μg，蛋白行 10%SDSPAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，非特異性封閉。加入一抗 MAP-2、GFAP、MBP單克隆抗體，所使用抗體稀釋濃度為 β-actin（鼠單抗，1∶1 000）、GFAP（兔多抗，1∶500）MAP-2（小鼠單抗，1∶200）、MBP（小鼠單抗，1∶1 000）。4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，加入對應(yīng)的二抗；4℃孵育 1 h，用 ECL發(fā)光劑時(shí)間為 1～5 min，通過進(jìn)行曝光、顯影、定影一系列操作后使用數(shù)碼分析成像系統(tǒng)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用目的蛋白的灰度值表示相對表達(dá)的目的蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，兩組間比較使用 t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠 BMSCs特異性表面標(biāo)志物A：CD90；B：CD29；C：CD34；紅色條帶代表表達(dá)陽性細(xì)胞；灰色條帶代表未表達(dá)對照組

2.1 大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定原代BMSCs在接種起始，細(xì)胞大部分呈懸浮狀態(tài)，24 h后首次換液，可見懸浮細(xì)胞明顯減少，鏡下已可見部分貼壁細(xì)胞，細(xì)胞大小不均一，形態(tài)各不相同。培養(yǎng)約4～5 d后見細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，貼壁細(xì)胞呈菱形、梭形等形態(tài)。第 3代以后，細(xì)胞形態(tài)大體均勻一致。取第 3代的 BMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物 CD90、CD29、CD34。見圖1。與對照組比較，CD90、CD29的熒光值明顯向右偏移動(dòng)，而 CD34的熒光值與對照組基本重疊，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析確定該細(xì)胞為 BMSCs。

2.2 大鼠NSCs鑒定體外分離的原代 NSCs培養(yǎng)2～3 d后可見細(xì)胞聚集成球形懸浮生長，培養(yǎng)至第7天時(shí)培養(yǎng)瓶內(nèi)可見大量細(xì)胞的集落，折光性較強(qiáng)。見圖2。取貼壁后的神經(jīng)干細(xì)胞球，行 NSCs特異性蛋白 Nestin熒光染色檢測，結(jié)果見細(xì)胞球中細(xì)胞表達(dá) Nestin，見圖3A。

圖2 神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分化 ×100 A：NSCs原代培養(yǎng)；B：分化的 NSCs；1：3 d；2：7 d

2.3 BMP-4對NSCs分化的影響B(tài)MSCs與 NSCs共培養(yǎng)后，接種于經(jīng) 0.1%多聚賴氨酸包被的玻片，實(shí)驗(yàn)組 加 入 2 ng／ml BMP-4，對 照 組 加 入 等 量 的PBS，貼壁培養(yǎng) 3 d后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯，7 d后細(xì)胞形態(tài)上已出現(xiàn)了明顯的分化，光鏡下示細(xì)胞球向周邊放射狀生長，交織更緊密，間隙更窄。見圖2。細(xì)胞免疫熒光可見 GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，MAP-2表達(dá)陽性的神經(jīng)元細(xì)胞以及 MBP表達(dá)陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞。見圖3。

圖3 NSCs免疫熒光染色陽性結(jié)果 ×400 A：Nestin；B：GFAP；C：MAP-2；D：MBP

2.4 BMP-4對NSCs存活率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測分析顯示共培養(yǎng)后的 NSCs存活率明顯提高，但在共培養(yǎng)體系中加入 BMP-4后細(xì)胞存活率出現(xiàn)一定程度的下降，經(jīng)方差分析顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.373，P＜0.05）。見圖4。

2.5 Western blot法檢測MBP、MAP-2、GFAP的表達(dá)將接種的 NSCs培養(yǎng) 7 d后，提取蛋白后行Western blot法檢測，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中 GFAP的表達(dá)量高于對照組（t=9.638，P＜0.05），而 MBP的表達(dá)量低于對照組（t=4.902，P＜0.05），MAP-2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.71，P＞0.05）。見圖5。

圖4 NSCs流式細(xì)胞儀分析結(jié)果及存活率比較A：對照組；B：H2O2組；C：H2O2+共培養(yǎng)組；D：H2O2+共培養(yǎng)+BMP-4組；與 H2O2組 比 較 ：*P＜0.05；與 H2O2+共 培 養(yǎng) 組 比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

圖5 NSCs分化后相關(guān)蛋白表達(dá)量比較與對照組比較：*P＜0．05，**P＜0.01

3 討論

SCI常見于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)生的意外事故，全世界大約 2 500萬人殃患該損傷［5］。特定的 NSCs移植治療 SCI是目前最有潛力的治療方法，但是由于 SCI后微環(huán)境并不有利于 NSCs的定植、存活及分化［6］，仍需要進(jìn)一步探究 NSCs新的移植方法。研究［7］表明在 SCI早期 BMPs迅速增高，持續(xù)約 3 d，后逐漸減低，增高的 BMPs有阻礙 MSCs促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測 NSCs的存活率及 Western blot法檢測 NSCs分化后特異性蛋白檢測及差異性分析，結(jié)果表明 BMP-4抑制共培養(yǎng)后的 NSCs的細(xì)胞存活率，而且促進(jìn) NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化抑制其向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。

NSCs移植治療 SCI的成功前提首先是移植后的 NSCs能夠存活，但 SCI初期的微環(huán)境并不利于NSCs的存活和定植［6］。本研究利用特定濃度的雙氧水制作細(xì)胞凋亡模型，探究不同環(huán)境下 NSCs的存活率，顯示單獨(dú)培養(yǎng)的 NSCs經(jīng)雙氧水誘導(dǎo)后存活率大幅度下降，這與 Hu et al［8］的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似，同時(shí)經(jīng)過于共培養(yǎng)后的 NSCs的存活率有明顯的提升，這可能與 MSCs分泌的細(xì)胞因子有保護(hù)NSCs的作用有關(guān)［9］。而在相同共培養(yǎng)體系中加入BMP-4后發(fā)現(xiàn) NSCs的存活率出現(xiàn)一定程度的下降，表明 BMP-4有抑制 MSCs保護(hù) NSCs的作用。BMP-4是轉(zhuǎn)化生長因子超家族（TGF）的一員，生物學(xué)活性比較廣泛，作用于神經(jīng)發(fā)育的不同階段，有調(diào)節(jié)細(xì)胞存活 及分化 的作用［10］。研究［9］表明 MSCs能夠分泌多種細(xì)胞因子，作用于 NSCs，促進(jìn)其存活及分化。推斷 BMP-4可能通過拮抗 MSCs分泌某種細(xì)胞因子重新從而抑制 NSCs的存活，如細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo) Olig2信號通路、Notch相關(guān)信號通路等。但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究中去探索。

在治療 SCI的過程中 NSCs的分化方向也起到非常重要的作用，研究［11］顯示 NSCs可定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，而對SCI的治療起主要作用的是神經(jīng)元細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過采用 Western blot法 檢測 NSCs不同分化過程中的特異性蛋白的表達(dá)率，結(jié)果表明BMP-4作用于共培養(yǎng)體系后 MBP表達(dá)量減低而GFAP表達(dá)量升高，Sandner et al［12］發(fā)現(xiàn) BMPs有阻礙 MSCs促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用。存在于成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大多數(shù)區(qū)域，受體表達(dá)量低，但在神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)損傷后表 BMP受體達(dá)升高［13］，增高的 BMP受體有阻礙 MSCs促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的作用［12］，本研究結(jié)果與之一致，具體作用機(jī)制將進(jìn)一步研究。

綜上所述，體內(nèi)脊髓早期損傷因子 BMPs是阻礙 NSCs有效分化的重要因素之一，SCI早期 BMPs的增高將影響 MSCs促進(jìn) NSCs有效分化，本研究顯示 BMP-4阻礙了 MSCs促進(jìn) NSCs有效分化，這將導(dǎo)致 MSCs與 NSCs早期共同移植后的 NSCs并不能有效的分化為神經(jīng)元細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞，不能達(dá)到NSCs移植的理想的預(yù)期治療效果。雖然 BMSCs的培養(yǎng)基具有促進(jìn) NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的作用［14］，但本實(shí) 驗(yàn)在體 外環(huán)境 下研究 顯示 BMP-4對 MSCs與 NSCs共培養(yǎng)體系有重要的影響作用，這也間接提示 MSCs與 NSCs早期共同移植不利于兩者協(xié)同效應(yīng)的發(fā)揮，這將為 SCI的治療方法帶來突破性的進(jìn)展。

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Effect of BMP-4 on neural stem cells co-cultured w ith rat bonemarrow mesenchymal stem cells

LiHaitai，Shen Cailiang，Song Peiwen，et al
（Deptof Spine Surgery，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To explore the effect of bone morphogenetic protein（BMP-4）on survival and differentiation of neural stem cells（NSCs）co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs）.Methods Firstly，themodeling of MSCs co-cultured with NSCs was set up，then BMP-4 was put into this co-culture system.After that，the survival rate of NSCswas detected by the flow cytometry（FCM）and expression of NSCswas detected by immunocytochemistry and Western bolt.By comparing the rates of cell survival and differentiation，the effect of BMP-4 on survival and differentiation of NSCswas analyzed.Results After addition of BMP-4，the survival rate of neural stem cellswas lower than the control group（P＜0.05），the expression ofMBPwas lower than the control group（P＜0.05），and the expression rate of GFAP was higher than the control group（P＜0.05）.Conclusion BMP-4 hinders the differentiation effect of MSCs，promotion on NSCs.

co-culture；bonemorphogenetic protein；bone marrow mesenchymal stem cells；differentiation；neural stem cells；survival

R 363

A

1000-1492（2016）02-0205-05

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.024.htm l

2015-11-11接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81472088）；安徽省自然科學(xué)基金（編號：1508085MH152）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱外科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院生物學(xué)系，合肥 230032

李海太，男，碩士研究生；

申才良，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shencailiang1616＠163.com