M icroRNA-133b-5p通過靶向調(diào)控Fas基因影響 H9c2心肌細(xì)胞凋亡

程 潔，何淑芳，韓正怡，朱海娟，張 野

M icroRNA-133b-5p通過靶向調(diào)控Fas基因影響 H9c2心肌細(xì)胞凋亡

程 潔，何淑芳，韓正怡，朱海娟，張 野

目 的研 究 microRNA（miR）-133b-5p在 H9c2心 肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用及其靶向調(diào)控 Fas基因的機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大鼠 H9c2胚胎心肌細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、miR-133b-5p抑制劑組、抑制劑陰性對(duì)照組。分別轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，實(shí)時(shí) 熒 光定量 PCR（qRT-PCR）檢測(cè) miR-133b-5p表達(dá)，微板法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性，Annexin V-FITC聯(lián)合 PI雙 染流式細(xì) 胞 術(shù) 檢 測(cè) 細(xì) 胞 凋亡。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證 miR-133b-5p與 FasmRNA的 3′UTR區(qū)的靶向結(jié)合。最后運(yùn)用 qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)各組 FasmRNA與 Fas蛋白表達(dá)水平。結(jié)果miR-133b-5p抑制劑組細(xì)胞內(nèi) miR-133b-5p表達(dá)水平下調(diào)至空白對(duì)照組的 33%（P＜0.05）；LDH活性升高，細(xì)胞凋亡率增加，均明顯高于空白對(duì)照組與抑制劑陰性對(duì)照組（P＜0.05）。雙熒光素酶報(bào)告基因證 明 Fas是 miR-133b-5p的一個(gè)靶基因；miR-133b-5p inhibitor顯著上調(diào) FasmRNA和 Fas蛋白水平 （P＜0.05）。結(jié)論利 用 化 學(xué) 合 成 miR-133b-5p inhibitor抑制大鼠 H9c2心肌細(xì)胞中 miR-133b-5p表達(dá)，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控靶基因 Fas表達(dá)有關(guān)。

心肌細(xì)胞；微小 RNAs；乳酸脫氫酶；凋亡；Fas

凋亡是心肌細(xì)胞的一種程序性死亡，其在心臟發(fā)育、心力衰竭、原發(fā)性高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等心臟疾病的疾病生理中發(fā)揮著重要的作用［1］。抑制心肌細(xì)胞凋亡可以減輕心肌缺血再灌注損 傷、延 緩 心 衰 等 病 理 過 程。通 過 microRNA（miRNA）芯片對(duì)比正常與心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi) miR-133b-5p明顯下調(diào)［2］。該研究擬進(jìn)一步觀察 miR-133b-5p對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)利用化學(xué)合成 miR-133b-5p inhibitor，將其轉(zhuǎn)染至大鼠 H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)，下調(diào) miR-133b-5p表達(dá)，觀察其對(duì)心肌細(xì)胞損傷和凋亡的影響。通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證 miR-133b-5p與靶基因 Fas的靶向結(jié)合，并觀察 miR-133b-5p inhibitor對(duì) FasmRNA與蛋白表達(dá)水平的影響，以探討 miR-133b-5p影響心肌細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑F12／DMEM中糖培養(yǎng)基、TRIzol總RNA提取試劑、Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑、OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基（美國 Life Technologies有限公司）；胎牛 血清、0.25%胰酶消化液（南京 Wisent生物技術(shù)有限公司）；AOMD-Q020 miRNA逆轉(zhuǎn)錄與 PCR試劑盒、U6與 miR-133b-5p引物（廣州復(fù)能基因有限公司）；mRNA RR037A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DRR820A PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；β-actin與 Fas引物（上海生工生物工程有限公司）；LDH測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；凋亡試劑盒（美國 Biouniquer公司）；Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒（美國 Promega公司）；鼠抗 βactin單克隆抗體、兔抗 Fas多克隆抗體（美國 Santa Cruz生物技術(shù)公司）；HRP標(biāo)記羊抗兔、羊抗鼠抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Tecan M1000多功能酶標(biāo)儀（瑞士 Tecan公司）；Implen P330超微量分光光度計(jì)（德國 Implen公司）；StepOne熒光定量 PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Cytomics FC 500流 式 細(xì) 胞 儀 （美 國 Beckerman Coulter有 限 公司）；CXY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；Tanon Fine Do X6全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有公司）。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)大鼠 H9c2（2-1）胚胎心肌細(xì)胞株、293T細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。心肌細(xì)胞株采用含有 10%胎牛血清 F12／DMEM中糖培養(yǎng)基、293T細(xì)胞株采用 DMEM高糖培養(yǎng)基，均于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶消化細(xì)胞，每 3 d傳代 1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。293T細(xì)胞用于雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。

1.3 m iR-133b-5p m im ic、inhibitor的合成與轉(zhuǎn)染

1.3.1miR-133b-5p inhibitor的合成與心肌 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 miR-133b-5p inhibitor的 序 列 為 5′-ACUUGGUUCCGUUUGACCAGC-3′，為成熟 miR-133b-5p的反義 序 列；miR-133b-5p inhibitor-NC的 序 列 為 5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′，該 序 列 和 所 有的哺乳動(dòng)物都沒有同源性，因此沒有功能。所有RNA片段委托上海吉瑪有限公司合成。轉(zhuǎn)染前1 d消化制備細(xì)胞懸液，以 4×104個(gè)／孔接種于 6孔板中。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至約 40% ～50%的細(xì)胞融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所 有 步 驟 按 Lipofectamine RNAiMAX操 作手冊(cè) 進(jìn) 行，miR-133b-5p inhibitor轉(zhuǎn) 染 濃 度 為 30 nmol／L。實(shí)驗(yàn)分成空白對(duì)照組 （只加 Lipofectamine RNAiMAX）、miR-133b-5p抑 制 劑 組 （轉(zhuǎn) 染 miR-133b-5p inhibitor）、抑制劑 陰性對(duì) 照組 （轉(zhuǎn) 染 miR-133b-5p inhibitor-NC）。

1.3.2miR-133b-5p mimic的合成與 293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 miR-133b-5p mimic的 序 列 為 5′-GCUGGUCAAACGGAACCAAGU-3′，為 成 熟 miR-133b-5p序列；miR-133b-5p mimic-NC的 序 列 與 miR-133b-5p inhibitor-NC的序列相同。細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法同前。

1.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RNA表達(dá)水平

1.4.1miR-133b-5p表達(dá)水平檢測(cè) 各組于轉(zhuǎn)染 48 h后收集細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總 RNA，紫外分光光度計(jì)定量 RNA樣品。以每 10μl逆轉(zhuǎn)錄體系加入1 000 ng總 RNA，根據(jù)復(fù)能基因 AOMD-Q020 miRNA試劑盒說明書，采用 POLY A加尾法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。得到的 cDNA 5倍稀釋后以 U6為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s（40個(gè)循環(huán)）；反應(yīng)結(jié)束建立熔解曲線。用 2-ΔΔCt計(jì)算 miR-133b-5p的相對(duì) 含量。其 中U6（貨 號(hào)：RmiRQP9003）和 miR-133b-5p（貨 號(hào)：RmiRQP3012）引物均委托廣州復(fù)能基因有限公司設(shè)計(jì)合成。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.4.2FasmRNA表達(dá)水平檢測(cè) 同樣方法收集并定量 RNA后，以每 10μl逆轉(zhuǎn)錄體系加入 500 ng總 RNA，根據(jù) TaKaRa RR037A逆轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 得 到 相 應(yīng) 的 cDNA。β-actin上 游 引 物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下 游 引 物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；Fas上游引物：5′-GTTGGAAAGAACCGAAGGACAA-3′，下游引物 5′-CC TCAAAGTAGGCACAGGATGT-3′。以 β-actin為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量 PCR，反應(yīng)條件為，95℃預(yù)變性 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s（40個(gè)循環(huán)）；反應(yīng)結(jié)束建立熔解曲線。用 2-ΔΔCt計(jì)算 Fas的相對(duì)含量。每組 3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.5 微板法檢測(cè)LDH活性轉(zhuǎn)染 48 h后吸取各孔培養(yǎng)基上清液，100μl／孔。根據(jù)說明書依次加樣后，酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm處吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算出 LDH活性。每組至少 3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù) 3次。

1.6 Annexin V／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌凋亡

轉(zhuǎn)染 48 h后用胰酶消化收集細(xì)胞。用 PBS洗滌細(xì)胞兩次（800 rpm離心 5min），收集約 3×105個(gè)細(xì)胞。用 500μl Annexin V binding buffer懸浮細(xì)胞后，加入 1.2μl Annexin V-FITC和 3μl PI，混勻。避光，室溫反應(yīng) 10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V+／PI-為凋亡細(xì)胞。每組 3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)將含有 miR-133b-5p預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的 Fas基因 3′UTR全長(zhǎng)序列擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入 PmirGLO表達(dá)載體（Fas-wt），并針對(duì)軟件預(yù)測(cè)的 miR-133b-5p與 Fas基因的靶結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變（Fas-mut），然后利用 Lipofectamine將報(bào)告質(zhì)粒 和 miR-133b-5p mimic或 其 陰 性 對(duì) 照 （miR mimic-NC）共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞。Fas-wt及 Fas-mut轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別分為空白對(duì)照組、miR-133b-5p mimic組及 mimic陰性對(duì)照組，每組 3個(gè) 復(fù) 孔。培 養(yǎng) 48 h后，按照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書操作，Tecan M1000多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶的活性。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值／海腎熒光素酶活性值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 W estern blot檢測(cè)Fas蛋白水平轉(zhuǎn)染 48 h后胰酶消化收集細(xì)胞，加入 RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃12 000 r／min離心 30 min，收集上清液。BCA法測(cè)定各組蛋白濃度。蛋白樣品以1∶1加入蛋白上樣緩沖液，混勻后 100℃ 5 min進(jìn)行蛋白變性。取 30μg蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉 1 h后，加入 βactin或 Fas的一抗，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000稀釋），室溫孵育 1 h。TBST洗膜3次后進(jìn)行 ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色，Tanon Fine Do X6全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)采集圖像。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以 ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 m iR-133b-5p inhibitor顯著下調(diào)H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)m iR-133b-5p表達(dá)miR-133b-5p抑 制 劑 組miR-133b-5p相對(duì)表達(dá)水平為（0.33±0.17），明顯低于空白對(duì)照組（1.00±0.17）（P＜0.05），提示抑制劑轉(zhuǎn)染成功，可特異性抑制心肌細(xì)胞內(nèi) miR-133b-5p表達(dá)。相反，抑制劑陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組miR-133b-5p表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 熒光定量 PCR比較各組中 m iR-133b-5p水平A：空白對(duì) 照組；B：miR-133b-5p抑制 劑組；C：抑制劑 陰性 對(duì)照組；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05

2.2 m iR-133b-5p inhibitor對(duì)H9c2心肌細(xì)胞LDH活性的影響與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 miR-133b-5p inhibitor后，心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH活性明顯升高（F=11.000，P＜0.05），提示心肌細(xì)胞受損。相反，轉(zhuǎn)染 miR inhibitor-NC對(duì)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH活性無明顯影響。見圖2。

圖2 m iR-133b-5p inhibitor對(duì) H9c2心肌細(xì)胞 LDH釋放水平的影響A：空白對(duì) 照組；B：miR-133b-5p抑制 劑組；C：抑制劑 陰性 對(duì)照組；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05

2.3 m iR-133b-5p inhibitor對(duì)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響Annexin V／PI雙染流式檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，miR-133b-5p抑制劑組細(xì)胞 Annexin V+／PI-區(qū) 細(xì)胞 明 顯 增 多 （F= 6.945，P＜0.05），提示細(xì)胞凋亡增加。相反，抑制劑陰性對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡無明顯變化。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) m iR-133b-5p inhibitor對(duì)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響A：空白對(duì) 照組；B：miR-133b-5p抑制 劑組；C：抑制劑 陰性 對(duì)照組；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05

2.4 m iR-133b-5p靶向結(jié)合Fas基因3′UTR包含 miR-133b-5p結(jié)合位點(diǎn)的 FasmRNA 3′UTR序列（Fas-wt）或其結(jié)合位點(diǎn) 突 變 體 （Fas-mut）pmirGLO報(bào)告質(zhì)粒，被克隆至熒光素酶報(bào)告基因載體下游（圖4A）。在 Fas-wt細(xì)胞株中，共轉(zhuǎn)染 miR-133b-5p mimic可抑制 Fas基因熒光素酶活性，與空白對(duì)照組及 mimic陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 139.999，P＜0.05）。而在 Fas-mut細(xì)胞株中，共轉(zhuǎn)染 miR-133b-5p mimic對(duì) Fas基因熒光素酶活性無明顯影響，與空白對(duì)照組及 mimic陰性對(duì)照組相比無明顯差異（F=0.599），見圖4B。說明 miR-133b-5p是通過靶向結(jié)合 Fas基因的 3′UTR來調(diào)節(jié)其表達(dá)。

圖4 miR-133b-5p靶向結(jié)合 Fas基因 3′UTRA：熒光素酶報(bào)告載體中插入野生型 Fas 3′UTR端（wt）或 miR-133b-5p結(jié)合位點(diǎn)突變的 Fas 3′UTR端（mut）；B：野生型 （Fas-wt）與突變型（Fas-mut）報(bào)告 載體 分別與 空白 載體、miR-133b-5p mimic或mimic陰性 對(duì) 照 共 轉(zhuǎn) 染 293T細(xì) 胞；1：空 白 對(duì) 照 組；2：miR-133b-5p mimic組；3：mimic陰性對(duì)照組；與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05

2.5 m iR-133b-5p inhibitor對(duì)H9c2心肌細(xì)胞Fas m RNA和Fas蛋白水平的影響qRT-PCR檢測(cè) Fas mRNA水平顯 示，與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 miR-133b-5p inhibitor后，細(xì)胞內(nèi) FasmRNA表達(dá)水平升高（F=5.091，P＜0.05），見圖5A。同 時(shí)，Western blot結(jié)果顯示 miR-133b-5p抑制劑組細(xì)胞內(nèi) Fas蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組（F=9.019，P＜0.05），見圖5B；提示 miR-133b-5p在 mRNA和蛋白水平調(diào)控 Fas表達(dá)。相反，轉(zhuǎn)染 miR inhibitor-NC對(duì)FasmRNA和蛋白水平均無明顯影響。

3 討論

圖5 m iR-133b-5p inhibitor對(duì) Fasm RNA和 Fas蛋白水平的影響1：空白對(duì)照組；2：miR-133b-5p抑制劑組；3：抑制劑陰性對(duì)照組；A：以 β-actin為內(nèi)參，qRT-PCR分析 FasmRNA表達(dá)；B：以 β-actin為內(nèi)參，Western blot分 析 Fas蛋 白 表 達(dá)；與 空 白 對(duì) 照 組 比 較：*P＜0.05

miRNA是一類小分子非編碼單鏈 RNA，通常只有 18～24個(gè)堿基，通過與靶基因 3′UTR區(qū)域的結(jié)合，以降解靶基因 mRNA或者抑制靶基因翻譯兩種方式達(dá)到基因沉默效應(yīng)［3-4］。miRNA幾乎參與調(diào)控人類生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，據(jù)預(yù)測(cè)，人類可能有超過90%基因受到 miRNA的調(diào)控［4］。miRNA可通過其下游的靶基因和信號(hào)通路，調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡過程［5］，從而使 miRNA成為臨床治療和預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的靶標(biāo)之一。

在細(xì)胞內(nèi)有效地抑制目的 miRNA表達(dá)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染寡核苷酸是一種簡(jiǎn)便有效的方法。miRNA inhibitor通過特異性地與成熟 miRNA分子結(jié)合而抑制其作用，削弱細(xì)胞中 miRNA導(dǎo)致的基因沉默效應(yīng)［5］。本實(shí)驗(yàn)采用的 miR-133b-5p inhibitor為 2′-甲氧修飾的 RNA寡核酸設(shè)計(jì)，可以有效抑制內(nèi)源性成熟 miRNA的功能。利用 RNA特異性轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine RNAiMAX，進(jìn) 一 步 提高 了 細(xì) 胞轉(zhuǎn) 染 效率。轉(zhuǎn)染 48 h后利用 qRT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)miR-133b-5p表達(dá)，驗(yàn)證了抑制劑轉(zhuǎn)染成功。

miR-133家族主要包括 miR-133a和 miR-133b，其中 miR-133a已被證實(shí)是一種重要的抗心肌細(xì)胞凋亡 miRNA，其可能通過靶向抑制 caspase-9抑制心肌細(xì)胞 凋 亡［6-7］。 研 究 表明，miR-133a可 以 靶 向 調(diào)控 cyclinD2，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖［8］；在主動(dòng)脈結(jié)扎和異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大模型中，miR-133a可以發(fā)揮抑制心肌纖維化、改善電生理作用［9］；miR-133a的敲除會(huì)導(dǎo)致鼠發(fā)生室間隔缺損、擴(kuò)張性心肌病［8］。miR-133b與 miR-133a具 有高度 同源性，可能有類似生物學(xué)功能，兩者在心肌梗死后心肌組織中表達(dá)均顯著降低［10］。然而 miR-133b在心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮何種作用仍不明確，其作用機(jī)制尚待闡明。miR-133b-5p是 miR-133b前體自 5′端臂加工得到的 成 熟 體。本 研 究 中，利 用 miR-inhibitor下 調(diào)H9c2心肌細(xì)胞內(nèi) miR-133b-5p表達(dá)，導(dǎo)致 LDH活性升高，細(xì)胞凋亡率增加，提示 miR-133b-5p表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和凋亡。因而，miR-133b-5p在心肌細(xì)胞中可能有抗損傷和凋亡的作用，維持或上調(diào) miR-133b-5p表達(dá)可能有利于心肌細(xì)胞生存。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用生物信息學(xué)分析與雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí) Fas是 miR-133b-5p的直接靶基因之一，而且miR-133b-5p inhibitor可顯著上調(diào) FasmRNA和 Fas蛋白表達(dá)。miRNA作用于靶基因的方式主要有兩種：一種是使靶基因 mRNA降解，另一種是抑制靶基因 mRNA翻譯［3］?；诒緦?shí)驗(yàn) 結(jié)果，推測(cè) miR-133b-5p可能是通過前一種方式作用于其靶基因Fas發(fā)揮作用。Fas是一種分子量為 48 ku的跨膜糖蛋白，其與 FasL結(jié)合后介導(dǎo)的凋亡通路是經(jīng)典的凋亡 途 徑 之 一［11］。 Fas／FasL 激 活 后，級(jí) 聯(lián) 激 活caspase-8、caspase-3、6、7、9等，作用于線粒體或者轉(zhuǎn)錄因子，最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生［12］。在心肌細(xì)胞中下調(diào)Fas可以 有效減輕心肌細(xì)胞 凋 亡［13］。因 此，推 測(cè)miR-133b-5p inhibitor下調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi) miR-133b-5p表達(dá)，并且可能通過上調(diào) FasmRNA和 Fas蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)活化 Fas／FasL信號(hào)通路，致使心肌細(xì)胞發(fā)生損傷和凋亡。

綜上所述，利用 miR-133b-5p inhibitor抑制大鼠H9c2心肌細(xì)胞中 miR-133b-5p表達(dá)水平，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和凋亡，其機(jī)制可能是通過在 mRNA和蛋白水平調(diào)控 Fas表達(dá)，誘導(dǎo)活化 Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)。為進(jìn)一步探討 miR-133b-5p在心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用及其機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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Effects of m icroRNA-133b-5p on cell apoptosis by targeting Fas gene in m yocardial H9c2 cells

Cheng Jie，He Shufang，Han Zhengyi，et al
（Dept of Anesthesiology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the effects ofmiR-133b-5p on cell apoptosis in H9c2 cells and the mechanisms ofwhich targeting Fas gene.Methods H9c2 cells in logarithmic phase were divided into the CON group，themiR-133b-5p inhibitor group，and themiR inhibitor-NC group.The cells in different groupswere collected after 48 h transfection to examine miR-133b-5p level by qRT-PCR.The activity of lactate dehydrogenase（LDH）in the culturemedium wasmeasured by colorimetric kit.Cell apoptosis was determined by flow cytometry after Annexin V／PIdouble staining.Dual luciferase reporter assay was performed to confirm the direct regulation ofmiR-133b-5p on the 3′UTR of target gene Fas.Finally，the levels of Fas mRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blot，respectively.Resu lts The level ofmiR-133b-5p in miR-133b-5p inhibitor group was reduced to 33%as compared with the CON group（P＜0.05）.Inhibition ofmiR-133b-5p led to elevated LDH activity and increased apoptosis rate as compared with the CON group ormiR inhibitor-NC group（P＜0.05）.Dual luciferase reporter assay results confirmed that Faswas a target gene ofmiR-133b-5p.In addition，miR-133b-5p inhibitor obviously up-regulated the levels of FasmRNA and Fas protein（P＜0.05）.Conclusion The chemically synthesized miR-133b-5p inhibitor could effectively inhibitmiR-133b-5p expression in H9c2 cells，leading to cell injury and apoptosis，and itsmechanism might involve the regulation on Fas expression.

myocytes，cardiac；microRNAs；lactate dehydrogenase；apoptosis；Fas

R 363

A

1000-1492（2016）02-0189-06

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.018.htm l

2015-11-23接收

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目 （編號(hào)：KJ2014ZD16）；安 徽 省 科 技 廳 年 度 重 點(diǎn) 項(xiàng) 目 （編 號(hào)：1301043030）

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，合肥 230601

程 潔，女，碩士研究生；

張 野，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhangye_hassan＠sina.com