Survivin基因沉默抑制食管癌 Eca-109細(xì)胞的侵襲與遷移

牛朝霞，張秀芝，陳 潔，楊紅梅，王 黎，裴 瑞

Survivin基因沉默抑制食管癌 Eca-109細(xì)胞的侵襲與遷移

牛朝霞，張秀芝，陳 潔，楊紅梅，王 黎，裴 瑞

目的應(yīng)用 RNA干擾（RNAi）技術(shù)沉默食管癌細(xì)胞Eca-109內(nèi)源性 survivin的表達，探討 survivin基因在食管癌細(xì)胞侵襲與遷移過程中的作用。方法構(gòu)建靶向 survivin基因的 siRNA表達載體并借助脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞；Western blot檢測 survivin蛋白表達水平觀察基因沉默效果，同法觀察細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）和血管內(nèi)皮生長因子 （VEGF）蛋白水平的變化；Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲能力的變化，細(xì)胞劃痕實驗觀察細(xì)胞遷移能力的改變。結(jié)果與對照組相比，干擾組survivin蛋白表達水平明顯降低，抑制率可達 85%；干擾組細(xì)胞 MMP2、MMP9和 VEGF蛋白表達受到明顯抑制（P＜0.05），同時觀察到干擾組細(xì)胞的侵襲與遷移能力也明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論survivin基因與食管癌細(xì)胞的侵襲遷移潛能相關(guān)，特異性沉默 survivin基因可能通過下調(diào) MMP2、MMP9和 VEGF的表達顯著抑制食管癌細(xì)胞 Eca-109的侵襲與遷移能力。

RNA干擾；survivin；侵襲與遷移；Eca-109

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，而中國是全球食管癌高發(fā)地區(qū)之一，平均每年有數(shù)十萬人死于食管癌［1］。近年來隨著外科技術(shù)的進展和新輔助治療手段的應(yīng)用，部分患者的病情得到了相當(dāng)?shù)母纳?，但術(shù)后5年生存率依然較低，因此食管癌仍是一種預(yù)后較差的惡性疾?。?］。究其原因主要是缺乏對食管癌高侵襲性和高轉(zhuǎn)移能力的惡性生物學(xué)行為的認(rèn)識，進而缺乏針對食管癌患者有效的早期診療手段。因此，對食管癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的相關(guān)研究將有助于進一步提高食管癌患者的療效及預(yù)后。Survivin作為近年研究的熱點基因之一，其主要功能是抑制細(xì)胞凋亡、保護細(xì)胞生存，參與腫瘤血管形成，并與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)［3-4］。目前已證實 survivin基因在正常成人組織中表達甚少，而在絕大多數(shù)腫瘤組織中存在高表達，并且該基因表達與食管 癌 的 診斷、治療及預(yù)后 密 切 相 關(guān)［5］。因此，抑制 survivin基因表達將可能成為食管癌的診療新靶點，從而減少食管癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，提高患者的術(shù)后生存率。該研究利用 RNA干擾技術(shù)將設(shè)計合成好的靶向 survivin基因的 siRNA轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞Eca-109，從體外實驗中探討抑制 survivin基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響，以期獲得有意義的實驗結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人食管癌 Eca-109細(xì)胞由上海細(xì)胞生物研究所建；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco公司；脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司；引物 DNA、BamH1／HandⅢ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶均購自大連寶生物公司（中國 TaKaRa公司）；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自美國 Promega公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒均購自美國 Pierce公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程公司；Survivin和 β-actin抗體購自美國 Santa Cruze公司；干擾質(zhì)粒 pRNAT-U6.1／Neo、陰性對 照干擾質(zhì) 粒siRNA購 自 美 國 Gencript公 司；pRNAT-siRNA-survivin干擾質(zhì)粒由本室構(gòu)建；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌 Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%FBS的 RPMI1640培養(yǎng)基中，置于 37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達約 70% ～80%時，以 0.25%胰蛋白酶進行消化與傳代。

1.2.2靶向 survivin的寡核苷酸序列的設(shè)計 利用生物信息學(xué)軟件，本研究針對 survivin基因 487～505 bp的靶位點設(shè)計兩條互補的 DNA鏈，其序列分別為 5′-GATCCAGAATTTGAGGAAACTGCGCTGTGA AGCCACAGATGGGCGCAGTTTCCTCAAATTCTTTTT TA-3′和 3′-GTCTTAAACTCCTTTGACGCGACACTTC GGTGTCTACCCGCGTCAAAGGAGTTTAAGAAAAAA TTCGA-5′，兩條 DNA鏈的結(jié)構(gòu)均為 BamH1+正義序列 +莖環(huán)序列 +反義序列 +轉(zhuǎn)錄終止子 +HindⅢ，在細(xì)胞內(nèi)形成所謂的“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”。

1.2.3siRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建 載體 pRNAT-U6. 1／Neo經(jīng) BamH1和 HindⅢ雙酶切后與由公司合成的靶向 survivin的寡核苷酸退火后連接，并進行轉(zhuǎn)化、挑克隆、質(zhì)粒抽提、菌落 PCR鑒定及測序，得到針對 survivin的 siRNA表達質(zhì)粒：pRNAT-siRNA-survivin，同法構(gòu)建無關(guān)干擾陰性對照質(zhì)粒：pRNAT-siRNA-control，最后兩質(zhì)粒分別大量抽提后備用。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 待 Eca-109細(xì)胞至對數(shù)生長期即細(xì)胞生長融合度約 90%時，將干擾質(zhì)粒 pRNAT-siRNA-survivin和陰 性 對 照 質(zhì) 粒 pRNAT-siRNA-control按照 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明分別轉(zhuǎn)染 Eca-109細(xì)胞，48 h后用 G418篩選 2～3周，可見典型的抗性克隆，擴大培養(yǎng)，建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，可分 別 命 名 為 Eca-109／si-survivin和 Eca-109／sicontrol。

1.2.5Western blot檢測 survivin基因沉默效果

將對數(shù)生長期的干擾組 Eca-109／si-survivin、陰性對照組 Eca-109／si-control及未轉(zhuǎn)染空白 對照組 Eca-109細(xì)胞按蛋白抽提要求進行處置，取各組細(xì)胞0.05 mg總蛋白進行不連續(xù) SDS-聚丙烯酰胺電泳；電泳結(jié)束后，用半干石墨電轉(zhuǎn)移 2 h將分離出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，用1×PBS配制的 5%脫脂奶粉在室溫?fù)u床上封閉 1～2 h，加入鼠抗人單克隆一抗，4℃過夜孵育，洗膜，再加入相應(yīng)二抗，室溫孵育 1.5 h，再洗膜，經(jīng) ECL化學(xué)發(fā)光檢測和拍照，其中以 β-actin作為內(nèi)對照，結(jié)果通過灰度掃描從蛋白表達水平對比觀察干擾前后 survivin的不同表達。

1.2.6Western blot檢測 survivin基因沉默后對基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase-2，MMP2）、基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）及 血 管內(nèi) 皮 生 長 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表達的影響 取對數(shù)生長期的 干擾 組 Eca-109／si-survivin、陰 性 對 照 組 Eca-109／si-control及未轉(zhuǎn)染空白對照組 Eca-109細(xì)胞，參照上述 1.2.5中所述 Western blot實驗步驟分析干擾 survivin基因表達后對 MMP2、MMP9及 VEGF蛋白表達水平的影響。

1.2.7Transwell小室法體外檢測細(xì)胞侵襲能力將 Transwell小室置于 24孔培養(yǎng)板中，取 Matrigel基質(zhì)膠按1：3進行稀釋后均勻鋪于微孔濾膜的上室（50μl／孔），37℃孵育箱過夜；取對數(shù)生長期的干擾組 Eca-109／si-survivin、陰 性 對 照 組 Eca-109／sicontrol及未轉(zhuǎn)染空白對照組 Eca-109細(xì)胞，常規(guī)進行胰酶消化，調(diào) 整細(xì)胞 密度為 2.5×104個 ／ml，取200μl細(xì)胞懸液小心加入濾膜上室，并加入無血清培養(yǎng)基，然后將 800μl含 2%小牛血清的 RPMI1640加入濾膜下室，常規(guī)培養(yǎng) 36～40 h后取出濾膜，置于 10%多聚甲醛固定 10 min，進行 HE染色，隨后用棉簽輕輕擦拭掉濾膜上表面的細(xì)胞，用清水浸洗 Transwell，將其置于 24孔板中，蓋上蓋，保持潮濕，顯微鏡下計數(shù) 5個高倍視野（×200）下穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)并拍照。實驗重復(fù)2次。

1.2.8劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 將干擾組Eca-109／si-survivin、陰 性 對 照 組 Eca-109／si-control及未轉(zhuǎn)染空白對照組 Eca-109細(xì)胞分別接種于 6孔板待之長至臨近飽和，用 10μl Eppendorf Tip在細(xì)胞板上劃痕，同時將細(xì)胞洗滌 2遍；加 5%小牛血清的 RPMI1640，用倒置 Nikon顯微鏡觀察 18～24 h，24 h顯示轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最大差別，數(shù)碼相機成像；測量各組細(xì)胞任意3個部位不同傷口的寬度，計算3次實驗細(xì)胞遷移距離的平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理通過 SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選轉(zhuǎn)染 pRNAT-siRNA-survivin表達質(zhì)粒的 Eca-109細(xì)胞，分別經(jīng) G418不同質(zhì)量濃度的培養(yǎng)液進行抗性篩選，約 2周后未轉(zhuǎn)染細(xì)胞幾乎全部死亡，繼續(xù)維持抗性篩選3周后在熒光顯微鏡下觀察形成帶有綠色熒光 GFP的陽性克隆，后擴增培養(yǎng)備用，最終篩選維持質(zhì)量濃度為400 mg／L。見圖1。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pRNAT-siRNA-survivin質(zhì)粒的 Eca-109細(xì)胞形成的陽性克隆 ×100

2.2 Western blot檢測干擾后survivin蛋白的表達水平以 β-actin為內(nèi)對照，結(jié)果顯示陰性干擾對照組 Eca-109／si-control及未轉(zhuǎn)染空白 對照組 Eca-109細(xì)胞 survivin蛋白表達未明顯受到抑制，兩者比較無顯著性差異，而與兩對照組相比干擾組 Eca-109／si-survivin細(xì)胞 survivin蛋白 表 達 明顯受到 抑制，灰度掃描顯示沉默效率達 85%。見圖2。

圖2 W estern blot檢測干擾前后 survivin蛋白的表達1：Eca-109／si-survivin；2：Eca-109／si-control；3：Eca-109

2.3 W estern blot檢測沉默survivin基因?qū)ca-109細(xì)胞MM P2、MMP9及VEGF蛋白表達的影響

以 β-actin為內(nèi)參，結(jié)果顯示 Eca-109／si-control和Eca-109兩對照組細(xì)胞 MMP2、MMP9及 VEGF蛋白表達水平未明顯受抑，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而與兩對照組相比干擾組 Eca-109／si-survivin細(xì)胞MMP2、MMP9及 VEGF蛋白表達明顯降低，灰度掃描顯示下降水平達80%以上。見圖3。

圖3 Survivin基因干擾前后 Eca-109細(xì)胞 MM P2、MM P9及 VEGF蛋白的表達1：Eca-109；2：Eca-109／si-survivin；3：Eca-109／si-control

2.4 Transewell小室檢測干擾前后對Eca-109細(xì)胞侵襲能力的影響實驗中通過鏡下計數(shù)5個高倍視野腫瘤細(xì)胞從上室向下室侵襲基底膜的平均細(xì)胞數(shù)目來衡量其侵襲轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果顯示：與陰性對照組 Eca-109／si-control及空白對照組 Eca-109相比，轉(zhuǎn)染 pRNAT-siRNA-survivin的干擾組 Eca-109細(xì)胞侵襲穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=110.97，P＜0.05）。見圖4。

2.5 細(xì)胞劃痕實驗檢測干擾前后對Eca-109細(xì)胞遷移能力的影響統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：劃痕 24 h時陰性對照組細(xì)胞 Eca-109／si-control與空白對照組細(xì)胞 Eca-109均檢測到明顯的劃痕間距縮短，二者對比無顯著性差異；而干擾組細(xì)胞 Eca-109／si-survivin未檢測到明顯的劃痕間距減小，與兩對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.85，P＜0.05）。見圖5。

圖4 Survivin干擾前后各組 Eca-109細(xì)胞侵襲能力的改變及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與 Eca-109／si-survivin比較：*P＜0.05

3 討論

食管癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來隨著外科技術(shù)的發(fā)展完善，新的綜合治療手段不斷應(yīng)用于食管癌患者，但其術(shù)后 5年生存率依然較低。研究［6］表明，食管癌患者預(yù)后不良的原因很可能與微病灶的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此闡明食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因與相關(guān)機制將有利于提高患者的診斷、治療及預(yù)后。

圖5 Survivin干擾前后各組 Eca-109細(xì)胞遷移運動能力的改變及細(xì)胞遷移距離的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與 Eca-109／si-survivin組比較：*P＜0.05

在惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤血管生成與細(xì)胞外基質(zhì)被腫瘤細(xì)胞釋放的蛋白水解酶降解是中心環(huán)節(jié)。基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）成員作為 wnt／β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的下游調(diào)控因子，在腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)的不同蛋白成分促進腫瘤細(xì)胞的移動［7］。在 眾 多 刺 激 微 血 管 生 成 的 因 子 中 血 管VEGF能夠明顯誘導(dǎo)腫瘤新生毛細(xì)血管的生成，其過表達能促進血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖與遷移，導(dǎo)致血管重建，進而加速惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移潛能［8］。研究［9］提示 MMPs的高表達與腫瘤微血管生成也密切相關(guān)，二者共同作用促使腫瘤細(xì)胞穿過基底膜屏障進入血液循環(huán)向遠處浸潤轉(zhuǎn)移。RNAi技術(shù)作為近年來研究哺乳動物細(xì)胞功能基因組學(xué)的一個新工具，具有高度序列專一性，可以特異地產(chǎn)生由雙鏈 DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后特定基因沉默的效果［10］；依據(jù)該原理，針對 siRNA的 RNA干擾技術(shù)當(dāng)今已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及工程學(xué)等眾多研究領(lǐng)域中，同時也為臨床眾多惡性腫瘤尤其中晚期患者開辟了基因治療的新路徑，給患者將帶來新的希望，食管癌患者當(dāng)然也不例外。

本研究利用 RNAi和重組體技術(shù)構(gòu)建靶向 survivin基 因 的 siRNA 表 達 質(zhì) 粒 pRNAT-siRNA-survivin，并成功轉(zhuǎn)染食管癌 Eca-109細(xì)胞；通過 Western blot分析顯示干擾后 survivin蛋白表達水平較對照組明顯下調(diào)，表明 RNA干擾技術(shù)成功抑制了 Eca-109細(xì)胞的 survivin基因表達；通過 Western blot實驗結(jié)果顯示抑制 survivin基因表達后能顯著下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白 MMP2、MMP9及 VEGF的表達水平，提示 survivin基因在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，參與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

為進一步探究 survivin基因?qū)κ彻馨?Eca-109細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，又開展了 Transwell體外侵襲實驗和細(xì)胞劃痕實驗；前者可模擬反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，后者能較好地檢測腫瘤細(xì)胞的遷移能力。檢測結(jié)果顯示，與對照組相比靶向抑制 survivin基因的表達能顯著降低干擾組 Eca-109細(xì)胞的體外侵襲與遷移能力，再次證實 survivin基因在食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。

綜上所述，survivin基因在食管癌的侵襲遷移中發(fā)揮著重要作用，survivin基因有望成為食管癌患者分子靶向基因治療的新靶點，從而減少食管癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，提高患者的術(shù)后生存率。

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Survivin gene silencing inhibits the invasion and m igration of esophageal carcinoma Eca-109 cell

Niu Zhaoxia，Zhang Xiuzhi，Chen Jie，et al
（Dept of Pathophysiology，Henan Medical College，Zhengzhou 451191）

Objective To investigate the effect of survivin on Eca-109 cell invasion andmigration by silencing endogenous survivin expression by RNA interference technology.Methods A siRNA expressing vector targeting survivin was constructed and transfected into Eca-109 cells via lipofectamineTM2000 to establish stable transfection cell line；the expression level of survivin protein was detected by Western blot to observe the interference effect；the expressions ofMMP2，MMP9 and VEGF proteinswere also observed by Western blot；the changes of cell invasion and migration abilitieswere respectively detected by Transwell Matrigel invasion assay and cellwound-healing scrape assay.Results Compared with the control groups，the expression level of survivin protein was significantly reduced and the inhibition rate was85%；the expressions ofMMP2，MMP9 and VEGF proteins of survivin interference group were also distinctly surpressed（P＜0.05）；at the same time，the cell invasion andmigration abilities ofsurvivin interference group were obviously reduced（P＜0.05）.Conclusion Survivin gene expression is correlated with the invasion and migration potential of esophageal carcinoma cell；specifically silencing survivin can effectively inhibit the cell invasion and migration abilities of Eca-109 cells possibly by down-regulating the expressions of MMP2，MMP9 and VEGF proteins.

RNA interference；survivin；invasion and migration；Eca-109

R 735.1

A

1000-1492（2016）02-0185-05

時間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.016.htm l

2015-11-06接收

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目（編號：14B310002）

河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理生理學(xué)教研室，鄭州 451191

牛朝霞，女，碩士，講師，責(zé)任作 者，E-mail：nzx99＠163. com