靶向 PDGF受體-α的 RNA干擾對(duì) RPE細(xì)胞增殖和凋亡的影響

秦賢杰，彭燕一，秦 程

靶向 PDGF受體-α的 RNA干擾對(duì) RPE細(xì)胞增殖和凋亡的影響

秦賢杰，彭燕一，秦 程

目的探討針對(duì)血小板源性生長(zhǎng)因子受體-α（PDGFR-α）的 RNA干 擾 對(duì) 體 外 培 養(yǎng) 的 人 視 網(wǎng) 膜 色 素 上 皮（hRPE）細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為臨床治療增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR）提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法利用脂質(zhì)體將合成的 shRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的 hRPE細(xì)胞，MTT法檢測(cè) hRPE細(xì)胞增殖活性；RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中 PDGFR-αmRNA的表達(dá)；Western blot法 檢 測(cè) PDGFR-α蛋 白 表 達(dá) 水 平；Hoechst 33258熒光染料核染分析細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率。結(jié)果PDGFR-αshRNA作用 hRPE細(xì)胞 24～72 h后，細(xì)胞增 殖 明 顯 受 到 抑 制，呈 時(shí) 間 劑 量 效 應(yīng) （P＜0.05）；PDGFR-αshRNA作 用 hRPE細(xì) 胞 48 h后，實(shí) 驗(yàn) 組PDGFR-α基因 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率分別為（37.10±0.55）%、（50.8±1.41）%，與空白對(duì)照組（11.7± 1.11）%及陰性對(duì)照組（13.5±1.05）%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組 G1期細(xì)胞百分比分別為（64.76± 1.16）%、（75.64±0.93）%，與 空 白 對(duì) 照 組 （54.51± 1.40）%及陰性對(duì)照組（56.04±2.19）%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)DGFR-αshRNA能抑制 hRPE細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

血小板源性生長(zhǎng)因子受體-α；RNA干擾；視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；增殖；凋亡

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜 病 變 （proliferative vitreoretinopathy，PVR）是指增生的纖維膜對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層前后面的收縮、牽拉所導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離、失明的一種疾病，視網(wǎng)膜色素上皮 （retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞在纖維膜的形成、收縮過程中起著重要的作用［1］。血 小板 源 性 生 長(zhǎng) 因 子 （platelet derived growth factor，PDGF）是機(jī)體內(nèi)一種重要的促使細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的生長(zhǎng)因子。研究［2］表明，PDGF對(duì)誘發(fā) RPE細(xì)胞的增殖、移行，最終導(dǎo)致 PVR的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。玻璃體內(nèi)許多非 PDGF家族的因子均可激活 PDGF受體（PDGFR），采用中和 PDGF的方法來治療 PVR所取得的效果并不理想。因此，阻斷 PDGFR通路是預(yù)防 PVR發(fā)生的基本路徑；PDGFR由亞單位 α和 β構(gòu)成，而 PDGFR-α與 PVR的產(chǎn)生有著更強(qiáng)的相關(guān)性［3］。該實(shí)驗(yàn)通過將 PDGFR-α shRNA 轉(zhuǎn) 染 至 hRPE細(xì) 胞 內(nèi)，研 究PDGFR-αshRNA對(duì) hRPE細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為 PVR的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人視網(wǎng)膜色素上皮（human retinal pigment epithelium，hRPE）細(xì)胞（中山大學(xué)細(xì)胞庫）；澳洲胎牛血清、低糖型 DMEM 培養(yǎng)基（美國 Gibco公司）；脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen公司）；RT-PCR試劑盒 （北京天根生化科技有限公司）；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；兔抗人 PDGFR-α多克隆抗體（美國圣克魯斯生物技術(shù)公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 lgG親合 純化（北 京中杉金橋 生 物 技術(shù)有限 公司）。本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒由武漢賽晶技術(shù)有限公司提供，其 正 義 鏈：5′-CTACTACTGTTATCAGTAATG-3′，反義鏈：5′-CATTACTGATAACAGTAGTAG-3′。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) hRPE細(xì)胞采用含 10%胎牛血清的低糖 DMEM培養(yǎng)基在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 2～3 d用 0.25%的胰蛋白酶消化、傳代，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與試驗(yàn)分組 0.25%胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用不含抗素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 24 h后，細(xì)胞融合率達(dá) 60% ～70%時(shí)轉(zhuǎn)染，操作嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行，轉(zhuǎn)染 6 h后換成無抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件得出：PDGFR-αshRNA質(zhì)粒表達(dá)載體與脂質(zhì)體的比例為1μg∶2.5μl時(shí)為最佳轉(zhuǎn)染比例，PDGFR-αshRNA作用細(xì)胞的最佳濃度為 2.0μg／m l。試驗(yàn)分組：空白對(duì)照組（不含 shRNA和脂質(zhì)體）、與靶細(xì)胞基因無同源性的陰性對(duì)照組（含 NC-shRNA和脂質(zhì)體）、1.0μg／ml PDGFR-αshRNA組（含 1.0μg／m l shRNA和脂質(zhì)體）、2.0μg／ml PDGFR-αshRNA組（含 2.0μg／ml shRNA和脂質(zhì)體）。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 hRPE細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，以 5×103個(gè)／孔的密度接種于 96孔板，每組 6孔；在 37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng) 24 h，細(xì)胞融合度達(dá) 60% ～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后繼續(xù)分別培養(yǎng) 24、48、72 h，每孔加 5 g／L MTT溶液各20μl，放入培養(yǎng)箱中作用 4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入 DMSO 150μl，搖床上輕搖 10 min后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)試，在 490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（absorbance，A）值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.2.4RT-PCR法檢測(cè) PDGFR-αmRNA的表達(dá)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以 5×105個(gè)／孔的密度接種于6孔板，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，采用 TRIzol法提取相應(yīng)各組的總 RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得 cDNA用作 PCR反應(yīng)模板。PDGFR-αF：5′-GCTCAAAATGAAGATGCTGTG-3′，R：5′-CCTCCACGGTACTCCTGTCT-3′，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物長(zhǎng)度為 270 bp，PCR反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5 min；94℃，30 s，52℃，30 s；72℃，1 min，共 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 5min；產(chǎn)物經(jīng) 15 g／L瓊脂糖電泳檢測(cè)，拍照，結(jié)果用圖像處理儀分析處理，測(cè)定目的基因及內(nèi)參的灰度值。

1.2.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞中 PDGFR-α蛋白的表達(dá) 取轉(zhuǎn)染48 h的 hRPE細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入細(xì)胞裂解液刮取細(xì)胞，并超聲裂解，蛋白定量，10%SDS-PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉；加入一抗，4℃孵育過夜；加入二抗，室溫?fù)u床孵育 2 h，ECL發(fā)光、曝片。

1.2.6Hoechst33258熒光核染分析細(xì)胞凋亡 采用胰酶消化 hRPE細(xì)胞，以每孔 5×105的密度接種至 6孔板，24 h后轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用 Hoechst33258熒光染料染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察、分析。

1.2.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以每孔 5×105的密度接種至 6孔板，至60% ～70%融合時(shí)換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，使細(xì)胞周期同步化，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，消化、2 000 r／min離心 5 min并收集細(xì)胞，以預(yù)冷的 70%乙醇固定，4℃過夜，2 000 r／min離心 5 min后洗滌以PI染液重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)測(cè)量的數(shù)據(jù)資料經(jīng)W檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，計(jì)量資料以 ˉx±s表示；多組間的均數(shù)比較采用方差分析和 SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組hRPE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化轉(zhuǎn)染 48 h后，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞均生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)均勻，貼壁好，細(xì)胞數(shù)目多；1.0 μg／ml shRNA組細(xì)胞數(shù)量減少、間隙增大，出現(xiàn)脫壁、皺縮，甚至碎裂現(xiàn)象。與 1.0μg／m l shRNA組相比，2.0μg／ml shRNA組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，死亡、漂浮、碎裂細(xì)胞明顯增多。見圖1。

2.2 PDGFR-αshRNA對(duì)hRPE細(xì)胞增殖的影響

圖1 倒置顯微鏡下各組 hRPE細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài) ×200A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：1.0μg／m l shRNA組；D：2.0 μg／ml shRNA組

PDGFR-αshRNA分別作用于 hRPE細(xì)胞 24、48、 72 h，hRPE細(xì)胞的增殖均受到抑制，隨時(shí)間和劑量的增加而呈正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 238.95、224.38、1 228.75，P＜0.05）。見表 1。

表1 轉(zhuǎn)染 PDGFR-αshRNA后對(duì) hRPE細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響（n=3，ˉx±s）

2.3 hRPE細(xì)胞中PDGFR-αmRNA和蛋白的表達(dá)變化PDGFR-αshRNA作用 hRPE細(xì)胞 48 h后，PDGFR-αmRNA和蛋白在 RPE細(xì)胞中的表達(dá)隨shRNA作用濃度的增強(qiáng)呈降低趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=74.20、125.94，P＜0.05）。見 圖2、3，表2。

圖2 PDGFR-αmRNA表達(dá)

圖3 PDGFR-α蛋白表達(dá)1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：1.0μg／ml shRNA組；4：2.0 μg／ml shRNA組

表2 細(xì)胞內(nèi) PDGFR-α蛋白和 mRNA的表達(dá)（n=3，ˉx±s）

2.4 hRPE細(xì)胞凋亡的變化PDGFR-αshRNA處理 hRPE細(xì)胞 48 h，Hoechst33258染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核處出現(xiàn)致密濃染顆粒狀或團(tuán)塊狀熒光的凋亡細(xì)胞隨用藥濃度的升高而增加，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組則出現(xiàn)較少。見圖4。

圖4 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡 ×400A：空白對(duì)照組；B：陰性對(duì)照組；C：1.0μg／m l shRNA組；D：2.0 μg／ml shRNA組

2.5 PDGFR-αshRNA對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響

PDGFR-αshRNA作用 hRPE細(xì)胞 48 h后，細(xì)胞周期各時(shí)相比例及總體凋亡率發(fā)生了顯著的變化，G1期細(xì)胞比例及凋亡率顯著增加，呈劑量效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=125.49、927.55，P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度的 PDGFR-αshRNA對(duì) hRPE細(xì)胞周期和凋亡率的影響（n=3，ˉx±s）

3 討論

PDGF是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的促有絲分裂生長(zhǎng)因子，其可由多種細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，可刺激特定細(xì)胞群的分裂與增殖。研究［4］證實(shí)，PDGF是 PVR形成過程中最重要的生長(zhǎng)因子之一，PDGF能夠刺激 RPE細(xì)胞增生和遷移，還可以促進(jìn) RPE細(xì)胞表達(dá) α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），α-SMA的表達(dá)又可刺激 RPE細(xì)胞的轉(zhuǎn)型，對(duì) PVR的發(fā)生和發(fā)展起到重要作用［5］。

PVR的發(fā)生發(fā)展是多種細(xì)胞、體液因素之間相互作用的結(jié)果，RPE細(xì)胞不但是增殖膜形成和收縮的主要細(xì)胞，而且還可以產(chǎn)生趨化因子，吸引膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等參與增殖膜的形成［6］。Cassidy etal［7］發(fā)現(xiàn)，與單純患有 DR的患者比較，伴有 PVR患者 的 成 纖 維 生 長(zhǎng) 因 子 （fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）和 PDGF水平均升高。梁勇 等［8］采用免疫電鏡雙標(biāo)記法證實(shí)了 PVR增殖膜中 RPE細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是 PDGF的分泌細(xì)胞。RPE細(xì)胞可分泌PDGF，同時(shí)又含有 PDGF受體，在增生膜中 PDGF的自分泌及旁分泌作用機(jī)制對(duì) PVR的發(fā)展起到重要作用［9］，因此，通過阻斷 PDGF受體通路來抑制RPE細(xì)胞的增殖對(duì)防治 PVR有著重要的意義。李林林 等［10］發(fā)現(xiàn)，抗 PDGFR-α抗體可以抑制鐵銹誘導(dǎo)的 hRPE細(xì)胞的增殖活性。在基因治療領(lǐng)域，有學(xué)者［11］利用反義寡核苷酸技術(shù)沉默 PDGFR-α的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn) PDGFR-αASODN可以顯著抑制 RPE細(xì)胞的增生，并能誘導(dǎo)其凋亡。蔣姣姣 等［12］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 PDGFR-αASODN可以降低 PVR的發(fā)展程度，推測(cè)其可能與下調(diào)視網(wǎng)膜細(xì)胞中 PDGFR-α有關(guān)。

RNA干擾是近幾年發(fā)展起來的新興的基因阻斷技術(shù)，因其高特異性、高效性、低毒等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用 于 多 種 疾 病 的 治 療。 研 究［13］表 明 靶 向PDGF-A mRNA的 shRNA可以有效抑制 RPE細(xì)胞的增殖和移行，并能夠抑制 PVR的發(fā)生、發(fā)展。本研究首次將 PDGFR-αshRNA轉(zhuǎn)染至 hRPE，RT-PCR和 Westem blot檢測(cè)結(jié)果顯示 PDGFR-αshRNA能有效沉默 hRPE細(xì)胞中靶基因的表達(dá)，并且呈劑量效應(yīng)。MTT檢測(cè)顯示細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，呈時(shí)間濃度依賴性，可能與本實(shí)驗(yàn)沉默了 hRPE細(xì)胞中 PDGFR-α基因的表達(dá)，使靶細(xì)胞膜上相應(yīng)的受體生成減少，阻斷了 PDGF的生物學(xué)作用，導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性降低有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 PDGFR-αshRNA沉默人 RPE細(xì)胞后，細(xì)胞周期發(fā)生了改變，S期、G2／M期比例顯著降低，G1期的比列顯著增加，細(xì)胞周期表現(xiàn)出 G1期阻滯，說明 PDGFR-αshRNA可將細(xì)胞阻滯于 G1期。G1期為細(xì)胞的 DNA合成前期，細(xì)胞阻滯于 G1期，其增殖受到抑制。本研究流式細(xì)胞儀及熒光核染結(jié)果觀察到，細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高，推測(cè)其凋亡機(jī)制可能為沉默 PDGFR-α基因表達(dá)阻斷了一系列細(xì)胞信號(hào)的激活，啟動(dòng)了細(xì)胞的凋亡程序從而誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，PDGFR-αshRNA轉(zhuǎn)染于 hRPE細(xì)胞后，可以有效的抑制 RPE細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并將 RPE細(xì)胞阻滯于 G1期，為進(jìn)一步應(yīng)用 shRNA防治 PVR提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，PDGFR-αshRNA作用細(xì)胞的具體調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入的研究和探討。

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Effects of RNA interference targeting PDGF receptor-αon RPE cells proliferation and apoptosis

Qin Xianjie，Peng Yanyi，Qin Cheng
（Dept of Ophthalmology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541000）

Objective To investigate the effect of RNA interference targeting platelet-derived growth factor receptor-α（PDGFR-α）on hRPE cell proliferation and apoptosis in vitro，so thatexperimental evidence was provided for the clinical treatmentof proliferative vitreoretinopathy.Methods Retinal pigmentepithelium cellswere cultured in vitro，and shRNA which was chemically synthesized was transfected into hRPE cellmediated by cationic liposomes，the cell proliferation ability was detected by MTT；the expression of PDGFR-αmRNA of hRPE cells was detected by Reverse Transcription Polymerase Chain Response；the expression of PDGFR-αprotein was detected by Western blot；cell apoptosiswas analyzed by Hochest33258；the Flow Cytometrywas used to analyze the effectof cycle and apoptosis.Results PDGFR-αshRNA had effect on hRPE cells24～72 h，the proliferation of hRPE cellswere inhibited，and showed a time-dose response（P＜0.05）；after treated with PDGFR-αshRNA 48 h，the expression of mRNA and protein of PDGFR-αgene was significantly reduced compared with the control group and negative control group（P＜0.05）；the apoptosis rate of experimental group was（37.10±0.55）%，（50.8±1.41）%，compared with the blank control group（11.7±1.11）%and the negative control group（13.5±1.05）%，the difference was statistically significant（P＜0.05）；the percentage of G1 phase of experimental group was（64.76± 1.16）%，（75.64±0.93）%，compared with the blank control group（54.51±1.40）%and the negative control group（56.04±2.19）%，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion PDGFR-αshRNA can inhibit hRPE cells proliferation and induce apoptosis.

PDGF-αreceptor；RNA interference；retinal pigment epithelial cells；proliferation；apoptosis

R 774.1

A

1000-1492（2016）02-0180-05

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.014.htm l

2015-11-06接收

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：KY2012021）；廣西科學(xué)實(shí)

驗(yàn)中心開放課題項(xiàng)目（編號(hào)：KFJJ2011-11）

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，桂林 541000

秦賢杰，男，碩士研究生；

彭燕一，女，主 任 醫(yī) 師，碩 士 生 導(dǎo) 師，責(zé) 任 作 者，E-mail：yypeng-7＠hotmail.com