荔枝核總黃酮抑制人肝星狀細(xì)胞增殖作用機(jī)制的研究

李 彩，林麗馨，肖緒華，劉燕秀，成秋宸，董 勇，覃桂金，霍 群，盧 青，趙永忠

荔枝核總黃酮抑制人肝星狀細(xì)胞增殖作用機(jī)制的研究

李 彩1，林麗馨2，肖緒華1，劉燕秀1，成秋宸1，董 勇1，覃桂金1，霍 群3，盧 青1，趙永忠1

目的研究荔枝核總黃酮（TFL）對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的人肝星狀細(xì)胞（HSC-LX2）增殖與核因子-kB（NF-кB）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)的影響。方法體外 培 養(yǎng) HSC-LX2，TGF-β1刺激 24 h后 給 予 不 同 濃 度 的TFL（80、160、320、640、800μg／ml）干預(yù)；給藥后 24、48、72 h，用 MTT法分別檢測 TFL對(duì) HSC-LX2增殖的影響；采用半定量 PCR檢測 各組 NF-кB、α-SMA mRNA的 表達(dá)；Western blot檢測 NF-кB、α-SMA蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果MTT檢測結(jié)果顯示 TFL呈時(shí)間依賴性抑制 TGF-β1誘導(dǎo) HSC-LX2增殖，以作用 48 h最為 明 顯 ，其 半 數(shù) 抑 制 濃 度 （IC50）為 302μg／m l。TFL各劑 量 組 作 用 48 h后，HSC-LX2細(xì) 胞 中 NF-кB和 α-SMA基因和蛋 白 的表達(dá)水 平 都降 低 ，尤以 300μg／m l和 600 μg／m l藥物濃度組較明顯，與對(duì)照組比較，有顯著 性差異 （P＜0.05）。結(jié)論TFL在體外對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)的 HSC-LX2的增殖有抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制細(xì)胞中 NF-кB的表達(dá)，從而起到抗肝纖維化的作用。

荔枝核總黃酮；人肝星狀細(xì)胞；細(xì)胞增殖；NF-кB

肝纖維化是指以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）在肝臟內(nèi)過度沉積，是多種慢性肝病共有的、漸進(jìn)性的病理階段［1］。核轉(zhuǎn)錄因子-кB（nuclear factor B，NF-кB）是 一 種 有 多 向 調(diào) 節(jié)功能的蛋白質(zhì)因子，有轉(zhuǎn)錄激活功能；在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中，NF-κB不僅可以促進(jìn)肝臟的炎癥反應(yīng)，還能夠促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化，對(duì)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展起著重要的調(diào)控作用［2-3］。廣西盛產(chǎn)荔枝，荔枝核作為傳統(tǒng)中藥，在體外能夠顯著抑制 HepG2細(xì)胞、Colo320DM細(xì)胞和 SW 480細(xì)胞的增殖［4-5］。荔枝核總黃 酮 （total flavone of semen litchi，TFL）對(duì) 大鼠 肝 纖 維 化 有 較 好 的 療 效［6-7］，該 實(shí) 驗(yàn) 旨 在 探 討TFL在不同劑量和不同作用時(shí)間下對(duì)人肝星狀細(xì)胞（human hepatic stellate cell，HSC-LX2）的 增 殖 抑 制作用，以及對(duì) NF-кB、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）基因和蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器HSC-LX2購自中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司；TFL購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度 80%；培養(yǎng)基 DMEM購自美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自美國 Gemini公司；胰蛋白酶、青鏈霉素、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購自中國 Solarbio公司；TGF-β1購自美國 PeproTech公司；總 RNA提取試劑盒購自北京天根公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×PCR Master Mix購自日本 TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程公司合成；總蛋白提取試劑盒購自北京博奧森公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京碧云天公司；抗 NF-кB單克隆抗體購自美國BD公司；抗 α-SMA單克隆抗體購自英國 ABcam公司；抗 GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Western blot化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國 Thermo公司；梯度 PCR儀購自德國 Sigma公司；倒置相差顯微鏡購自日本奧林巴斯；酶標(biāo)儀購自美國伯樂公司；電泳儀購自北京六一儀器廠；凝膠成像分析儀購自上海培清公司。

1.2 方法

1.2.1轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、TFL母液的配制 10μg TGF-β1溶解于 50μl濃度為 10 mM的檸檬酸（pH 3.0），配成 0.2 mg／ml的 TGF-β1母液。TFL用 5 ml／L的DMSO溶解，配成 800μg／m l的 TFL母液，0.22μm微孔濾器過濾除菌備用，然后根據(jù)需要再稀釋成所需要的濃度。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng) HSC-LX2，用含有 10% FBS、100 U／ml的青霉素和鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基，在 5%CO2、37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80% ～90%時(shí)按1∶2～1∶4的密度傳代，每隔2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞分組及處理 共分為 5組：空白對(duì)照組（第1組）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（第2組）、低濃度 TFL組（第3組）、中濃度 TFL組（第4組）、高濃度 TFL組（第5組）。第 1組：在 DMEM培養(yǎng)基中加入終濃度為 5 ng／m l［8］的人重組 TGF-β1；第 2、3、4、5組：在第 1組的基礎(chǔ)上加入 5‰的 DMSO，再分別加入 TFL，使其終濃度為 0、150、300、600μg／ml。

1.2.4MTT法檢測 TFL對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按 2×103個(gè)／孔，接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入培養(yǎng)基 150μl，置 5%CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng) 24 h。待細(xì)胞貼壁后換液加藥，將不同濃度的 TFL（終濃度為 80、160、320、640、800μg／ml）分5個(gè)組作用于細(xì)胞，并設(shè)立空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（對(duì)照組），每組設(shè) 8個(gè)復(fù)孔，置于 5%CO2、37℃恒溫箱再培養(yǎng) 24、48、72 h后吸去上清液。每孔加入培養(yǎng)基 100μl及濃度為 5 mg／ml的 MTT 20 μl，置 5%CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng) 4 h，棄去各孔中的液體；每孔加入 DMSO 150μl，在 37℃恒溫振蕩器上震蕩 10 min，于酶標(biāo)儀單波長為 490 nm條件下測其吸光度（absorbance value，A）值。抑制率（inhibition rate，IR）（%）=（1-藥 物組 ／實(shí)驗(yàn)對(duì)照 組）× 100%。根據(jù) IR計(jì)算 TFL對(duì)細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（50%inhibition concentration，IC50）。

1.2.5半 定 量 PCR檢測 HSC-LX2中 NF-кB、α-SMA mRNA的表達(dá) ① 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以3.5×105個(gè)／皿種于10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h貼壁后，分為：空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、低濃度 TFL組、中濃度 TFL組、高濃度 TFL組，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。②用試劑盒提取細(xì)胞的總 RNA，通過分光光度計(jì)來檢測 RNA的濃度和純度，A260／A280均在 1.8～2.0，用1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測 RNA的完整性。③ 各取總 RNA 1μg，將其逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。④ 引物設(shè)計(jì)，以 β-actin為內(nèi)參，引物序列 NF-кB：F：5′-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3′，R：5′-TTTGACCTGAG GGTAAGACTTCT-3′，產(chǎn)物長度為 104 bp；α-SMA：F：5′-CTATGAGGGCTATGCCTTGCC-3′，R：5′-GCTCAGCAGTAGTAACGAAGGA-3′，產(chǎn)物長度為 122 bp；βactin F：5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，R：5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′，產(chǎn) 物 長 度 為 219 bp。⑤ PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：β-actin 94℃預(yù)變性 2 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共反應(yīng) 30個(gè)循環(huán)，72℃延伸 2 min；α-SMA 94℃預(yù)變性 2 min，94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，共反應(yīng) 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 2 min；NF-кB 94℃預(yù)變性 2 min，94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，共反應(yīng) 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 2 min。⑥ 產(chǎn)物以 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用培清 JS-780全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以待測樣品與內(nèi)參的比值做半定量分析。

1.2.6Western blot檢 測 HSC-LX2中 NF-кB、α-SMA蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同上 1.2.5①，每組樣品用預(yù)冷的 PBS洗滌 3次，加入 WIP裂解液，裂解 30 min后，4℃ 12 000 r／min離心 20 min，取上清提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDSPAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，BSA封閉 1 h，一抗（GAPDH、NF-кB和 α-SMA）4℃ 孵 育 搖 床 過 夜，TBST洗滌三遍后加相應(yīng)的二抗，室溫孵育1.5 h，洗滌，ECL顯影，Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光，以內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出每組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以 ˉx±s表示；組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TFL對(duì)TGF-β1活化的HSC-LX2增殖的影響TFL對(duì) TGF-β1活化的 HSC-LX2的增殖有抑制作用，藥物作用 24 h，抑制作用不明顯，IR為 0.9%～16.8%，此時(shí)低濃度的藥物甚至還有促進(jìn)作用，藥效還沒發(fā)揮出來；藥物作用 48 h，IR為 5.0% ～85.5%，此時(shí)有明顯的抑制作用，并且和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，藥物濃度≥160μg／m l，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藥物作用 72 h，IR為 40.8% ～88.9%，濃度≥80μg／ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1、圖1。

圖1 不同時(shí)間和濃度 TFL對(duì) HSC-LX2的抑制曲線

2.2 TFL抑制TGF-β1活化的HSC-LX2中α-SMA和NF-кBmRNA表達(dá)TGF-β1活化的 HSCLX2中，α-SMA和 NF-кB mRNA在 各 組中均有 表達(dá)，其中空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組表達(dá)較多，條帶較寬較亮，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低濃度 TFL組的表達(dá)量略低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。中濃度 TFL組和高濃度 TFL組表達(dá)明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，表達(dá)量較少，條帶較暗，α-SMA／β-actin比值差異 有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義（F=137.258，P＜0.05），NF-кB／β-actin比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.301，P＜0.05）。見圖2、3。

2.3 TFL抑制TGF-β1活化的HSC-LX2中α-SMA和NF-кB蛋白表達(dá)TGF-β1活 化 的 各 組HSC-LX2中，空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中 α-SMA和 NF-кB蛋白表達(dá)量最多，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，低濃度 TFL組的表達(dá)量略低，而中濃度 TFL組和高濃度 TFL組的表達(dá)量明顯減少，α-SMA／GAPDH和 NF-кB／GAPDH比值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.199、22.494，P＜0.05）。見表 2、圖4。

圖2 逆轉(zhuǎn)錄 PCR檢測 HSC-LX2中 α-SMA、NF-кB m RNA的表達(dá)M：DNA Marker；1：空白對(duì)照組；2：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；3：低濃度 TFL組；4：中濃度 TFL組；5：高濃度 TFL組

圖3 各組 HSC-LX2中 α-SMA和 NF-кB mRNA的表達(dá)1：空白對(duì)照組；2：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；3：低濃度 TFL組；4：中濃度 TFL組；5：高濃度 TFL組；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較：*P＜0.05；與低濃度 TFL組比較：＃P＜0.05；與中濃度 TFL組比較：＆P＜0.05

表1 TFL對(duì) TGF-β1活 化的 HSC-LX2的抑 制作 用（n=8，ˉx±s）

表2 各 組 HSC-LX2中 α-SMA和 NF-кB蛋 白的表 達(dá)（n=3，ˉx±s）

圖4 Western blot檢測 HSC-LX2中 α-SMA、NF-кB蛋白的表達(dá)1：空白對(duì)照組；2：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；3：低濃度 TFL組；4：中濃度 TFL組；5：高濃度 TFL組

3 討論

TGF-β1是目前已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的致纖維化的細(xì)胞因子之一，研究［9］表明 TGF-β1在一定濃度范圍內(nèi)顯著增強(qiáng) α2（I）膠原基因啟動(dòng)子活性，并且有劑量依賴性。肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化轉(zhuǎn)變必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)，其本質(zhì)是 ECM合成與降解失衡，導(dǎo)致 ECM在肝臟中大量沉積。HSC是過量 ECM的主要來源，其活化和增殖是肝纖維化形成與發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)受到外界刺激時(shí)，HSC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化而被激活，活化的 HSC增殖，轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá) α-SMA的肌成纖維樣細(xì)胞?，F(xiàn)普遍認(rèn)為 α-SMA是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物［10］。目前抗肝纖維化治療的策略有兩種，一是逆轉(zhuǎn)活化的 HSC，二是抑制活化的HSC增殖。但是將活化的 HSC逆轉(zhuǎn)為靜止的，幾乎是不可能的［11］，因此，抑制活化的 HSC增殖，減少HSC的數(shù)量，減少 ECM的沉積已成為肝纖維化治療的主要策略。

研究［12］表明，NF-κB在膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型中表達(dá)顯著增強(qiáng)，而在正常組織的表達(dá)量卻很少。NF-κB是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，活化的HSC可以誘導(dǎo) NF-κB表達(dá)增加，激活的 NF-κB可以使 HSC中多種炎性因子的表達(dá)增加，如細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、ICAM-1、TGF-β等，從 而 引 起 更 多 的HSC活化，產(chǎn)生過量的 ECM，而這些因子的增加又可以反過來激活 NF-κB，如此形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)［13］，加重肝纖維化。NF-κB不僅對(duì)炎癥因子的表達(dá)起著中樞性的調(diào)控作用，而且對(duì) HSC的活化增殖也起著重要作用。NF-kB通過調(diào)控炎癥因子的轉(zhuǎn)錄參與 HSC的激活［14］，并且由于 NF-κB還有抗凋亡作用［15］，能夠維持 HSC保持持續(xù)激活的狀態(tài)。這在一定程度上促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，可以通過抑制 NF-κB的活性，從而來逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

本實(shí)驗(yàn)用 5 ng／ml TGF-β1活化 HSC-LX2，所有實(shí)驗(yàn)分組在 TGF-β1一致性的基礎(chǔ)上展開。MTT實(shí)驗(yàn)表明 TFL作用 24 h，抑制作用不明顯；作用 48 h和 72 h，IR分 別為 5.0% ～85.5% 和 40.8% ～88.9%，由此來看，TFL作用 48 h和 72 h都有抑制作用，但是延長藥物作用時(shí)間，最大 IR并沒有顯著增加，由此見 IR并不是隨作用時(shí)間的延長而呈線性增加的；當(dāng)達(dá)約 85% ～89%時(shí)，基本已到平臺(tái)期。并且作用 48 h和 72 h，藥物的 IC50分別是 302μg／m l和 280μg／ml，在藥物濃度方面也并沒有很大差異。從時(shí)間和藥物濃度兩個(gè)方面來看，48 h為藥物作用的最佳時(shí)間，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物作用時(shí)間設(shè)定為 48 h，藥物濃度設(shè)定為中濃度 TFL為 300μg／ml，低濃度 TFL為 150μg／ml，高濃度 TFL為 600μg／m l。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中、高濃度的 TFL有明顯的抑制活化 HSC的增殖作用，和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，中、高濃度 TFL組的 NF-κB的基因和蛋白的表達(dá)水平顯著降低。同時(shí)也檢測到中、高濃度 TFL組的 α-SMA的表達(dá)水平較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組也顯著降低，正好驗(yàn)證了活化 HSC的數(shù)量減少。低濃度 TFL對(duì) NF-кB的表達(dá)是有影響的，不管是從基因還是蛋白水平，和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低濃度 TFL對(duì) α-SMA表達(dá)的影響很微弱，因?yàn)?α-SMA是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志物，低濃度 TFL只是抑制了活化肝星狀細(xì)胞的增殖，但是活化了的肝星狀細(xì)胞并沒有凋亡，所以表達(dá)的 α-SMA還是很高的。中濃度和高濃度的 TFL，不僅可以抑制細(xì)胞的增殖，可能還起到了促進(jìn)其凋亡的作用。TFL從基因和蛋白水平降低HSC-LX2中 NF-κB的表達(dá)，可能是 TFL抗肝纖維化的作用機(jī)制之一；但是對(duì)于 TFL是否通過 NF-κB通路來抗肝纖維化，尚未完全闡明，尤其是 NF-κB通路與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的相互關(guān)系，亟需更進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來探索和研究。

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M echanism for total flavone of semen litchi inhibiting human hepatic stellate cell proliferation

Li Cai1，Lin Lixin2，Xiao Xuhua1，et al
（1Dept of Digestive Medicine，The Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001；2Dept of Pharmacy，Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin 541002）

Objective To study the effects of total flavone of semen litchi（TFL）on transforming growth factor-β1（TGF-β1）induced human hepatic stellate cell proliferation and the expressions of nuclear factor-kB（NF-кB），αsmoothmuscle actin（α-SMA）.Methods HSC-LX2 cells were cultured in vitro，using TGF-β1stimulating 24 h，then gave different concentrations of TFL for different hours.MTTmethod was used to detect the effects of TFL on HSC-LX2 cell proliferation.RT-PCR was used to detect the expression levels of NF-кB andα-SMA mRNA.The levels of NF-кB andα-SMA proteins were detected by Western blot assay.Results MTTmethod showed that TFL could inhibit TGF-β1 induced HSC-LX2 cell proliferation in a time-dependentmanner.The effect of 48 h was the most obvious and its IC50was 302μg／ml.The expression levels of NF-кB，α-SMA mRNA and proteins were both decreased among the TFL group.Compared with Control group，the expression levelsof NF-кB，α-SMA were significantly lower in 300μg／ml and 600μg／ml drug concentration group（P＜0.05）.Conclusion In vitro，TFL may inhibit the proliferation of TGF-β1-induced HSC-LX2，so as to prevent the formation of hepatic fibrosis，whichmay be related with decreasing the expression of NF-кB.

total flavone of semen litchi；human-hepatic stellate cell；proliferation inhibition；NF-kappa B

R 575

A

1000-1492（2016）02-0171-05

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.010.htm l

2015-11-06接收

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81360659）；廣西自然科學(xué)基金（編號(hào)：2012GXNSFAA053105）

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，3桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)

學(xué)院，桂林 541001

2廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院藥劑科，桂林 541002

李 彩，女，碩士研究生；

趙永忠，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：13607736670＠163.com