新型全反式維甲酸衍生物 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對(duì)肝癌細(xì)胞株 HepG2增殖的影響

劉 慧，周 青，汪 淵

新型全反式維甲酸衍生物 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對(duì)肝癌細(xì)胞株 HepG2增殖的影響

劉 慧，周 青，汪 淵

目的研究 4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 （ATPR）對(duì)人肝癌細(xì)胞株 HepG2增殖的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。方法選取 HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，全反式維甲酸（ATRA）和 ATPR分別作用細(xì)胞，應(yīng)用 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，Western blot法檢測(cè) HepG2細(xì)胞內(nèi)周期蛋白 D（cyclinD）及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 4（CDK4）和 CDK6蛋白表達(dá)量。結(jié)果ATPR能夠顯著抑制 HepG2細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞阻滯在 G0／G1期，呈濃度與時(shí)間依賴性（P＜0.05），并且同濃度、同一處理時(shí)間下，ATPR的抑 制率更高（P＜0.05）；此外，Western blot結(jié)果顯示，ATPR較 ATRA更能顯著下調(diào) HepG2細(xì)胞中cyclinD和 CDK6蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），而 CDK4蛋白水平在各組變化均不明顯。結(jié)論同等濃度下，ATPR抑制HepG2細(xì)胞增殖的效果明顯強(qiáng)于 ATRA，其機(jī)制可能是 ATPR通過(guò)下調(diào) cyclinD和 CDK6蛋白的表達(dá)水平，造成 G0／G1期阻滯，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞株 HepG2的增殖抑制。

肝癌；HepG2細(xì)胞；全反式維甲酸；4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯；細(xì)胞周期；細(xì)胞增殖

全 反 式 維 甲 酸 （all-trans retinoic acid，ATRA）（圖1）是維生素 A的主要活性代謝物，為維甲酸類藥物的代表，可誘導(dǎo)分化多種腫瘤細(xì)胞，已被廣泛用于治療急性早幼粒細(xì)胞性白血?。?］。Sait et al［2］發(fā)現(xiàn) ATRA能上調(diào)腫瘤細(xì)胞中的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促進(jìn)腫瘤血管的生成而引起惡性增殖。此外，ATRA還可產(chǎn)生較強(qiáng)的維甲酸綜合征，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生維甲酸抵抗，限制了其在腫瘤治療中的作用［3］。因此，開(kāi)發(fā)低毒高效的新型維甲酸衍生物是必需的。4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯 （4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR）（圖2）是由本校合成的新型維甲酸衍生物，研究［4-6］表明在抑制細(xì)胞遷移與誘導(dǎo)分化和凋亡方面，ATPR效果明顯優(yōu)于 ATRA。然而關(guān)于 ATPR對(duì)肝癌細(xì)胞株 HepG2增殖的研究較少，相關(guān)的機(jī)制尚不清楚。該研究以肝癌細(xì)胞株 HepG2為模型，通過(guò)比較 ATRA與 ATPR對(duì)其增殖能力的影響，為新型維甲酸衍生物用于肝癌臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 ATRA結(jié)構(gòu)式

圖2 ATPR結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細(xì)胞株 HepG2購(gòu)自美國(guó) ATCC公司；ATPR由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供；ATRA、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；低 糖 DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco公司，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?；新生牛血清?gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，-20℃保存，用前 4℃融化，無(wú)需滅活；Coulter DNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó) Beckman Coulter公 司；鼠 抗 人 β-actin購(gòu) 自 美 國(guó) Santa Cruz公司；鼠抗人 cyclinD、CDK6以及兔抗人 CDK4抗體購(gòu)自上海聯(lián)世生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、羊抗兔 IgG、ECL顯色試劑盒以及 BCA定量試劑盒均購(gòu)自美國(guó) Pierce公司。ATRA、ATPR用 DMSO溶解配制成 20 mmol／L，-20℃避光保存，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至使用濃度。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞株以及細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2用含 10%新生牛血清的低糖 DMEM培養(yǎng)基，并加入青霉素 100 U／ml和鏈霉素 100μg／m l，在 37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 2～3 d換一次液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá) 80% ～90%，用 0.25%胰酶（含 0.53 mmol／L EDTA）傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法） 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以 2.5×107／L的密度接種于 96孔板，每孔200μl，邊緣孔用 200μl PBS填充。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，用 PBS輕洗 3遍，然后分別加入含有不同濃度（5、12.5、20、25、50、75、100μmol／L）的ATRA和 ATPR的培養(yǎng)液孵育 48 h，以及同一濃度（25μmol／L）ATRA和 ATPR處理不同的時(shí)間（24、48、72、96 h），并設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（DMSO），其中溶劑對(duì)照組是與最大濃度 100μmol／L藥物中所含有的 DMSO等體積，其他藥物組均將 DMSO體積補(bǔ)齊至最大體積，以消除各組溶劑體積不同所造成的干擾。指定作用時(shí)間后，每孔加入 20μl MTT，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 4～6 h。小心棄去上清液，每孔加入 100μl DMSO，37℃振動(dòng) 15 min以溶解結(jié)晶，酶 標(biāo) 儀 檢 測(cè) 570 nm 波 長(zhǎng) 吸 光 度 （optical density，OD）。每個(gè)濃度設(shè)置 6個(gè)復(fù)孔，做 3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。抑制率（%）=（對(duì)照組 OD570-試驗(yàn)組 OD570）／對(duì)照組 OD570×100%。用 SPSS 16.0計(jì)算藥 物 的 半 數(shù)抑制濃度 （half inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2細(xì)胞，接種于 6孔板，待細(xì)胞貼壁后換成無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h，使細(xì)胞周期同步化，然后用含 25μmol／L的 ATRA和 ATPR的完全培養(yǎng)液處理細(xì)胞，48 h后常規(guī)消化收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗3次后，用100μl PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為 1×106／ml。按 Coulter DNA檢測(cè)試劑盒操作，每組加入50μl固定破膜劑，反應(yīng)30 s后立即加入500 μl PI染液，室溫避光反應(yīng) 30 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)本檢測(cè) 105個(gè)細(xì)胞，重復(fù)計(jì)數(shù) 3次，由ModFIT軟件分析 G0／G1、S、G2／M期細(xì)胞比例。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 5、25μmol／L的 ATRA和 ATPR分別處理 HepG2細(xì)胞 48 h后，取出細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS洗滌 3遍，在濾紙上控干PBS，并吸去殘余 PBS。然后每組加入 200μl蛋白提取緩沖液（Tris-HCl，pH 7.14，150 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，1%Triton X-100，0.1%SDS，5 mg／ml Leupeptin，1 mmol／L PMSF），冰 上 放 置 20 min后，置冰上用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，移入 1.5 ml EP管，并反復(fù)凍融 3次（-80℃、4℃）。之后，在超速冷凍離心機(jī)中 4℃、14 000 r／min離心 30 min，吸取上清液，使用 BCA試劑盒定量，用生理鹽水調(diào)整至相同濃度后，加入等體積的 4×蛋白上樣緩沖液，煮沸 8～10 min，-80℃保存待用。等量的各組樣品用于 SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，室溫下用含 5%的脫脂奶粉封閉2 h或者4℃封閉過(guò)夜，接著將膜放入用一抗稀釋液配制的一抗中，4℃孵育過(guò)夜。經(jīng) TBST（含 0.05% Tween-20）洗滌 3遍后加入相應(yīng)濃度 HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育 2 h，用 TBST洗滌 3遍后，TBS洗滌 1遍，每遍 10 min。在暗室中將等比例混合后的 ECL試劑 A液和 B液均勻涂于膜上，X線片曝光，顯影，定影。底片掃描后使用 Quantity One軟件分析條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 ˉx±s表示；組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ATRA和ATPR對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)不同濃度的 ATRA和ATPR處理 48 h后，與細(xì)胞對(duì)照組相比，低濃度的ATRA組（5、12.5、20、25μmol／L）對(duì)細(xì)胞無(wú)抑制作用，當(dāng)作用濃度升至 50μmol／L，開(kāi)始以劑量依賴方式抑制 HepG2細(xì)胞株的增殖（FATRA=53.919，P＜0.05），而 ATPR組從低濃度到高濃度均能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈濃度依賴關(guān)系（FATPR=8 269.029，P＜0.05），見(jiàn)圖3。通過(guò) SPSS 16.0計(jì)算出 ATRA和ATPR的 IC50分別為 102.190、31.723μmol／L。隨后選取 25μmol／L藥物濃度分別作用于 HepG2細(xì)胞24、48、72、96 h，隨著藥物處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸升高。相比之下，同一處理時(shí)間下 ATPR較ATRA的抑制率更高（F24h=44.499，F(xiàn)48h=271.387，F(xiàn)72h=1 479.019，F(xiàn)96h=2 130.531，P＜0.05），見(jiàn)圖4。以上結(jié)果均提示，與同一濃度的 ATRA相比，ATPR對(duì) HepG2細(xì)胞增殖抑制作用更強(qiáng)。

圖3 不同濃度的 ATRA及 ATPR對(duì) HepG2細(xì)胞增殖的作用1：細(xì)胞對(duì)照組；2：溶劑對(duì)照組；3：5μmol／L；4：12.5μmol／L；5：20μmol／L；6：25μmol／L；7：50μmol／L；8：75μmol／L；9：100μmol／L；與細(xì)胞對(duì)照組比較：*P＜0.05

圖4 ATRA和 ATPR對(duì) HepG2細(xì)胞增殖的作用1：細(xì) 胞對(duì) 照組；2：溶 劑 對(duì) 照 組；3：ATRA 25μmol／L；4：ATPR 25 μmol／L；與細(xì)胞對(duì)照組比較：*P＜0.05；與同一時(shí)間的 ATRA組比較：＃P＜0.05

2.2 ATRA以及ATPR對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響25μmol／L ATRA和 ATPR處理 HepG2細(xì)胞 48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期顯示，與溶劑對(duì)照組相比，25μmol／L的 ATPR能夠顯著抑制 HepG2細(xì)胞增殖（P＜0.05），使 G0／G1期細(xì)胞的比例明顯增加，而 同 濃 度 的 ATRA 組 無(wú) 明 顯 作 用 （FG0／G1= 123.523，F(xiàn)S=74.587，F(xiàn)G2=63.385），見(jiàn)圖5。以上結(jié)果提示 ATPR能將 HepG2細(xì)胞周期阻滯在 G0／G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。

2.3 ATRA及ATPR對(duì)HepG2細(xì)胞中cyclinD、CDK 4和CDK 6蛋白水平的影響5、25μmol／L ATRA和 ATPR作用細(xì)胞 48 h后，與細(xì)胞對(duì)照組相比，ATPR能明顯下調(diào) cyclinD與 CDK6的水平（P＜0.05），而 ATRA 組 變 化 不 顯 著 （FcyclinD=65.190、FCDK6=65.651）。同時(shí)，CDK4蛋白的表達(dá)水平在各組中均變化不明顯（FCDK4=5.298），見(jiàn)圖6。

3 討論

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，經(jīng)治療的早期肝癌，5年生存率僅為 50%，占惡性腫瘤死亡率的第二位［7-8］。除手術(shù)切除外，藥物化療是治療肝癌的重要手段，但由于療效缺乏特異性，并且長(zhǎng)期用藥會(huì)產(chǎn)生 耐 性，從 而 影響了藥物 治 療 效 果［9］。因此，尋找高效、安全的新型抗癌藥是必要的。本實(shí)驗(yàn)室采用的 ATPR是在 ATRA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行羧基改造而成。研究［4-5，10］證實(shí)，ATPR可以有效抑制肺癌細(xì)胞株 A549、胃癌細(xì)胞株 BGC-823以及乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231的遷移。

細(xì)胞增殖是通過(guò)細(xì)胞分裂方式增加細(xì)胞數(shù)量的復(fù)雜過(guò)程，是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要特征之一。然而，當(dāng)正常細(xì)胞在多種因素的影響下，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，獲得自主生長(zhǎng)信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖，就會(huì)產(chǎn)生腫瘤［11］，肝癌的發(fā)生發(fā)展也是肝癌細(xì)胞無(wú)限增殖的結(jié)果。因此，該文主要從細(xì)胞增殖方面，研究 ATRA與新型維甲酸衍生物 ATPR對(duì)肝癌 HepG2細(xì)胞株的作用。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，ATPR從低濃度到高濃度（5～100μmol／L）均能夠抑制 HepG2細(xì)胞的增殖，有濃度依賴性和時(shí)間依賴性，抑制率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同等濃度下的 ATRA，即在相同濃度與作用時(shí)間下，ATPR抑制 HepG2細(xì)胞增殖的能力比 ATRA更強(qiáng)。

圖5 ATRA與 ATPR對(duì)肝癌 HepG2細(xì)胞周期的影響A：溶劑 對(duì)照組 ；B：ATRA 25μmol／L；C：ATPR 25μmol／L；與溶 劑對(duì) 照組 比較：*P＜0.05

圖6 ATRA和 ATPR對(duì) HepG2細(xì)胞 內(nèi) cyclinD、CDK 4和 CDK 6蛋白表達(dá)的影響1：細(xì)胞對(duì)照 組 ；2：溶 劑 對(duì) 照 組 ；3：ATRA 5μmol／L；4：ATRA 25 μmol／L；5：ATPR 5μmol／L；6：ATPR 25μmol／L；A：ATRA和 ATPR對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi) cyclinD蛋白的影響；B：ATRA和 ATPR對(duì) HepG2細(xì)胞內(nèi) CDK4和 CDK6蛋白表達(dá)的影響；與細(xì)胞對(duì)照組比較：*P＜0.05；與相同濃度的 ATRA組比較：＃P＜0.05

細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)是細(xì)胞增殖調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn)，包括細(xì)胞周期蛋白 cyclin和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 CDK的調(diào)控系統(tǒng)［11］。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，ATPR可以顯著導(dǎo)致 HepG2細(xì)胞阻滯在 G0／G1期，抑制細(xì)胞增殖，這與MTT結(jié)果是一致的。CyclinD蛋白在細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是調(diào)節(jié) G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，其可與 CDK4或CDK6形成激酶復(fù)合物，使關(guān)鍵底物 PRb磷酸化，加快釋放轉(zhuǎn)錄因子 E2F，從而加速 G1／S期轉(zhuǎn)換［11-12］。細(xì)胞周期的失控會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，從而導(dǎo)致癌癥［11，13］，因此，開(kāi)發(fā)抗癌藥物來(lái)抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程顯得尤為重要。有研究［14］表明，在食管癌細(xì)胞株EC-9706和乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231中，通過(guò)抑制 cyclinD和 CDK4的水平，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞 G0／G1期阻滯，從而抑制細(xì)胞增殖。因此，本研究檢測(cè)了 cyclinD、CDK4和 CDK6蛋白，結(jié)果顯示，經(jīng) ATPR處理48 h后的 HepG2細(xì)胞 cyclinD和 CDK6表達(dá)降低，而 CDK4蛋白水平恒定。因此，ATPR可能通過(guò)下調(diào) cylinD和 CDK6蛋白水平來(lái)減少 cyclinD和 CDK6復(fù)合物的形成，抑制細(xì)胞周期 G1向 S期轉(zhuǎn)變，致使細(xì)胞阻滯在 G0／G1期，最終實(shí)現(xiàn)對(duì) HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)研究中，ATRA較其衍生物 ATPR對(duì) cyclinD及 CDK6的抑制能力較弱，這可能與二者調(diào)節(jié)肝癌 HepG2細(xì)胞增殖方面存在不同的作用機(jī)制有關(guān)。研究［15］顯示 ATRA及其衍生物通過(guò)其核受體發(fā)揮抗癌作用，目前已發(fā)現(xiàn)兩種維甲酸受體家族：RARs和 RXRs家族，分別都有 α、β、γ3個(gè)亞型。ATRA與其衍生物通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)維甲酸受體結(jié)合后，特異性結(jié)合到靶基因調(diào)控區(qū)的維甲酸應(yīng)答元件（RARE）上，選擇性地激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡［15］。研究［5］證明 在胃癌BGC-823細(xì)胞中，ATPR較 ATRA能顯著下調(diào) RARα和 RARβ受體，導(dǎo)致 ATPR抑制 BGC-823細(xì)胞遷移的能 力 更 強(qiáng)。因 此，ATRA 與 ATPR 調(diào) 節(jié) 肝 癌HepG2細(xì)胞增殖機(jī)制的不同可能與其進(jìn)入 HepG2細(xì)胞內(nèi)結(jié)合不同的維甲酸受體有關(guān)，二者對(duì)受體調(diào)節(jié)的研究也正在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

綜上所述，在同等濃度下，新型維甲酸衍生物ATPR較 ATRA更能顯著抑制肝癌細(xì)胞株 HepG2的增殖。其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào) cyclinD和 CDK6的表達(dá)水平阻滯 HepG2細(xì)胞周期進(jìn)展，從而抑制細(xì)胞增殖，為肝癌的藥物治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，細(xì)胞增殖是一個(gè)極其復(fù)雜且受嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程，ATPR如何下調(diào) cyclinD和 CDK6的機(jī)制以及相關(guān)通路仍不清楚，有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

［1］Siddikuzzaman，Guruvayoorappan C，Berlin Grace V M.All trans retinoic acid and cancer［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，33（2）：241-9.

［2］Saito A，Sugawara A，Uruno A，et al.All-trans retinoic acid induces in vitro angiogenesis via retinoic acid receptor：possible involvement of paracrine effects ofendogenous vascular endothelialgrowth factor signaling［J］.Endocrinology，2007，148（3）：1412-23.

［3］Su Y C，Dunn P，Shih L Y，et al.Retinoic acid syndrome in patients following the treatmentof acute promyelocytic leukemiawith all-trans retinoic acid［J］.Chang Gung Med J，2009，32（5）：535-42.

［4］Fan T T，Cheng Y，Wang Y F，et al.A novel all-trans retinoid acid derivative N-（3-trifluoromethyl-phenyl）-retinamide inhibits lung adenocarcinoma A549 cell migration through down-regulating expression ofmyosin light chain kinase［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（18）：7687-92.

［5］Hu A，Yang Y，Zhang S，et al.4-Amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate inhibits themigration of BGC-823 human gastric cancer cells by downregulating the phosphorylation level of MLC II［J］.Oncol Rep，2014，32（4）：1473-80.

［6］周佳麗，顏蘊(yùn)文，江巧玲，等.全反式維甲酸及其衍生物對(duì)乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231凋亡的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（2）：154-8.

［7］Koudah S，EIMouhadi S，ArrivéL.Fibrolamellar hepatocellular carcinoma［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2012，36（1）：5-6.

［8］Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］. CA Cancer JClin，2011，61（2）：69-90.

［9］Abrams P，Marsh JW.Current approach to hepatocellular carcinoma［J］.Surg Clin North Am，2010，90（4）：803-16.

［10］王 北，顏?lái)嵨模?青，等.4-氨基-2-三氟甲基維甲酸酯對(duì)乳腺癌細(xì)胞株 MDA-MB-231遷移的影響及其可能機(jī)制［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（2）：115-9.

［11］周春燕，馮作化.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：152-4.

［12］Okayama H.Cell cycle control by anchorage signaling［J］.Cell Signal，2012，24（8）：1599-609.

［13］Lange C A，Yee D.Killing the second messenger：targeting loss of cell cycle control in endocrine-resistant breast cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2011，18（4）：C19-24.

［14］Wang H，Chen X，Chen Y，et al.Antitumor activity ofnovel chimeric peptides derived from cyclinD／CDK4 and the protein transduction domain 4［J］.Amino Acids，2013，44（2）：499-510.

［15］Soprano D R，Qin P，Soprano K J.Retinoic acid receptors and cancers［J］.Annu Rev Nutr，2004，24：201-21.

Effects of a novel all-trans retinoid acid derivative 4-am ino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on the proliferation of HepG2 cells

Liu Hui，Zhou Qing，Wang Yuan
（Dept of Biochemistry and Laboratory of Molecular Biology，AnhuiMedical University；Dept of Key Laboratory，Gene Resource Utilization for Severe Disease of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To explore the effects of4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate（ATPR）on the proliferation of human hepatocellular carcinoma（HCC）HepG2 cells and preliminarily clarify the probable mechanisms. Methods HepG2 cells were used as the research model and treated with all-trans retinoic acid（ATRA）and ATPR respectively.The viability of HepG2 cells was investigated by MTT assay.Flow cytometry was used to detect cell cycle distribution.The expression of cyclinD，cyclin-dependent kinase 4（CDK4） and CDK6 proteins in HepG2 cellswere detected by Western blot.Results ATPR significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose-and time-dependentmanner compared with cell group and arrested cells on G0／G1phase（P＜0.05）. The inhibition rate of ATPR wasmuch higher than that of ATRA at the same dose for the indicated time（P＜0.05）.In addition，Western blot results showed that ATPR down regulated the expression of cyclinD and CDK6 more dramatically than ATRA（P＜0.05），while CDK4 expression was constant in all groups.Conclusion ATPR exhibits a better inhibitory effect on HepG2 cells proliferation than ATRA.The mechanism may be partly through down regulating the expression of cyclinD and CDK6 to cause G0／G1arrest，which finally leads to growth inhibition.

hepatocellular carcinoma；HepG2 cells；all-trans retinoic acid；4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate；cell cycle；cell proliferation

R 735.7；R 966；R 34

A

1000-1492（2016）02-0156-05

時(shí)間：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.004.htm l

2015-11-17接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81272399）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：090413116）

安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、生物化學(xué)與分子生物學(xué)

教研室、安徽省 ／省部共建教育部重要遺傳病基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

劉 慧，女，碩士研究生；

汪 淵，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aydesm-1＠163.com