CIK細(xì)胞治療慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化患者對(duì)肝功能的影響研究

王永棟　張飛　王瑩　連子亮　李躍晨

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CIK細(xì)胞治療慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化患者對(duì)肝功能的影響研究

王永棟張飛王瑩連子亮李躍晨

【摘要】目的研究與觀察CIK細(xì)胞治療慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化患者對(duì)其肝功能的影響。方法收治60例慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化患者，并給予輸注CIK細(xì)胞治療。于治療前采集患者外周血，分離并培養(yǎng)、擴(kuò)增CIK細(xì)胞，最后將提純成功的細(xì)胞制成CIK制劑，通過(guò)靜脈輸液的方式回輸至患者體內(nèi)。結(jié)果CIK細(xì)胞可抑制乙肝病毒DNA復(fù)制，患者肝功能較治療前好轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)陰率達(dá)到13.33%，應(yīng)答總有效率為63.33%;患者并發(fā)癥較少，程度輕。結(jié)論CIK細(xì)胞治療慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化效果明顯，應(yīng)在臨床推廣和應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】CIK細(xì)胞;慢性HBV; DNA;陽(yáng)性;肝硬化

肝癌是我國(guó)城鄉(xiāng)居民高發(fā)的惡性消化道腫瘤之一，誘發(fā)因素多樣，其主要致病因素可分為病毒感染、黃曲霉素感染、酒精、肝硬化和亞硝酸鹽類物質(zhì)等［1］。其中，病毒感染和肝硬化占據(jù)肝癌病因的首位。肝炎病毒感染后可進(jìn)一步發(fā)展為慢性肝硬化，故研究肝炎病毒感染患者的治療方案對(duì)進(jìn)一步治療肝硬化及預(yù)防肝癌有重要意義?；颊咭蚋鞣N意外感染肝炎病毒后，若沒(méi)有得到合理的治療，可發(fā)展成為病毒性肝炎。目前臨床中常見(jiàn)的肝炎病毒可分為:甲型、乙型、丙型、丁型和戊型。其中，乙型肝炎病毒(HBV)在五類肝炎病毒中的發(fā)病率最高，乙型肝炎在世界范圍內(nèi)均有流行，對(duì)患者身體造成的損傷程度較重，危害性大。據(jù)相關(guān)醫(yī)學(xué)資料報(bào)道，至2014年，乙肝表面抗原陽(yáng)性的乙肝病毒感染者已達(dá)到全球人口的16%。我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，城鄉(xiāng)乙型肝炎病毒感染者超過(guò)總?cè)丝诘?5%～35%，而慢性病毒攜帶者的發(fā)病率則高達(dá)10%［2］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)有超過(guò)4000萬(wàn)的慢性乙肝患者，而其中的小部分患者會(huì)在數(shù)年至數(shù)十年內(nèi)發(fā)展成為病毒性肝硬化或肝癌。由于多數(shù)病毒感染者會(huì)在感染后的一定時(shí)間內(nèi)經(jīng)歷以下各個(gè)時(shí)期:肝炎病毒感染-病毒性肝炎-肝硬化-肝癌，每年因病毒性肝炎進(jìn)展為肝癌最后導(dǎo)致死亡的患者可達(dá)到40萬(wàn)［3］。因此，如何科學(xué)、合理地治療乙型肝炎陽(yáng)性肝硬化患者成為我院科研人員研究的重要任務(wù)。

1　資料與方法

1.1一般資料我院在2014年1月至2014年7月期間收治了60例慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化患者，男36例，平均年齡(51.4±1.5)歲，病程6個(gè)月～3.6年;女24例，平均年齡(48.1±2.3)歲;病程8個(gè)月～5.2年。60例患者在此次治療前曾接受藥物治療，現(xiàn)因病情不緩解、加重，特來(lái)我院繼續(xù)支持治療。

1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cytokine-induced killer，CIK)細(xì)胞的獲取與擴(kuò)增:收集患者外周血，稀釋分離，淋巴細(xì)胞，獲取單個(gè)核細(xì)胞;將細(xì)胞懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)液的上層，加入細(xì)胞因子IFN-γ 2 000 U/ml。在培養(yǎng)后的第72～96小時(shí)內(nèi)，往培養(yǎng)瓶中添加30 ml無(wú)血清培養(yǎng)液，同時(shí)加入細(xì)胞因子IL-2 1 000 U/ml。在培養(yǎng)后的1～2周內(nèi)觀察培養(yǎng)液顏色變化，適當(dāng)添加無(wú)血清培養(yǎng)液，并加入細(xì)胞因子IL-2 1 000 U/ml。在培養(yǎng)后期，檢測(cè)培養(yǎng)液有無(wú)真菌污染。最后制成CIK細(xì)胞懸濁液，靜脈輸入患者體內(nèi)。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo)不良反應(yīng)，血液生化和血常規(guī)指標(biāo)，轉(zhuǎn)陰率。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不良反應(yīng)患者在輸入CIK細(xì)胞后24～96 h內(nèi)出現(xiàn)一過(guò)性的體溫升高，肌肉酸痛、全身乏力、惡心嘔吐等不良反應(yīng)，但程度較輕，持續(xù)時(shí)間短，患者可耐受，不需藥物治療。各并發(fā)癥發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1　慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化患者經(jīng)CIK細(xì)胞治療后并發(fā)癥情況n=60，例

2.2血液生化和血常規(guī)指標(biāo)治療結(jié)束后，相關(guān)血液生物指標(biāo)顯示多數(shù)患者肝臟功能較治療前好轉(zhuǎn)。見(jiàn)表2。

表2　慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化患者經(jīng)CIK細(xì)胞治療前、后血液生化和血常規(guī)指標(biāo)對(duì)比　n=60，±s

表2　慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化患者經(jīng)CIK細(xì)胞治療前、后血液生化和血常規(guī)指標(biāo)對(duì)比　n=60，±s

指標(biāo)　治療前　治療后ALT(U)81.8±51.8　49.3±38.1 ALB(g)　33.7±6.1　39.6±5.1 TP(g)　66.7±3.6　73.6±5.5 GLO(g)　28.4±4.7　32.9±5.1 TBIL(μmol)　23.1±12.5　17.4±10.9 PLT(×109/L)　115.7±79.4　123.5±80.3 WBC(×109/L)5.5±1.3　5.8±1.2

2.3轉(zhuǎn)陰率治療后，患者應(yīng)答總有效率為76.67%，15例為完全應(yīng)答，31例為部分應(yīng)答; 8例患者體內(nèi)監(jiān)測(cè)不到HBV-DNA，轉(zhuǎn)陰率達(dá)到13.33%。

3　討論

在少數(shù)民族中，藏族人群的肝炎發(fā)病率最高，約為整體水平的26%，維族人群的發(fā)病率則低至3%，而漢族人群的發(fā)病率約為12%，處于中間水平［4］。乙型肝炎的發(fā)生還與家族聚集性有關(guān)，家族中的成員感染病毒后，其后代和家庭中的其他成員乙型肝炎發(fā)病率也隨之提高。經(jīng)過(guò)調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，該現(xiàn)象與家族中的成員同感染者密切接觸、擁有相同的飲食習(xí)慣有關(guān)。

人體感染乙肝病毒后，由于個(gè)體間的綜合情況存在差異，患者間的發(fā)病情況也有所不同。目前醫(yī)學(xué)界中乙肝感染后的發(fā)病類型可分為以下3種: (1)患者身體素質(zhì)較好，免疫系統(tǒng)完善，抗病毒能力較強(qiáng)，免疫細(xì)胞被病毒激活后識(shí)別乙肝表面抗原，攻擊、吞噬、清除已成為病毒宿主的肝細(xì)胞，身體出現(xiàn)一系列的急性炎性反應(yīng)，為急性乙肝。(2)患者免疫機(jī)能處于較低水平，能夠被病毒激活，攻擊被感染的細(xì)胞，但無(wú)力把細(xì)胞徹底清除出體外，導(dǎo)致后續(xù)反復(fù)的感染、壞死、修復(fù)、增生等一系列的慢性炎性反應(yīng)，為慢性乙肝［5］。(3)人體免疫細(xì)胞不識(shí)別乙型肝炎病毒的抗原，病毒在體內(nèi)不受到免疫攻擊，與人體共存，無(wú)任何表現(xiàn)，為病毒攜帶者［6］。

由于我國(guó)肝炎發(fā)病率較高，每年因肝炎致死的患者不少于40萬(wàn)，故肝炎后肝硬化的治療成為各界醫(yī)學(xué)人員的共同研究課題。目前，臨床中乙型肝炎的治療方針主要有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝護(hù)肝、抗纖維化等。其中，最為重要的為抗病毒治療，通過(guò)抑制病毒遺傳物質(zhì)的復(fù)制達(dá)到抑制病毒繁殖的目的［7］。而自20世紀(jì)抗病毒藥物發(fā)明以來(lái)，人類對(duì)抗病毒藥物的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用又有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。過(guò)繼免疫治療是以往治療的常用方案之一，將特異免疫性細(xì)胞或含有特異免疫功能的細(xì)胞產(chǎn)物在體外進(jìn)行加工，之后輸注到患者體內(nèi)，提高患者的免疫功能。然而由于科技條件的限制，目前尚無(wú)較好的方式提煉出含量較高、活力較好的效應(yīng)細(xì)胞。CIK細(xì)胞是國(guó)內(nèi)外用于過(guò)繼免疫治療的主力軍，在人體內(nèi)含量較少，在外周血中的含量不足10%，主要經(jīng)體外的生物擴(kuò)增技術(shù)得到，屬于T淋巴細(xì)胞。該細(xì)胞用于免疫治療的機(jī)制在于可分泌包括白細(xì)胞介素等炎性介質(zhì)在內(nèi)的多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在體內(nèi)可激活人體的免疫系統(tǒng)，從而達(dá)到免疫發(fā)揮的效果［8］。為了進(jìn)一步了解和認(rèn)識(shí)CIK細(xì)胞治療乙型肝炎的效果，我國(guó)醫(yī)學(xué)人員對(duì)CIK細(xì)胞的作用機(jī)制、臨床療效和安全性做了深入的探究和臨床試驗(yàn)。用特異性的抗原刺激CIK細(xì)胞可使其加速成熟，縮短反應(yīng)時(shí)間。并且經(jīng)過(guò)臨床人員的觀察，乙肝表面抗原刺激后的CIK細(xì)胞對(duì)健康人和乙肝病毒感染者均有較好的治療效果，其病毒殺傷力、清除率高于單純未經(jīng)致敏的CIK細(xì)胞。有學(xué)者研究利用致敏的CIK細(xì)胞在臨床中成功治愈數(shù)例乙型肝炎患者，CIK細(xì)胞的臨床療效初步得到確認(rèn)［9］。國(guó)內(nèi)代表性研究人員也將致敏后的CIK細(xì)胞與免疫球蛋白聯(lián)合應(yīng)用共同治療慢性乙肝患者，據(jù)研究結(jié)果顯示，治療后患者完全應(yīng)答率達(dá)26%，部分應(yīng)答率超過(guò)50%，表明慢性乙肝經(jīng)過(guò)CIK細(xì)胞治療可達(dá)到良好的臨床效果。同時(shí)，其他研究學(xué)者也發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞治療慢性乙肝的獨(dú)特之處，有學(xué)者將CIK細(xì)胞通過(guò)輸液的方式輸入人體內(nèi)進(jìn)行治療，療程結(jié)束后，約50%的患者血清學(xué)顯示病毒含量已明顯減少，血液中抗原提呈細(xì)胞的能力增強(qiáng)［10］。在該次實(shí)驗(yàn)中，我院研究人員CIK置于體外環(huán)境中進(jìn)行人工培養(yǎng)，目的是獲取高含量的CIK細(xì)胞，以乙肝表面抗原激活CIK，培養(yǎng)后再次注入患者的體內(nèi)。研究人員提供CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)的環(huán)境可以保證細(xì)胞在增殖過(guò)程中免受體內(nèi)微環(huán)境的影響，以免造成免疫耐受。研究人員發(fā)現(xiàn)，致敏后的CIK細(xì)胞抗病毒能力和殺傷病毒能力均較以往有所提高［11］。治療后，患者應(yīng)答總有效率為76.67%，15例為完全應(yīng)答，31例為部分應(yīng)答; 8例患者機(jī)體內(nèi)監(jiān)測(cè)不到HBV-DNA，轉(zhuǎn)陰率達(dá)到13.33%。慢性乙肝患者HBsAg水平和ALT水平顯著下降。

CIK中主要效用細(xì)胞是CD3+CD5+6，在血液中的含量極少，因此需在體外進(jìn)行培養(yǎng)。在體外條件下培養(yǎng)1個(gè)月后，細(xì)胞增殖速度發(fā)生巨大變化，增殖速度為原來(lái)的1 000倍，可獲取大量的目的細(xì)胞［12］。同時(shí)，CD3+CD8+細(xì)胞含量也發(fā)生變化，由原來(lái)的20%升高至60%～80%。在體外培養(yǎng)和培養(yǎng)后輸入患者體內(nèi)兩種途徑下，患者的效應(yīng)細(xì)胞均明顯增加。本次試驗(yàn)圍繞CIK對(duì)于慢性乙肝性肝硬化的治療進(jìn)行，結(jié)果顯示ALT、ALB、TP、GLO及TBIL指標(biāo)較治療前好轉(zhuǎn)，表明患者肝內(nèi)炎性病變好轉(zhuǎn)，而與肝臟慢性病變相關(guān)的PLT等指標(biāo)在治療前后則變化不明顯。由于患者在治療前存在個(gè)體差異，因此治療前肝功能水平可對(duì)治療后的肝功能造成一定影響，我院研究人員針對(duì)此類指標(biāo)做了深入性試驗(yàn)，結(jié)果顯示大部分患者在治療后好轉(zhuǎn)，僅小部分患者在治療后出現(xiàn)病情惡化，表明CIK細(xì)胞治療慢性乙肝性肝硬化的整體療效確切。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果顯示CIK治療后患者并發(fā)癥發(fā)生率不高，且程度較輕，表明安全性較好。

綜上所述，CIK細(xì)胞治療慢性HBV DNA陽(yáng)性肝硬化療效較好，應(yīng)在臨床推廣。

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·論著·

(收稿日期:2015－07－14)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.04.033

【中圖分類號(hào)】R 657.31

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002－7386(2016) 04－0575－03

作者單位: 055550河北省寧晉縣醫(yī)院