國槐槐角種胚細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的動力學(xué)研究

陳紅賢，于笑笑，王晨陽，張　敏，劉忠華（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

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國槐槐角種胚細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的動力學(xué)研究

陳紅賢，于笑笑，王晨陽，張敏，劉忠華
（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

摘要：對國槐Sophora japonica槐角種胚細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的動力學(xué)進行研究，在優(yōu)化細(xì)胞接種量的基礎(chǔ)上，分析測定培養(yǎng)周期內(nèi)不同培養(yǎng)階段的槐角細(xì)胞生長和培養(yǎng)基中碳源、氮源、磷源的消耗，以及細(xì)胞的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和黃酮產(chǎn)量的變化，從而了解細(xì)胞生長、營養(yǎng)消耗與次生代謝產(chǎn)物積累的基本規(guī)律，為建立結(jié)構(gòu)化動力學(xué)模型奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：①初始接種量為40.000 g·L(-1)時，最利于細(xì)胞的培養(yǎng)；②細(xì)胞的培養(yǎng)周期約為27 d，經(jīng)過27 d的培養(yǎng)，生物量和黃酮的產(chǎn)量達(dá)到最高，分別為9.733 g·L(-1)和53.566 mg·L(-1)，對細(xì)胞比生長速率和黃酮比合成速率進行分析，得出黃酮的積累和細(xì)胞的生長為部分生長偶聯(lián)型，在6～12 d呈負(fù)相關(guān)，12～33 d呈正相關(guān)；③基質(zhì)中的碳源、氮源、磷源都是在0～6 d被迅速消耗，到12 d時消耗量達(dá)到總量的80.00%以上。在氮源的吸收上，銨態(tài)氮（NH4+）先于硝態(tài)氮（NO3-）的吸收。碳源、氮源、磷源的消耗與細(xì)胞生長和產(chǎn)物的積累密切相關(guān)。圖10參25

關(guān)鍵詞：植物學(xué)；國槐槐角種胚；懸浮細(xì)胞；黃酮；動力學(xué)；基質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)

國槐Sophora japonica屬于豆科Leguminosae槐屬Sophora植物，主要分布在中國北部。其果實即槐角，槐角中含有大量黃酮類物質(zhì)，黃酮類化合物是一類在自然界廣泛分布的多酚類物質(zhì)，又稱為黃酮體、黃堿素和類黃酮［1］。研究表明［2-3］，黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗癌抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、抗菌抑菌和調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化、降血糖降血脂血清膽固醇等功能。另外，隨著食品工業(yè)的發(fā)展與消費觀念的改變，天然活性成分的保健食品成為現(xiàn)代人追逐的目標(biāo)，其中黃酮類化合物以純天然、高活性、見效快、作用廣泛等特點日益受到人們的關(guān)注［4］。目前，關(guān)于大豆異黃酮的研究報道較多，其相關(guān)食品和保健品也逐步投入市場，但其提取受大豆油脂和蛋白質(zhì)的影響，工藝復(fù)雜，成本偏高；另一方面，槐角中富含黃酮類化合物，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于200 g·kg-1［5］，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大豆中黃酮化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（約為525～986 mg·kg-1［6］），因此，用槐角代替大豆來生產(chǎn)黃酮化合物更有價值?；苯屈S酮類化合物主要包括槐角苷、染料木素、染料木苷、槐屬雙苷等［7-8］，而槐角苷是槐角黃酮的主要成分，占總提取物的27.9%和總生藥的2.2%［9］。目前，獲取這些具有極高藥用價值的黃酮產(chǎn)物，通常是從槐角中直接提取，而槐角資源的缺乏限制了黃酮作為新型藥劑的推廣。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)因為能在人工條件下合成這些天然產(chǎn)物，解決了資源缺乏這一難題，對大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)黃酮化合物具有重大的現(xiàn)實意義。利用該技術(shù)從國槐中獲得黃酮化合物的研究國內(nèi)外文獻報道較少，因此，筆者對國槐的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進行了研究。經(jīng)過前期的研究，本課題組已經(jīng)成功誘導(dǎo)出槐角種胚愈傷組織，篩選出最佳固體和液體培養(yǎng)基，獲得了穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系，并檢測出黃酮類化合物可以在愈傷組織中積累［10］。愈傷組織中黃酮的積累與初始接種量、細(xì)胞生長、基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的含量等因素存在密切關(guān)系，解析此關(guān)系將為細(xì)胞由搖瓶培養(yǎng)放大到生物反應(yīng)器培養(yǎng)提供重要的技術(shù)參數(shù)和理論依據(jù)。生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物，實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一［11］，因此，本研究在槐角種胚細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中研究了細(xì)胞的生長、黃酮的合成以及主要營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，以便了解細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)過程中的生長規(guī)律及動態(tài)變化，為提高黃酮的產(chǎn)量及細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

國槐槐角愈傷組織來自國槐種胚的誘導(dǎo)［12］，篩選生長快、分散性好的槐角愈傷組織，將其在B5固體培養(yǎng)基上繼代5次以上，獲得穩(wěn)定的愈傷組織后將其轉(zhuǎn)接到B5液體培養(yǎng)基中，在液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)。通過不斷選擇獲得分散性較好的細(xì)胞懸浮物，繼代6次后轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，建立穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系。

1.2培養(yǎng)條件

固體培養(yǎng)基為：B5 + 1.00 mg·L-12,4-D + 0.20 mg·L-16-BA，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，滅菌前pH 6.60；液體培養(yǎng)基為B5 + 2.00 mg·L-12,4-D + 0.50 mg·L-16-BA + 0.05 mg·L-1萘乙酸（NAA），蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，滅菌前pH 6.17［12-13］。培養(yǎng)基均以121℃高壓滅菌30 min。該懸浮體系在溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為110 r·min-1的搖床上全程暗培養(yǎng)，25 d繼代1次。

1.3不同接種量對懸浮細(xì)胞的處理

將獲得的分散性好且同步生長的細(xì)胞以20.00，30.00，40.00，50.00，60.00 g·L-1作為初始接種量，接種到裝液量為50.0 mL B5液體培養(yǎng)基的100.0 mL三角瓶中培養(yǎng)，26 d后收獲，以收獲時細(xì)胞的鮮質(zhì)量，干質(zhì)量和黃酮含量為依據(jù)，選擇最佳接種量。

1.4分析測定方法

1.4.1細(xì)胞生物量和生長曲線的測定以最佳接種量接種懸浮細(xì)胞到含50.0 mL B5液體培養(yǎng)基的100.0 mL三角瓶中，自接種之日起隔3 d測定1次細(xì)胞的生物量：取出搖瓶，用紗布過濾2次后收集細(xì)胞，濾液保存到干凈的無菌瓶中備用。細(xì)胞用去離子水沖洗3次后用濾紙吸干至接種時的狀態(tài)，測其鮮質(zhì)量（g），然后將材料放入烘箱中70℃恒溫烘干10 h至恒量，測其干質(zhì)量（g），重復(fù)3次·測定-1，繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.4.2黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定①標(biāo)準(zhǔn)品的處理。黃酮類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用紫外分光光度法［12］，槐角苷為標(biāo)準(zhǔn)品，261.5 nm處測定吸光度D（λ），以吸光度為橫坐標(biāo)，槐角苷濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y = 8.090 5x + 0.090 5（R2=0.998 9）。②樣品吸光度的測定。將烘干后的愈傷組織研磨，過80目篩，備用。稱取0.10 g粉末，加4.0 mL體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，室溫下超聲提取40 min。提取后離心，取上清液稀釋30倍后測定其在261.5 nm處的吸光度，重復(fù)3次·測定-1?？傸S酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)mg·g-1（x）以槐角苷計，計算公式如下：x = 30cv/1 000w。黃酮的產(chǎn)量（mg·L-1）= 20x×干質(zhì)量。其中：c為稀釋后的提取液中槐角苷的質(zhì)量濃度（mg·L-1），v為所提取槐角苷溶液的體積（mL），w為精確稱取的供試材料的質(zhì)量（g），x為計算出的黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg·g-1）。

1.4.3生長速率和比生長速率的計算生長速率是用來確定培養(yǎng)物或生物生長速度的量度。細(xì)胞培養(yǎng)過程中大多數(shù)細(xì)胞都有指數(shù)生長期，在連續(xù)培養(yǎng)過程中指數(shù)生長期可能變成很長的時期。對于此類細(xì)胞培養(yǎng)，可以用生長速率γx=dX/dt≈ΔX/Δt表示單位時間細(xì)胞數(shù)量的增加；用比生長速率μx=1/X·dX/dt≈1/X·ΔX/Δt表示單位質(zhì)量的細(xì)胞在單位時間內(nèi)所增加的細(xì)胞質(zhì)量，其中X是細(xì)胞量，t是時間。細(xì)胞的生長速率可看做是絕對生長速度，比生長速率可看成是相對生長速度。同理，黃酮的合成速率為γp=dp/dt≈Δp/Δt和比合成速率為μp=1/X·dp/dt≈1/X·Δp/Δt，其中X是細(xì)胞量，p是黃酮產(chǎn)量，t是時間。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中產(chǎn)物積累和細(xì)胞生長之間的關(guān)系可表述為產(chǎn)物比合成速率和細(xì)胞比生長速率之間的關(guān)系:μp=αμx+β，α為與生長相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)，β為與生長非相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)。

1.4.4基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的測定收集搖瓶中的培養(yǎng)液，碳源含量的測定采用蒽酮試劑法測定［14］；硝酸鹽采用水楊酸比色法測定［15］；銨根離子采用水楊酸-次氯酸鹽光度法測定；磷酸根采用鉬藍(lán)比色法測定［16］。

2　結(jié)果與分析

2.1接種量對槐角細(xì)胞培養(yǎng)的影響

2.1.1接種量對細(xì)胞生長鮮質(zhì)量的影響由圖1可知：在一定范圍內(nèi)，隨著細(xì)胞接種量的增加，收獲時細(xì)胞的鮮質(zhì)量逐漸增加，在接種量為40.00，50.00，60.00 g·L-1時，收獲時細(xì)胞鮮質(zhì)量較大，50.00 g·L-1時最大為4.68 g，接種量為60.00 g·L-1時，鮮質(zhì)量開始下降。對其進行顯著性分析發(fā)現(xiàn)接種量為40.00，50.00，60.00 g·L-1時細(xì)胞鮮質(zhì)量顯著大于接種量為20.00，30.00 g·L-1，而40.00，50.00，60.00 g·L-1之間差異并不顯著。但是，細(xì)胞鮮質(zhì)量的增長倍數(shù)并沒有隨著接種量的增大而增加，當(dāng)接種量為40.00 g·L-1時，細(xì)胞鮮質(zhì)量增長倍數(shù)達(dá)到最大的2.13倍，接種量為50.00 g·L-1時，細(xì)胞鮮質(zhì)量增長倍數(shù)也達(dá)到1.87倍。而當(dāng)接種量為60.00 g·L-1時，細(xì)胞鮮質(zhì)量增長倍數(shù)反而下降，為1.49倍。為了以較小的接種量獲得較大的生物量，使接種細(xì)胞達(dá)到最大的利用率，40.00，50.00 g·L-1的接種量為最佳接種量。

圖1　不同接種量對細(xì)胞鮮質(zhì)量的影響Figure 1　Effect of different inoculum size on cell wet weight

2.1.2接種量對細(xì)胞生長干質(zhì)量的影響分析圖2可知：在一定范圍內(nèi)，隨著細(xì)胞接種量的增加，收獲時細(xì)胞的干質(zhì)量逐漸增加，在接種量為60.00 g·L-1時，收獲時細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到最大值，為0.28 g。然后，對其干質(zhì)量進行顯著性分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種量為50.00，60.00 g·L-1時，其干質(zhì)量顯著高于接種量為20.00，30.00 g·L-1；接種量為40.00 g·L-1時，干質(zhì)量顯著高于接種量為20.00 g·L-1；但是接種量為40.00，50.00，60.00 g·L-1時，其干質(zhì)量無顯著性差異。綜合考慮，為了使接種細(xì)胞達(dá)到最大的利用率，40.00，50.00 g·L-1的接種量較好。

圖2　不同接種量對細(xì)胞干質(zhì)量的影響Figure 2　Effect of different inoculum size on cell dry weight

2.1.3接種量對細(xì)胞黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響由圖3可以知道：接種量不同，最后的黃酮化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，接種量為30.00 g·L-1時，黃酮化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為9.35 mg·g-1。對它進行方差分析得出，接種量為20.00，30.00，40.00 g·L-1時，黃酮化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，無顯著性差異；而接種量為50.00，60.00 g·L-1時，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，且顯著低于接種量為20.00，30.00，40.00 g·L-1。所以，從黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)來說，接種量為20.00，30.00，40.00 g·L-1較好。綜合以上3個方面，選擇接種量為40.00 g·L-1，收獲生物量和黃酮化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)都較高。

圖3　不同接種量對黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 3　Effect of different inoculum size on flavonoids content

2.2槐角細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長和黃酮積累的動力學(xué)分析

2.2.1細(xì)胞生長曲線和黃酮化合物合成曲線測定細(xì)胞的干質(zhì)量和黃酮的產(chǎn)量，繪制生長和合成曲線，如圖4?；苯羌?xì)胞懸浮培養(yǎng)的周期約為27 d，在1個培養(yǎng)周期內(nèi)細(xì)胞分為延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。0～6 d這一階段，細(xì)胞處于延滯期，生長緩慢，原因可能是細(xì)胞在繼代過程中轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)液中時，新培養(yǎng)基中的滲透壓較高，鹽濃度也較高，而懸浮細(xì)胞不能迅速適應(yīng)，所以此時次生代謝產(chǎn)物含量會比較高；6～27 d為細(xì)胞快速生長期，細(xì)胞生長迅速，27 d細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到最大9.733 g·L-1；27 d以后，細(xì)胞進入穩(wěn)定期。穩(wěn)定期較短，很快進入衰亡期，生物量逐漸下降，細(xì)胞開始死亡。在6～27 d這個時期黃酮化合物的產(chǎn)量隨著細(xì)胞干質(zhì)量的增加也不斷升高，27 d達(dá)到最大53.566 mg·L-1。

圖4　細(xì)胞生長和黃酮化合物合成曲線Figure 4　Growth curves of Sophora japonica embryo callus and flavonoids production

2.2.2細(xì)胞比生長速率和黃酮比合成速率國槐槐角細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中生長速率和比生長速率如圖5所示。由圖5可知：在1個培養(yǎng)周期內(nèi)國槐槐角細(xì)胞的生長速率和比生長速率變化趨勢相同，0～6 d細(xì)胞的生長速率和比生長速率較低；到對數(shù)生長期，生長速率和比生長速率有2個峰值，從第6天開始，生長速率和比生長速率迅速增加，12 d時達(dá)到第1個峰值，生長速率和比生長速率分別為0.356 g·L-1· d-1和0.067 d-1，然后在15 d生長速率和比生長速率有所下降，之后又開始逐漸上升，在24 d時上升到第2個高峰，生長速率和比生長速率分別為0.378 g·L-1·d-1和0.044 d-1，之后生長速率和比生長速率則迅速下降。

圖5　細(xì)胞生長速率和比生長速率Figure 5　Dynamic changes of cell growth rate and specific growth rate

國槐槐角細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中黃酮的合成速率和比合成速率如圖6所示。分析圖6可知：黃酮化合物的合成速率與比合成速率的變化趨勢與細(xì)胞生長規(guī)律不完全一致。在細(xì)胞生長較快的第6～12天，黃酮合成速率和比合成速率反而呈下降趨勢，可能是因為細(xì)胞經(jīng)過延緩期適應(yīng)了培養(yǎng)基的環(huán)境，次生代謝產(chǎn)物生成減少甚至不合成。在細(xì)胞生長最快的第12天黃酮合成速率和比合成速率達(dá)到最低點，合成速率和比合成速率為0.358 mg·L-1·d-1和0.067×10-3d-1。而在15 d之后黃酮合成速率和比合成速率和細(xì)胞生長規(guī)律比較相似，逐漸上升，可能是因為細(xì)胞迅速生長，基數(shù)增大，次生代謝產(chǎn)物合成逐漸增加，黃酮合成速率和比合成速率也逐漸增大，在24 d達(dá)到最高值，分別為1.662 mg·L-1·d-1和0.192×10-3d-1，之后迅速下降。

圖6　黃酮合成速率和比合成速率Figure 6　Dynamic changes of flavonoids synthesis rate and specific synthesis rate

2.2.3細(xì)胞生長和黃酮化合物積累的關(guān)系由圖5和圖6可知：細(xì)胞的比生長速率和黃酮化合物的比合成速率變化規(guī)律不完全相同，可以分為2個時期：第1個時期為6～12 d（圖7a），第2個時期為12～33 d

（圖7b）。圖7a表明：在6～12 d黃酮的比合成速率（μp）隨著槐角細(xì)胞比生長速率（μx）的增加而減少，在此期間它們之間關(guān)系可以用以下公式表示：μp=-10.633 0μx+0.743 5（R2=0.796 9）。從式可知：黃酮的積累和槐角細(xì)胞的生長呈負(fù)相關(guān)。圖7b表明：在12～33 d黃酮的比合成速率（μp）隨著槐角細(xì)胞比生長速率（μx）的增加而增加，在此期間它們之間關(guān)系可以用以下公式表示：μp=3.032 3μx+0.022 1（R2=0.950 8）。從式可知：黃酮的積累和槐角細(xì)胞的生長呈正相關(guān)。

圖7　產(chǎn)物比合成速率和細(xì)胞比生長速率的關(guān)系Figure 7 Relationship between flavonoids specific synthesis rate and cell specific growth rate of Sophora japonica embryo in suspension culture

2.3槐角細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中對營養(yǎng)物質(zhì)消耗的動態(tài)變化

2.3.1碳源的消耗碳源在國槐槐角細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中的動態(tài)變化如圖8所示。在0～6 d消耗迅速，6 d時已經(jīng)消耗了總糖的68.38%，為細(xì)胞快速增長做好了準(zhǔn)備，12 d時消耗達(dá)80.00%，12 d以后糖的消耗量減少，但質(zhì)量濃度繼續(xù)下降，細(xì)胞迅速生長。33 d糖的質(zhì)量濃度為1.803 g·L-1，整個過程共消耗了總糖的93.00%。

2.3.2氮源的消耗槐角細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮質(zhì)量濃度的動態(tài)變化如圖9所示。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的消耗并不同步，在0～6 d銨態(tài)氮被迅速利用，6 d已消耗82.37%，而硝態(tài)氮消耗量較低，為11.58%。6 d之后銨態(tài)氮質(zhì)量濃度較低時，硝態(tài)氮質(zhì)量濃度迅速下降，12 d時消耗達(dá)95.77%，基質(zhì)中的大部分氮源被消耗，而此時細(xì)胞生長速率達(dá)到第1個高峰，與氮源的消耗相符合，但是銨態(tài)氮的吸收先于硝態(tài)氮。12 d之后銨態(tài)氮和硝態(tài)氮繼續(xù)小幅下降，細(xì)胞不斷生長。基質(zhì)中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮分別在18 d和27 d基本消耗殆盡，細(xì)胞生長達(dá)到最大值。因此，可以推斷，氮素是影響國槐種胚細(xì)胞增殖的一個重要原因。

2.3.3磷源的消耗當(dāng)把細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)基后（圖10），細(xì)胞開始大量吸收磷酸根離子。在遲滯期0～6 d內(nèi)消耗了80.78%的磷，進入快速生長期以后，6～12 d磷的消耗量還是較大，第12 d磷的消耗量達(dá)92.96%，細(xì)胞生長速率也達(dá)到最大。之后磷消耗量逐漸減少，到24 d時磷已經(jīng)被消耗殆盡，細(xì)胞生長速率開始下降，可見磷源的含量與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)密切相關(guān)。

2.3.4基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗與細(xì)胞生長、黃酮積累的關(guān)系由圖8～10可知：細(xì)胞對基質(zhì)中的碳源、氮源、磷源的消耗過程大體相似。分析細(xì)胞培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的動態(tài)變化與細(xì)胞生長和黃酮積累的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：0～6 d，細(xì)胞迅速吸收營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)消耗量最大，質(zhì)量濃度迅速下降，但是吸收的營養(yǎng)物質(zhì)儲存在細(xì)胞中為細(xì)胞快速生長做準(zhǔn)備，所以細(xì)胞生長緩慢，同時處于此時期的細(xì)胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，所以細(xì)胞的比生長速率較低而黃酮的比合成速率較高；6～12 d這些營養(yǎng)物質(zhì)濃度仍然下降較快，但幅度較前6 d小，到12 d基本消耗量都達(dá)到80.00%以上，延滯期營養(yǎng)物質(zhì)的大量儲存和細(xì)胞對基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)的繼續(xù)吸收為細(xì)胞生長提供了充足的營養(yǎng)物質(zhì)，所以6～12 d細(xì)胞迅速生長，比生長速率升高，在12 d達(dá)到一個高峰，同時由于營養(yǎng)物質(zhì)充分，足夠滿足細(xì)胞快速生長，很少甚至不會產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，所以6～12 d黃酮的比合成速率下降，在12 d時達(dá)到最低點；12～15 d營養(yǎng)物質(zhì)基本被消耗掉80%，所以細(xì)胞對基質(zhì)營養(yǎng)的吸收量迅速下降，這一變化可能會暫時破壞細(xì)胞生長的平衡，進而產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，所以同12 d相比細(xì)胞比生長速率有所下降，黃酮比合成速率開始上升；15～24 d在基質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量濃度較低的情況下細(xì)胞主要依靠自身存儲的營養(yǎng)物質(zhì)來供細(xì)胞生長，且自身存儲的物質(zhì)可以滿足細(xì)胞的生長進而逐漸恢復(fù)穩(wěn)定，所以細(xì)胞的比生長速率又開始繼續(xù)上升，細(xì)胞數(shù)量迅速增加，但是在滿足細(xì)胞生長的基礎(chǔ)上細(xì)胞開始對營養(yǎng)物質(zhì)有所競爭，加上上一階段次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生會誘導(dǎo)更多的產(chǎn)物合成，所以黃酮的比合成速率也繼續(xù)上升，24 d比生長速率和比合成速率同時達(dá)到最大，但是其細(xì)胞生長速率小于12 d的第1個高峰，可能是因為營養(yǎng)物質(zhì)不如12 d充分；24 d之后，基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)基本被耗盡，細(xì)胞中儲存的也被消耗殆盡，營養(yǎng)物質(zhì)的嚴(yán)重缺乏導(dǎo)致了細(xì)胞的比生長速率和黃酮的比合成速率迅速下降。

圖8　培養(yǎng)過程中碳源的動態(tài)消耗變化Figure 8　Change of sugar contents in the medium during the cell suspension culture cycle

圖9　培養(yǎng)過程中氮源的動態(tài)消耗變化Figure 9　Change of nitrogen contents in the medium　during the cell suspension culture cycle

圖10　培養(yǎng)過程中磷源的動態(tài)消耗變化Figure 10 Change of phosphate contents in the medium during the cell suspension culture cycle

3　結(jié)論與討論

懸浮細(xì)胞分裂增殖前需要一個最低的臨界密度，可能是因為：細(xì)胞分裂啟動前，需要細(xì)胞內(nèi)一種稱為條件因子的物質(zhì)達(dá)到一定的內(nèi)源水平［17］。可通過添加條件培養(yǎng)基或者增加細(xì)胞接種量來達(dá)到這個內(nèi)源水平。細(xì)胞要維持分裂和生長，其內(nèi)源代謝物質(zhì)必須達(dá)到一定的閥值，在高密度細(xì)胞群和培養(yǎng)基營養(yǎng)充足的情況下，易于達(dá)到這個閥值［18］。如果接種量太低，則細(xì)胞懸浮液質(zhì)量濃度過低，使得細(xì)胞間的物質(zhì)交換不充分，不利于細(xì)胞的生長；細(xì)胞懸浮液的質(zhì)量濃度過高，使得細(xì)胞密度過高，單個細(xì)胞會因營養(yǎng)吸收不足而死亡，因此，對于細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，選擇合適的接種量至關(guān)重要［19］。將繼代培養(yǎng)后同步化生長的懸浮細(xì)胞以不同接種量接種于新鮮液體培養(yǎng)基中，測定細(xì)胞生長和黃酮合成的情況可為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的研究奠定基礎(chǔ)。本研究得出槐角種胚細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳接種量為40.00 g·L-1，過低或過高都不利于細(xì)胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累。Sakano［20］等曾報道過低接種量會嚴(yán)重抑制細(xì)胞的增殖，與本研究結(jié)果一致。

槐角細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的周期約為27 d，在一個培養(yǎng)周期內(nèi)細(xì)胞分為延滯期、快速生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。0～6 d為延滯期，6～27 d為快速生長期，27 d以后，細(xì)胞進入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期較短，此后很快進入衰亡期。經(jīng)過27 d的培養(yǎng)，生物量和黃酮的產(chǎn)量均達(dá)到最高。分析槐角細(xì)胞生長與黃酮積累的動力學(xué)關(guān)系，在6～12 d黃酮的比生成速率（μp）隨著槐角細(xì)胞比生長速率（μx）的增加而減少，黃酮的積累和槐角細(xì)胞的生長呈負(fù)相關(guān)；而在12～33 d黃酮的比生成速率（μp）隨著槐角細(xì)胞比生長速率（μx）的增加而增加，黃酮的積累和槐角細(xì)胞的生長呈正相關(guān)。因此，國槐槐角細(xì)胞生長和黃酮積累為部分生長偶聯(lián)型。

懸浮培養(yǎng)過程中，細(xì)胞主要靠基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)來滿足自身的生長和產(chǎn)物的合成。其中碳源主要由蔗糖提供，在細(xì)胞培養(yǎng)中糖類具有重要作用，既為細(xì)胞生長提供能量，也為初級、次級代謝物合成提供碳支架，同時對滲透壓的調(diào)節(jié)有重要作用［11］；硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是細(xì)胞生長代謝的主要氮來源，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中總氮濃度或改變銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的比例都可顯著影響細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞的生長和次生代謝物的合成［21-22］；磷源是植物細(xì)胞內(nèi)重要的營養(yǎng)成分之一，參與核苷酸、脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和蛋白質(zhì)等的形成，它的消耗量可以從一個側(cè)面反映出細(xì)胞的生長情況。因此，研究這幾種營養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)過程中的動態(tài)消耗有重要意義。在一個培養(yǎng)周期內(nèi)，分析槐角細(xì)胞和黃酮的比生長速率與基質(zhì)中主要營養(yǎng)成分的變化，對槐角細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生長狀況進行較為全面的分析，發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)成分的消耗與細(xì)胞增殖和產(chǎn)物積累的各個階段是吻合的：0～6 d，細(xì)胞處在接種初期，而接種的細(xì)胞處于繼代培養(yǎng)后期，細(xì)胞因營養(yǎng)不足而處于一種“饑餓”狀態(tài)，因此，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基以后，必將通過主動吸收和擴散等途徑快速吸收營養(yǎng)物質(zhì)［23］，所以這個時期，基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)迅速下降；6～24 d，隨著細(xì)胞的快速生長和黃酮的積累，基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)基本被消耗；24 d之后，基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)不足，細(xì)胞的增殖和黃酮的合成速率也都開始下降。由此可以推斷，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分的不足限制了細(xì)胞的細(xì)胞增長和產(chǎn)物積累，基質(zhì)中碳源氮源磷源的含量與細(xì)胞增長和產(chǎn)物積累密切相關(guān)，而且銨態(tài)氮的吸收先于硝態(tài)氮。這與前人的研究［24-25］：在植物細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝物的過程中，細(xì)胞對培養(yǎng)液營養(yǎng)成分的消耗動態(tài)直接影響細(xì)胞的生長和次生代謝物的合成相一致。該結(jié)果為進一步提高槐角細(xì)胞中黃酮的產(chǎn)量提供了營養(yǎng)成分依據(jù)：可以在國槐種胚細(xì)胞培養(yǎng)過程中采用分批添加營養(yǎng)成分的方法來提高黃酮的產(chǎn)量，如在細(xì)胞培養(yǎng)的12 d添加蔗糖、硝酸鹽，6 d時添加銨鹽和磷酸鹽，以補充培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，保持黃酮化合物以較高的速率積累。

本研究結(jié)果為提高槐角種胚懸浮細(xì)胞中黃酮的積累和后續(xù)建立結(jié)構(gòu)化動力模型提供了理論依據(jù)，同時為細(xì)胞由搖瓶培養(yǎng)放大到生物反應(yīng)器培養(yǎng)提供了技術(shù)參數(shù)。

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Kinetics of Sophora japonica embryo cells in a suspension culture system

CHEN Hongxian, YU Xiaoxiao, WANG Chenyang, ZHANG Min, LIU Zhonghua
（College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China）

Abstract:Based on the established cell suspension culture system of Sophora japonica embryos, its kinetics was investigated.The suspension cell system of S.japonica embryos influenced by inoculum size was studied with analysis during cell culture of kinetic parameters, such as cell growth; consumption of C, N, and P; as well as changes in cell fresh weight, dry weight, and flavonoid production at various stages in the culture procedure.Results revealed that.（1）the preferable inoculum size for suspension cell proliferation was 40.000 g·L(-1).（2）The cell suspension culture cycle lasted about 27 d with maximum biomass in dry weight reaching 9.733 g·L(-1)and flavonoid production attaining 53.566 mg·L(-1).Flavonoid production was semi-associated with cell growth of the S.japonica embryo being negatively related from 6-12 d and positively related from 12-33 d.（3）From 0-6 d sugar, N, and phosphate were absorbed quickly; after 12 d they were more than 80% absorbed.Also, NH4+was utilized faster than NO3-.Thus, proliferation and flavonoid production of S.japonica embryo cells was closely related to the consumption of sugar, N, and phosphate.This research could provide references for the scale-up culture of S.japonica embryos cell by bioreactor.［Ch, 10 fig.25 ref.］

Key words:botany; Sophora japonica embryo; suspension cell; flavonoids; kinetics; matrix nutrient

作者簡介：陳紅賢，從事藥用植物及其次生代謝研究。E-mail: 965600690@qq.com。通信作者：劉忠華，副教授，博士，從事植物生長發(fā)育及系統(tǒng)進化研究。E-mail: liuzh6@bjfu.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（J1103516）；北京林業(yè)大學(xué)理科生物學(xué)基地國家自然科學(xué)基金子項目（ZD008）

收稿日期：2015-05-11；修回日期：2015-06-15

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.012

中圖分類號：S718.3；Q942

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0272-08