臺(tái)東蘇鐵中葉綠體功能基因RNA編輯的分析

沈成才

(北京師范大學(xué)克拉瑪依附屬學(xué)校,新疆 克拉瑪依 834000)

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臺(tái)東蘇鐵中葉綠體功能基因RNA編輯的分析

沈成才

(北京師范大學(xué)克拉瑪依附屬學(xué)校,新疆 克拉瑪依 834000)

摘要：臺(tái)東蘇鐵是一種古老的裸子植物，有關(guān)蘇鐵的RNA編輯的研究很少。為此，我們分析了臺(tái)東蘇鐵的RNA編輯位點(diǎn)和分布，為探究RNA編輯的功能和機(jī)制以及高等植物的起源和進(jìn)化提供依據(jù)。本次以臺(tái)東蘇鐵(Cycas taitungensis)為材料，采用異硫氰酸胍法提取臺(tái)東蘇鐵總RNA。DNaseⅠ處理過(guò)的RNA 逆轉(zhuǎn)得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增條帶并測(cè)序。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果分析比對(duì)，初步確定在臺(tái)東蘇鐵中的ndhD2，PetB，ndhB2存在C-U 的編輯。研究表明，ndh基因有較高的編輯頻率，而絲氨酸相比其他氨基酸有更高的編輯頻率。結(jié)果顯示，ndhB2中有C-Y的部分編輯現(xiàn)象，ndhA2存在沉默編輯現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：臺(tái)東蘇鐵；RNA編輯；RNA 提?。划惲蚯杷犭曳?/p>

RNA編輯是指轉(zhuǎn)錄后RNA成熟過(guò)程中的堿基的插入、缺失和替換等修飾和加工的過(guò)程，使得 RNA所攜帶的遺傳信息發(fā)生改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列的改變的過(guò)程[1]。RNA編輯廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，在葉綠體、線粒體和細(xì)胞核基因中均可發(fā)生，根據(jù)編輯效率的不同可分為沉默編輯、部分編輯和完全編輯三種[2]。葉 綠 體 的 RNA 編輯在高等植物中是廣泛存在的，并在葉綠體基因的表達(dá)與調(diào)控方面起著重要的作用，是擴(kuò)展原有遺傳信息、增加基因表達(dá)調(diào)控途徑的一種有效方式[3]。RNA編輯 還能夠通過(guò)提高氨基酸的保守性來(lái)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其功能的發(fā)揮[4]。葉綠體RNA編輯具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，并受外界環(huán)境影響。目前, 已經(jīng)測(cè)定葉綠體RNA編輯位點(diǎn)的高等植物有豌豆[5]、煙草[6]、擬南芥[7]、番茄[8]、角苔[9]、鐵線蕨[10]、蝴蝶蘭[11]、黃瓜[12]、棉花[13]、小麥[14]、菠菜[15]、玉米、水稻 、甘蔗、黑麥、大麥[16]、粗山羊草等，研究發(fā)現(xiàn)高等植物葉綠體中的RNA編輯主要以胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶的形式存在，且主要發(fā)生在密碼子的第一、二位堿基，往往造成親水性氨基 酸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷园被?。目前，葉綠體RNA編輯位點(diǎn)的鑒定方法主要有生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、高通量測(cè)序和PCR擴(kuò)增等方法[17]。

目前，有關(guān)葉綠體RNA編輯的模型以及相關(guān)進(jìn)化問(wèn)題取得了較大進(jìn)展，但裸子植物中關(guān)于葉綠體RNA編輯的研究的報(bào)道僅見(jiàn)于黑松[18]和銀杏[19]等少數(shù)植物?，F(xiàn)代裸子植物約有800種，隸屬5綱即蘇鐵綱、銀杏綱、松柏綱、紅豆杉綱和買麻藤綱。蘇鐵(CycasrevolutaThunb)，蘇鐵科蘇鐵屬，又名鳳尾蕉、避火蕉、金代、鐵樹(shù)等，蘇鐵科植物是世界上最古老的裸子植物，被地質(zhì)學(xué)家譽(yù)為“植物活化石”[20]。有關(guān)蘇鐵RNA編輯的研究不多，李璐等人在常規(guī)的CTBA法中，加入了硼砂和β-巰基乙醇來(lái)消除多酚和多糖的干擾，從而得到了一個(gè)從蘇鐵葉片中有效提取 RNA 的方法[21]。臺(tái)灣生物中央研究所趙淑妙教授預(yù)測(cè)臺(tái)東蘇鐵中psbL基因只有一個(gè)RNA編輯位點(diǎn)，其它基因中沒(méi)有RNA編輯現(xiàn)象[22]。江媛、陸萍等人認(rèn)為，臺(tái)東蘇鐵的葉綠體基因組中有40個(gè)蛋白編碼基因有RNA編輯現(xiàn)象，在植物進(jìn)化中，RNA編輯正在逐漸消失且密碼子的第一、三位消失的更快，臺(tái)東蘇鐵的葉綠體基因組的RNA編輯位點(diǎn)比線粒體少三倍[23]。

現(xiàn)階段，對(duì)蘇鐵RNA編輯的研究較少，并且傾向與理論預(yù)測(cè)水平。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)快速方便，但結(jié)果可能與真實(shí)情況存在偏差，也無(wú)法預(yù)測(cè)第三位的沉默編輯。從已有文獻(xiàn)報(bào)道以及銀杏編輯位點(diǎn)的分析，表明裸子植物中有較多RNA編輯現(xiàn)象。因此，本次通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段并結(jié)合生物信息學(xué)的方法，對(duì)蘇鐵葉綠體8個(gè)功能基因進(jìn)行RNA編輯位點(diǎn)的分析，確定蘇鐵中是否有無(wú)RNA編輯現(xiàn)象，為進(jìn)一步全面了解蘇鐵葉綠體中功能基因全部編輯位點(diǎn)及其特點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

臺(tái)東蘇鐵(Cycastaitungensis)，購(gòu)買于西安三森花卉市場(chǎng)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

GT溶液(4 mol/L異硫氰酸胍，25 mmol/L檸檬酸鈉，0.5%十二烷基肌氨酸鈉)；

10×TBE電泳緩沖液(108 g Tris; 55 g硼酸；9.3 g EDTA2Na;1 000mL;PH8.0)；1%瓊脂糖凝膠 (0.2 g瓊脂糖；1×TBE緩沖液20 mL；2 μ EB)；3 mol/L NaAc(pp.8)，2 mol/L NaAc (ph1.8)，4 mol/L LiCl，0.1﹪ DEPC水。無(wú)水乙醇、液氮、氯仿、水飽和酚酸、RT-PCR Kit、DNA酶等。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器

DYY-12型電泳儀；PB-10型PH計(jì)；BS-124S型電子天平；YDS-30型液氮生物容器；DSX-280A型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋；JB-3定時(shí)恒溫磁力攪拌器；DYCP-31DN電泳槽；ALS1296型PCR儀；Centrifuge 5804R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)；Centrifuge 5417C型臺(tái)式高速離心機(jī)；AGX-7601型通風(fēng)廚；精密微量移液器；GDS-8000型凝膠成像系統(tǒng)；UNICAM UV300型紫外分光光度計(jì)；HH-2B型數(shù)顯恒溫水浴鍋； DW-86L368型超低溫冰箱；GZX-9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；PE手套，離心管，PCR管，槍頭。

1.2方法

1.2.1異硫氰酸胍法提取植物葉片總RNA

(1) 稱取0.1 g新鮮植物葉片，加入液氮研磨成粉末，移入預(yù)冷的1.5 mL Eppendorf管中。

(2)加入300 μL GT溶液，混勻；加入30 μL 2mol/L NaAc(pH 4.8)，反復(fù)振蕩混勻；加入300 μL酚酸與100 μL氯仿，混勻。

(3)4 ℃，8 000 r/min離心15 min，棄沉淀，取上清移至另一DEPC水處理過(guò)的干凈離心管中，加入2.5倍體積無(wú)水乙醇，-20 ℃放置5～6 h。 (-20 ℃可放置過(guò)夜)

(4) 4 ℃，8 000 r/min離心15 min，棄上清液。在沉淀中加入100 μL 4 mol/L LiCl，使沉淀溶解。

(5) 12 500 r/min離心15 min，棄上清液；在沉淀中加入100 μL滅菌后的DEPC水，混勻后再加入50 μL氯仿，50 μL水飽和酚混勻。

(6)12 500 r/min離心5 min，吸上清液移至另一DEPC水處理過(guò)的1.5 mL Eppendorf管，加入等體積氯仿。

(7)12 500 r/min離心5 min。吸上清液移至另一DEPC水處理過(guò)的1.5 mL Eppendorf管，加入1/10體積3 mol/L NaAc (pH 5.8)和兩倍體積無(wú)水乙醇，-20 ℃放置過(guò)夜。

(8)12 500 r/min離心5 min，小心吸去上清，RNA沉淀在室溫下稍干燥。

(9)加入20 μL DEPC處理過(guò)的滅菌水溶解，取5 μL樣品經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(100v,100 mA,20 min) RNA質(zhì)量，并取2 μL樣品加入498 μL DEPC處理過(guò)的水，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度；其余樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2待擴(kuò)增基因引物設(shè)計(jì)

確定RNA編輯位點(diǎn)較多的8個(gè)基因，psbL、psbF、psbE、PetB、PetD、ndhB、ndhA、ndhD，從NCBI上查出臺(tái)東蘇鐵Cycastaitungensis(序列號(hào)[NC-009618])全部葉綠體DNA序列和cDNA序列，選取編碼框前后100 bp處的核苷酸序列，用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)并合成引物。

引物名稱及序列見(jiàn)表1。

設(shè)計(jì)引物所用到的軟件有：

http://www.sigmagenosys.com/calc/DNAcalc.asp

http://www.bioinformatics.vg/bioinformatics_tools/reversecomplement.shtml

表1　引物名稱及序列

1.2.3RT-PCR擴(kuò)增

用RNase-free的DNaseI去除混雜在總RNA中的基因組DNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，用3 μL的RNA為模板，對(duì)逆轉(zhuǎn)得到的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系2 μL 臺(tái)東蘇鐵的cDNA, 12.5 μL 2 ×TaqPCR Mix，上、下游引物各2 μL,用水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序如下: 95 °C 3 m； 95 °C 1 m， 55 °C 1 m， 72 °C 1 m, 30個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10 m。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4 °C保存。取2 μL樣品經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(100 v，100 mA，20 min)PCR擴(kuò)增條帶。

1.2.4測(cè)序結(jié)果分析比對(duì)

采用Lesergene中seqman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果拼接和分析，并用ClastW軟件比對(duì)臺(tái)東蘇鐵DNA和cDNA序列，確定RNA編輯位點(diǎn)。

ClastW 軟件來(lái)自于http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html

Translate Tool 軟件http://ca.expasy.org/tools/dna.html

2結(jié)果和分析

2.1RT-PCR擴(kuò)增

通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，確定了葉綠體中8個(gè)發(fā)生RNA編輯現(xiàn)象可能性比較大的基因，即：psbL、psbF、psbE、PetB、PetD、ndhB、ndhD和ndhA。并對(duì)這8個(gè)基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果psbL、psbF、psbE和ndhB1未擴(kuò)增出條帶，原因待查。圖1顯示其余基因均擴(kuò)增結(jié)果良好，為單一條帶。其中PetD雖然擴(kuò)增出條帶(圖1泳道2)，但分子量大小與預(yù)期結(jié)果不符，可能不是想要擴(kuò)增的條帶，故舍去。ndhD1和ndhA1在同等PCR擴(kuò)增條件下得到的條帶很淡(圖1泳道4和7)，在加大cDNA的用量之后，得到了符合測(cè)序的條帶，但測(cè)序結(jié)果顯示ndhD1和ndhA1的測(cè)序信號(hào)中斷，無(wú)結(jié)果?？赡苁怯捎谒腿y(cè)序的樣品中所含雜質(zhì)較多，或測(cè)序本身的問(wèn)題所造成。上述PCR擴(kuò)增結(jié)果表明擴(kuò)增條帶好壞與引物設(shè)計(jì)，模板用量以及PCR體系的優(yōu)化均有密切關(guān)系，而測(cè)序結(jié)果則與樣品濃度，公司測(cè)序反應(yīng)有關(guān)。

圖1　PCR擴(kuò)增條帶的電泳結(jié)果Fig.1　Electrophoresis result of PCR amplification bands

2.2測(cè)序結(jié)果分析

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序最終得到了PetB、ndhB2、ndhD2和ndhA2的cDNA測(cè)序結(jié)果。通過(guò)與NCBI所查到的臺(tái)東蘇鐵DNA的序列分析比對(duì)，從表2可知在ndhD2的五個(gè)位( 34，400，469，570，706 bp)存在C-U的完全編輯現(xiàn)象，對(duì)應(yīng)Pro-Leu，Ser-Phe，Ser-Phe，His-Tyr，Thr-Ile的氨基酸轉(zhuǎn)變；在PetB的634bp位點(diǎn)存在 C-U的完全編輯，造成Pro到Ser氨基酸轉(zhuǎn)變；在ndhA第二外顯子350 bp位點(diǎn)存在U-Y沉默編輯；在ndhB2的203位點(diǎn)發(fā)生C-Y部分編輯, 同時(shí)404，509，533，695位點(diǎn)存在C-U的完全編輯，對(duì)應(yīng)造成Ser-X，Ser-Leu，Ser-Leu，Pro-Leu，Thr-Ile氨基酸的轉(zhuǎn)變。ndhB2位點(diǎn)533的完全編輯與203的部分編輯比較見(jiàn)圖2和圖3。經(jīng)過(guò)對(duì)蘇鐵葉綠體中的ndhD2、PetB、ndhA和ndhB的編輯位點(diǎn)的分析，初步確定在臺(tái)東蘇鐵中存在完全編輯、沉默編輯和部分編輯現(xiàn)象，且核苷酸的轉(zhuǎn)換有C-U的轉(zhuǎn)變方式。

3討論與結(jié)論

本文采用異硫氰酸胍法獲取臺(tái)東蘇鐵的總RNA，成本低且效果好。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序比對(duì)，得知臺(tái)東蘇鐵葉綠體功能基因中存在完全編輯、沉默編輯和部分編輯現(xiàn)象。其中ndhD2的五個(gè)位點(diǎn)存在C-U的RNA完全編輯；在PetB的位點(diǎn)存在1個(gè) C-U的完全編輯；在ndhA第二外顯子350 bp位點(diǎn)存在U-Y沉默編輯；在ndhB2的203位點(diǎn)發(fā)生C-Y部分編輯, 同時(shí)有4個(gè)位點(diǎn)存在C-U的完全編輯。

表2　臺(tái)東蘇鐵中四個(gè)葉綠體基因的編輯前后核苷酸和氨基酸變化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖2　ndhB2完全編輯Fig 2　Completely editing sites in ndhB2

圖3　ndhB2部分編輯 Fig 3　Partial editing sites in ndhB2

這說(shuō)明臺(tái)東蘇鐵葉綠體功能基因存在RNA編輯現(xiàn)象，大部分編輯呈現(xiàn)C-U的轉(zhuǎn)變，ndh類基因中RNA編輯發(fā)生頻率較高，并且絲氨酸相比其他氨基酸有更高的編輯頻率。這一結(jié)論與江媛、陸萍等人的研究具有一致性，在petB的完全編輯和ndhD有5個(gè)完全編輯位點(diǎn)方面的研究結(jié)果也是具有一致性[23]。測(cè)序結(jié)果顯示ndhB有4個(gè)位點(diǎn)完全編輯與1個(gè)位點(diǎn)部分編輯，ndhA有一個(gè)沉默編輯位點(diǎn)，這與陸萍等人的研究中提到ndhB僅有一個(gè)完全編輯位點(diǎn)且ndhA中未出現(xiàn)沉默編輯的結(jié)論不一致，這可能與材料的選擇、不同發(fā)育階段以及環(huán)境因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

RNA編輯是高等植物葉綠體轉(zhuǎn)錄本成熟過(guò)程中的一種重要修飾和加工方式。RNA編輯使人們對(duì)生物的長(zhǎng)期進(jìn)化中所形成的遺傳信息表達(dá)和調(diào)控機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，也加深了對(duì)復(fù)雜的生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)。已有研究表明，RNA編輯位點(diǎn)在進(jìn)化過(guò)程中呈減少趨勢(shì)，但一些重要的位點(diǎn)會(huì)繼續(xù)保留[24]。臺(tái)冬蘇鐵中的ndhB的部分編輯位點(diǎn)是調(diào)控基因表達(dá)的一種方式，還是進(jìn)化過(guò)程中會(huì)消失的位點(diǎn), 有待進(jìn)一步的研究。ndhA中存在沉默編輯位點(diǎn)，而近年來(lái)對(duì)于沉默編輯功能的認(rèn)識(shí)也存在爭(zhēng)議。Hirose等人認(rèn)為沉默編輯與葉綠體的照光程度和發(fā)展階段相關(guān)[25]；Nakamura和Sugiura的研究表明, 葉綠體基因組存在密碼子的偏好性, 沉默編輯會(huì)影響蛋白質(zhì)翻譯的效率[26]；也有學(xué)者認(rèn)為沉默編輯似乎是多余的，在今后的進(jìn)化過(guò)程中會(huì)消除[27]。

總之，RNA 編輯不但使編碼基因組的遺傳信息得到了擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)物有所影響。目前對(duì) RNA 編輯的機(jī)制還不完全清楚，尤其是臺(tái)東蘇鐵屬于較古老的裸子植物，對(duì)其葉綠體RNA 編輯的研究具有一定的生物學(xué)意義。為進(jìn)一步全面了解蘇鐵葉綠體中功能基因全部編輯位點(diǎn)的特點(diǎn)和功能奠定了基礎(chǔ)，也為研究生物進(jìn)化方面提供一定的參考價(jià)值。

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Analysis of RNA editing sites in the chloroplast genome ofCycastaitungensis

SHEN Chengcai

(KaramaySchoolAttachedToBeijingNormalUniversity,KaramayXinjiangUygurAutonomousRegion834000,China)

Abstract：Cycas taitungensis is ancient gymnosperms,and the research of RNA editing in Cycas is limited.We analyzed the composition and distribution of RNA editing in Cycas taitungensis,which provided the useful information for exporing the function and mechanism of RNA editing,as well as for revealing the origin and evolution of higher plants.The thiocyanate method is appropriate for the RNA extraction of Cycas taitungensis. The cDNA was obtained by reverse transcribed the DNA-free RNA which treated with DNase.The RNA editing sites were found by RT-PCR,sequence and blast DNA and cDNA. Our results showed that the conversion of C-to-U and C-to-U editing events could be found in the ndhD2 and PetB transcripts of Cycas taitungensis as well as in ndhB(2 )transcript. We found that ndh genes have a higher rate of editing,while the serine codon was more frequently edited than the others.The results showed that there is a partially editing sites in ndhB(2 ) transcrip,and silence editing sites also could be found in the ndhA2 transcript.

Keywords：Cycas taitungensis；RNA editing；RNA extraction；Guanidine thiocyanate.

中圖分類號(hào)：Q51

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5565(2016)01-013-06

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.01.03

作者簡(jiǎn)介：沈成才，女，中教一級(jí)，研究方向：生物技術(shù)； E-mail: shencc_1@sina.cn.

收稿日期：2015-04-29；修回日期：2015-11-23.