HPCD脫除紫甘藍色素中烯丙基異硫氰酸酯工藝的優(yōu)化*

劉鳳嬌，周 兵，張璐瑤，胡國偉，廖小軍，胡小松，張 燕

(中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，農業(yè)部果蔬加工重點開放實驗室，北京 100083)

1 引 言

烯丙基異硫氰酸酯(Allyl Isothiocyanate,AITC)是由烯丙基硫苷與硫代葡萄糖苷酶反應生成的一種異硫氰酸酯類物質[1-2]，廣泛存在于西蘭花、紫甘藍、花椰菜、芥菜、蘿卜等十字花科植物中[3]。AITC具有較強的揮發(fā)性，以及強烈的刺激性氣味[4-5]，賦予十字花科植物辛辣刺激的口感和特殊的風味。

紫甘藍色素是紫甘藍中的內源色素物質，作為一種天然食用色素現(xiàn)已被用作食品的著色劑。在提取紫甘藍色素過程中，由于細胞破損，硫代葡萄苷酶作用于硫代葡萄糖苷，產生AITC、烯丙基腈等異味物質[6]，嚴重影響紫甘藍色素的風味和應用范圍。因此，如何在提取紫甘藍色素的同時脫除其中的異味物質，成為紫甘藍色素工業(yè)生產和應用的技術難點。

高壓二氧化碳(High Pressure Carbon Dioxide，HPCD)技術是一種新型的冷殺菌技術，它通過CO2在50 MPa以下壓力的分子效應影響微生物和酶，從而保持食品新鮮的質地、營養(yǎng)和感官品質[7-8]。HPCD的作用機理主要是壓力與CO2共同作用，形成酸性的高壓環(huán)境和可控的溫度環(huán)境。CO2分子具有對稱結構，因而具有非極性，能溶解非極性物質。在高壓下，隨著壓強的增大，CO2的物化特性改變，非極性物質在CO2中的溶解性增強，并隨CO2逸出，同時溫度也會影響非極性物質的熱降解。AITC是一種非極性物質，因此HPCD可以用于紫甘藍色素中主要異味物質AITC的脫除。

本實驗通過研究不同工藝參數(shù)(壓強、溫度、處理時間、卸壓時間)對HPCD脫除AITC效果的影響，設計正交實驗對主要影響因素進行工藝優(yōu)化，分析最佳工藝條件下HPCD對紫甘藍色素異味物質的脫除效果，旨在為紫甘藍異味物質的脫除提供一種有效可行的工藝方法，促進十字花科植物提取物在食品工業(yè)中的應用。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

紫甘藍紅色素，晨光生物科技集團贈送，于4 ℃環(huán)境儲藏備用。AITC標品(質量分數(shù)大于或等于95%)，色譜純，購于美國Sigma公司。乙腈，色譜純，購于美國Honeywell公司。二氧化碳氣體(純度99.5%)，購于北京千禧氣體有限公司。

2.2 實驗儀器

實驗采用CAU-HPCD-1(ZL200520132590.X)型HPCD處理裝置(中國農業(yè)大學自行設計)[9]，該裝置中高壓二氧化碳產生輸送單元與反應釜連接，能將產生的高壓二氧化碳經預熱器預熱后輸送到反應釜中。實驗中還應用了GC7890A/MS5975C型氣質聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，S-HH-W21-Cr600型恒溫水浴箱(北京長安科學儀器廠)，2000D超純水器(北京長風儀器儀表公司)。

2.3 實驗方法

2.3.1HPCD不同工藝參數(shù)處理

將HPCD設備的反應釜預熱到預定溫度，將裝有2 mL質量分數(shù)為10-3的AITC水溶液的50 mL離心管置于反應釜中。經過1～5 min的升壓過程達到預定壓強，在恒定的壓強和溫度下處理一定時間后，迅速卸壓(卸壓時間約為2～4 min)，取出離心管。

采用單因素實驗，分別考察不同壓強(8、12、16、20、24 MPa)、處理溫度(35、40、45、50、55 ℃)、處理時間(5、15、30、45、60 min)和卸壓時間(1、2、3、4、5 min)對HPCD脫除AITC效果的影響。在單因素的基礎上，設計正交實驗，分析重要因素的作用大小及最優(yōu)組合，從而對HPCD處理的工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

2.3.2AITC含量的測定

對HPCD處理后的樣品進行高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)測定[10]。色譜條件為：島津液相色譜系統(tǒng)，LG-20AT泵，SPD-20AV紫外可見檢測器；SIL-20A自動進樣器，進樣量為20 μL；CTO-20A柱溫箱，Agela公司ASB C18柱(4.6 mm×250 mm)，柱溫為30 ℃；流動相A為乙腈，流動相B為超純水，梯度洗脫：0～2 min，100% B；2～3 min，100%～35% B；3～20 min，35% B；20～30 min，35%～100% B。流速為1 mL/min，檢測波長為243 nm。

準確稱取一定量的AITC標品(精確到0.1 mg)，用超純水配成不同質量分數(shù)的標準溶液，過0.45 μm濾膜，用HPLC進行測定。確定供試液質量分數(shù)在4.0×10-5～1.4×10-3范圍內時，AITC的進樣量與相應色譜峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)R2達0.995。

2.3.3HPCD處理前、后紫甘藍色素異味物質鑒定

采用氣相色譜-質譜(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS)技術分析測定紫甘藍色素的異味物質。取HPCD處理前、后的紫甘藍色素水溶液各8 mL，置于15 mL樣品瓶內，40 ℃恒溫攪拌，固相微萃取40 min，然后進行GC-MS測定。測試儀器選用Agilent公司GC7890A/MS5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，色譜條件為：DB-5 MS柱(30 m×250 mm×0.25 mm)，測定時柱溫為60 ℃，保持2 min；后以4 ℃/min的速率升至125 ℃；最后以8 ℃/min的速率升至230 ℃，保持8.625 min。進樣口溫度為250 ℃，載氣為He氣，流速為1 mL/min。質譜條件為：離子源為EI，電子能量為70 eV，接口溫度為250 ℃，質量范圍為30～550 u。

3 結果與討論

3.1 HPCD不同工藝參數(shù)對脫除AITC的影響

3.1.1壓強對HPCD脫除AITC的影響

為了考察壓強對HPCD脫除AITC效果的影響，采用50 ℃下，HPCD處理30 min，卸壓2 min，以5種不同壓強(8、12、16、20、24 MPa)對AITC進行脫除，結果如圖1所示。隨著壓強的增大，AITC質量分數(shù)的變化差異不顯著，在1.432×10-5到1.567×10-5之間波動,表明壓強對HPCD脫除AITC效果的影響并不顯著(P>0.05)。在較低壓力下(10 MPa左右)，弱極性或非極性物質即可溶于CO2流體中[11]。經過8 MPa HPCD處理后，溶液中AITC的質量分數(shù)已經較低，而AITC在CO2流體中的溶解能力有限，接近飽和狀態(tài)，因此繼續(xù)加壓，AITC的質量分數(shù)變化不大。綜合而言，壓強對脫除AITC的效果影響不大，因此選擇較低壓強8 MPa即可。

3.1.2溫度對HPCD脫除AITC效果的影響

為了考察溫度對HPCD脫除AITC效果的影響，采用8 MPa下，HPCD處理15 min，卸壓2 min，以5種不同溫度(35、40、45、50、55 ℃)對AITC進行脫除，結果如圖2所示。隨著溫度的升高，AITC的質量分數(shù)逐漸減少，呈兩段式變化。當溫度低于40 ℃時，溫度的變化對脫除效果影響劇烈,當溫度由35 ℃升至40 ℃時，AITC的質量分數(shù)由6.629×10-5減少為4.023×10-5；當溫度高于40 ℃時，繼續(xù)升高溫度，AITC質量分數(shù)降低的幅度減小，溫度達到55 ℃時，AITC的質量分數(shù)為3.122×10-5。升溫可以提高AITC的揮發(fā)度，增強對AITC的脫除效果，但溫度升高也會使CO2的密度降低，導致溶解度下降，影響脫除效果。另外，較高溫度會影響AITC的降解[12]。張清風等人[13]研究了溫度對辣根油中異硫氰酸酯水解穩(wěn)定性的影響，結果表明，溫度對異硫氰酸酯的影響很大，25 ℃下異硫氰酸酯水解很慢，而在65 ℃時水解速度相當快。較高溫度有利于AITC脫除的原因可能是AITC不穩(wěn)定，發(fā)生降解，而降解產物揮發(fā)性強，故脫除。

圖1 不同壓強下溶液中AITC的質量分數(shù)Fig.1 Mass fraction of AITC in solution under different pressures

圖2 不同處理溫度下溶液中AITC的質量分數(shù)Fig.2 Mass fraction of AITC in solution under different treatment temperatures

3.1.3處理時間對HPCD脫除AITC效果的影響

為了考察處理時間對HPCD脫除AITC效果影響，采用8 MPa、55 ℃下HPCD處理，卸壓2 min，以5種不同處理時間(5、15、30、45、60 min)對AITC進行脫除，結果如圖3所示。隨著處理時間的增加，AITC的質量分數(shù)逐漸減少。當處理30 min時，AITC的質量分數(shù)大幅度降為1.445×10-5；處理30 min后，延長處理時間，AITC的質量分數(shù)仍呈降低趨勢，但降低的幅度減小?？梢?，處理時間的延長能促進AITC的脫除，AITC的質量分數(shù)不斷減少。由于AITC對溫度敏感，隨著處理時間的延長，AITC會發(fā)生降解，因而45 min后AITC的脫除速率增大。

3.1.4卸壓時間對HPCD脫除AITC效果的影響

為了考察卸壓時間對HPCD脫除AITC效果的影響，采用8 MPa、55 ℃下，HPCD處理5 min，以5種不同卸壓時間(1、2、3、4、5 min)對AITC進行脫除，結果如圖4所示。隨著卸壓時間的增加，AITC的質量分數(shù)呈現(xiàn)先減后增的趨勢，在卸壓2 min時AITC的質量分數(shù)達到最小值6.471×10-5。其可能原因是若卸壓速度過快，處理釜內溫度急劇降低，樣品因溫度過低而結冰，不利于CO2將AITC帶出；另一方面，若卸壓速度過慢，會減弱CO2從水溶液中溢出所產生的爆破作用，從而減少AITC被帶出的量。為達到較好的脫除效果，確定卸壓時間為1～3 min較為合適。

圖3 不同處理時間下溶液中AITC的質量分數(shù)Fig.3 Mass fraction of AITC in solution under different treatment time

圖4 不同卸壓時間下溶液中AITC的質量分數(shù)Fig.4 Mass fraction of AITC in solution under different pressure relief time

3.2 HPCD脫除AITC工藝參數(shù)優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上，對影響HPCD脫除AITC效果的主要因素(溫度、處理時間、卸壓時間)進行L9(34)正交實驗，實驗設計及實驗結果如表1～表3所示。

表1 正交實驗設計因素水平表Table 1 Experimental levels employed for orthogonal experimental design

表2 正交實驗結果Table 2 Response value of orthogonal experimental design

表3 正交實驗結果分析Table 3 Analysis of orthogonal experimental results

Note：Ki(i=1,2,3) is the mean value of factors at leveli，andRbis the extreme differences.

實驗結果極差分析表明，溫度對HPCD脫除AITC效果的影響最大，其次是處理時間，卸壓時間對其影響最小，即A>B>C；最佳工藝組合為A3B3C2，即HPCD脫除AITC的最佳工藝為溫度50 ℃、處理時間60 min、卸壓2 min。

3.3 HPCD對紫甘藍色素異味脫除的效果分析

在最佳工藝條件下對紫甘藍色素進行HPCD處理，為了考察HPCD處理前、后異味物質的變化情況，分別對HPCD處理前、后的紫甘藍色素樣品進行GC-MS分析，得到的結果如表4所示。

表4 HPCD處理前、后紫甘藍色素揮發(fā)性成分的GC-MS結果比較Table 4 Comparison of GC-MS results of volatile compounds in purple cabbage pigmentbefore and after HPCD treatment

從表4可以看出，HPCD處理前，紫甘藍色素中揮發(fā)性成分有17種，其中醛類7種、烴類6種、含硫類化合物4種，主要成分為癸醛(26.77%)、壬醛(23.86%)、二甲基三硫醚(15.18%)、辛醛(10.25%)、烯丙基異硫氰酸酯(3.15%)。在揮發(fā)性風味成分中，烴類物質包括烷烴、烯烴和芳香烴。烷烴香氣閾值較高[14]，對紫甘藍色素的異味形成作用不大；醛類物質對紫甘藍色素的異味貢獻也不大[15]。烯烴和芳香烴與飽和烴相比閾值較低，且具有特殊氣味，如萘具有樟腦球的風味，對紫甘藍色素異味的形成有一定作用。含硫化合物大多有強烈的氣味，嗅感閾值很低，對紫甘藍色素異味形成的貢獻較大，如二甲基三硫醚呈甘藍氣味，二甲基四硫醚具有豬肉的揮發(fā)性香氣[16]，烯丙基異硫氰酸酯有強烈的催淚性和辛辣味[17]，是十字花科蔬菜及其加工過程中的特征風味物質，也是紫甘藍色素核心的異味物質。

經HPCD最佳工藝處理后，紫甘藍色素中揮發(fā)性成分有7種，其中醛類3種、烴類2種、含硫化合物2種，主要成分為癸醛(1.69%)、壬醛(1.53%)、烯丙基異硫氰酸酯(1.06%)。與HPCD處理前相比，對紫甘藍色素異味形成有一定作用的物質得到不同程度的脫除，如烯丙基異硫氰酸酯由3.15%減少到1.06%，烯丙基硫氰酸酯由2.69%減少到0.42%，萘由1.46%減少到0.29%，2-甲基-萘由1.12%減少到0.68%，而2,6-二甲基-萘、1,7-二甲基-萘、1-甲基-環(huán)己烯、二甲基三硫醚及二甲基四硫化合物則被完全脫除。由此可以看出，在最佳工藝條件下，HPCD對紫甘藍色素異味物質的脫除效果較好，且脫除的揮發(fā)性成分種類和含量較多。

4 結 論

在不同壓強、溫度、處理時間和卸壓時間下，HPCD脫除AITC的效果表明，溫度對HPCD脫除AITC效果的影響最大，其次是處理時間、卸壓時間，而壓強對HPCD脫除AITC效果的影響不顯著；HPCD脫除AITC的最佳工藝組合為A3B3C2，即溫度50 ℃、處理時間60 min、卸壓時間2 min。

紫甘藍色素經HPCD處理后，風味物質種類由17種變?yōu)?種，對紫甘藍色素異味形成有一定作用的物質得到不同程度的脫除，如烯丙基異硫氰酸酯由3.15%減少到1.06%，烯丙基硫氰酸酯由2.69%減少到0.42%，萘由1.46%減少到0.29%，2-甲基-萘由1.12%減少到0.68%，而2,6-二甲基-萘、1,7-二甲基-萘、1-甲基-環(huán)己烯、二甲基三硫醚及二甲基四硫化合物則被完全脫除。由此可看出，在最佳工藝條件下，HPCD對紫甘藍色素異味物質的脫除效果較好。

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