核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3在阿爾茨海默病和血管性癡呆患者中的表達(dá)及相關(guān)因素研究①

柏　華，楊　波，余德軍，張啟芳

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核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3在阿爾茨海默病和血管性癡呆患者中的表達(dá)及相關(guān)因素研究①

柏華1a,1b，楊波1c，余德軍1a，張啟芳2

[摘要]目的探討核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)對(duì)癡呆發(fā)病的影響。方法2014年1月～2015年10月，用RT-PCR方法檢測16例阿爾茨海默病(AD)患者、22例血管性癡呆(VD)患者和20名年齡相似的健康體檢者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3 mRNA水平；ELISA法檢測血清中白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18蛋白水平；收集患者外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)和血清總鈣濃度等臨床檢測資料；將NLRP3 mRNA水平分別與IL-1β、IL-18、WBC和鈣濃度進(jìn)行單因素相關(guān)分析。結(jié)果NLRP3 mRNA水平由高到低依次為AD組>VD組>健康組(q>11.48,P<0.05)；IL-1β水平AD組高于健康組(q=16.74,P<0.05)，AD組與VD組、VD組與健康組無顯著性差異(P>0.05)；IL-18水平各組間均無顯著性差異(P>0.05)。AD組中，NLRP3 mRNA水平與IL-1β水平(r=0.64)、血清鈣水平(r=0.58)呈正相關(guān)，與IL-18、WBC無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論NLRP3炎癥小體中相關(guān)蛋白或基因表達(dá)與AD的發(fā)病可能有較大關(guān)系，與VD的發(fā)病關(guān)系不大。

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默??；血管性癡呆；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；炎癥；發(fā)病

[本文著錄格式]柏華，楊波，余德軍，等.核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3在阿爾茨海默病和血管性癡呆患者中的表達(dá)及相關(guān)因素研究[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2016,22(3):306-309.

CITED AS:Bai H,Yang B,Yu DJ,et al.Expression of nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3 in patients with Alzheimer's disease and vascular dementia and related factors[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(3):306-309.

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種進(jìn)行性的大腦變性疾病，是導(dǎo)致老年人癡呆最常見的原因之一。AD主要的病理變化是神經(jīng)炎性斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)，這兩者均可能與大腦中非特異性炎癥的發(fā)生有一定關(guān)系[1]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3,NLRP3)在AD發(fā)病中的作用越來越引起重視。Heneka等發(fā)現(xiàn)，NLRP3在AD患者中由于caspase-1基因高表達(dá)而被活化，并有助于APP/PS-1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦老化病灶的形成；通過減少大腦caspase-1和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β的活性，有助于β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的清除[2]。

血管性癡呆(vascular dementia,VD)也是一種引起老年人群癡呆發(fā)生的常見疾病。通常認(rèn)為梗死或出血的腦組織越多越容易發(fā)生VD，發(fā)生血管病變的部位與智力關(guān)系越密切越容易發(fā)展成VD。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，VD患者大腦也有炎癥發(fā)生[3]。

模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)在固有免疫反應(yīng)中有重要作用，NLRP3既是PRR中的重要成員，也是炎癥小體中的重要成分[4]。為了探討AD和VD發(fā)病機(jī)制的異同，我們比較NLRP3在AD和VD患者中表達(dá)的差異。

1資料與方法

1.1一般資料

2014年1月～2015年10月在貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和精神心理科住院的AD患者16例，VD患者22例。

癡呆的診斷由經(jīng)過培訓(xùn)的?？漆t(yī)師按照簡明精神狀態(tài)檢查進(jìn)行評(píng)分。參照2011年美國國立老化研究所和阿爾茨海默病協(xié)會(huì)修訂的NINCDS-ADRDA標(biāo)準(zhǔn)診斷AD，即缺血指數(shù)量表(Hachinski Inchemic Score,HIS)評(píng)分≤4分，并排除其他大腦變性疾病和代謝障礙性疾病所致的癡呆。參照美國國立神經(jīng)病與卒中研究所/瑞士神經(jīng)科學(xué)研究國際會(huì)議(NINDS-AIREN)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷VD[5]，且HIS評(píng)分≥7分。共篩查30例可疑VD患者，22例臨床診斷為VD，其余8例有血管性認(rèn)知功能障礙，但未達(dá)到VD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。

AD患者中，男性9例，女性7例；平均年齡(68.8±12.1)歲；平均病程(8.5±3.2)年。VD患者中，男性12例，女性10例；平均年齡(67.4±11.8)歲；平均病程(12.6±3.9)年。

在貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院體檢科方便抽取中老年人20名(健康組)，平均年齡(67.9±10.5)歲。

收集AD組和VD組的血常規(guī)檢查資料和血液電解質(zhì)檢查資料。

本研究獲得貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 RT-PCR

收集EDTA抗凝血液標(biāo)本，淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用Trizol試劑盒(INVITROGEN公司)進(jìn)行抽提細(xì)胞總RNA，加入無RNA酶的超純水50 μl溶解RNA。用紫外分光光度計(jì)檢測RNA吸光度，計(jì)算A280/A260比值約1.9左右。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，使用德國FlexCyxler PCR儀。根據(jù)GenBank中人肌動(dòng)蛋白(β-actin)和NLRP3基因設(shè)計(jì)引物。

NLRP3上游：5'-CTT CCT TTC CAG TTT GCT GC-3'；下游：5'-TCT CGCAGT CCACTT CCT TT-3'

β-actin上游：5'-ATG ATG GCT TAT TAC AGT GGC AA-3'；下游：5'-GTC GGA GAT TCG TAG CTG GA-3'。

95℃30 s預(yù)變性，95℃30 s變性，55℃30 s退火，70℃1 min延伸，共36個(gè)循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物用含GreenView核酸染料的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀曝光，BIO-RAD Quantity-One軟件測量灰度值，與內(nèi)參β-actin灰度值的比值代表NLRP3 mRNA表達(dá)量。

1.3 ELISA

IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。使用BIO-RAD-680型酶標(biāo)儀，630/450 nm雙波長測定OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1各測量指標(biāo)水平

NLRP3 mRNA表達(dá)(圖1)AD組高于健康組(q= 18.23,P=0.003)和VD組(q=15.65,P=0.007)，VD組高于健康組(q=11.48,P=0.024)。IL-1β水平AD組高于健康組(q=16.74,P=0.036)，AD組與VD組、VD組與健康組間均無顯著性差異(P>0.05)；IL-18水平各組間均無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

AD組和VD組WBC和血清鈣濃度見表2。

圖1　RT-PCR檢測結(jié)果

表1　各組NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-18水平比較

表2　AD組和VD組WBC和血清鈣濃度比較

2.2相關(guān)性分析

AD組中，NLRP3 mRNA表達(dá)與IL-1β(r=0.64)、鈣濃度(r=0.58)呈正相關(guān)(P<0.05)，與IL-18或WBC無相關(guān)性(P>0.05)；VD組中，NLRP3 mRNA表達(dá)與IL-1β、IL-18、WBC、鈣濃度均無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3　AD組和VD組NLRP3 mRNA與其他指標(biāo)的相關(guān)性分析

3討論

AD患者以Aβ在大腦海馬中過度沉積和Tau蛋白異常磷酸化為主要發(fā)病機(jī)理，Aβ的生成和清除失調(diào)很可能是AD發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)或中心事件[6]。過度累積的Aβ通過激活蛋白激酶，促進(jìn)Tau蛋白磷酸化，引發(fā)慢性炎性，激活細(xì)胞凋亡，發(fā)生氧化應(yīng)激，最終引起神經(jīng)細(xì)胞變性死亡[7]。目前開發(fā)的AD治療藥物主要試圖抑制Aβ炎性斑塊形成，阻止Tau蛋白異常磷酸化。抑制Aβ誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)尤其受到重視。

NLRP3炎性小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(ASC)和效應(yīng)蛋白caspase-1組成的大分子復(fù)合體[8]。NLRP3炎性小體與固有免疫系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮有重要關(guān)系，如果對(duì)其調(diào)控失衡，可能導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18等大量生成，通過相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引發(fā)一系列炎癥瀑布反應(yīng)，最終參與包括AD在內(nèi)的多種炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展[9]。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Aβ可通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎性小體，導(dǎo)致腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元損傷和死亡，進(jìn)而引發(fā)AD[10]。固有免疫系統(tǒng)作為機(jī)體的第一道保護(hù)屏障，能夠通過PRR識(shí)別病原相關(guān)分子，以抵抗外來病原體的入侵和修復(fù)機(jī)體損傷[11]；NLRP3蛋白作為PRR-NLR家族中的重要成員，能夠識(shí)別細(xì)胞內(nèi)的病原體以及細(xì)胞自身產(chǎn)生的危險(xiǎn)信號(hào)，從而保持機(jī)體健康。從固有免疫系統(tǒng)角度研究AD的發(fā)病機(jī)制有重大的病理生理學(xué)意義。

本研究提示，NLRP3基因的高表達(dá)在AD、VD的發(fā)病中均能起一定作用。Murphy等發(fā)現(xiàn)，用Aβ處理大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞后，經(jīng)由組織蛋白酶依賴性的NLRP10降解作用，NLRP3炎癥小體有所形成和活化，其中NLRP3蛋白明顯增加[12]。這一結(jié)果提示，NLRP3主要誘發(fā)AD發(fā)病，而對(duì)VD的發(fā)生作用可能有限。由于本次檢測樣本量不大，缺乏國外同類資料橫向比較，確切的臨床生物學(xué)意義還有待探索。下一步我們還考慮檢測癡呆患者血液中NLRP3蛋白的變化，以比較VD組與AD組的差異。

NLRP3有助于APP/PS-1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中老化病灶的形成，很可能是通過caspase-1和IL-1β介導(dǎo)而起作用[2]。本研究顯示，IL-1β在AD發(fā)病中起一定作用，但在VD的發(fā)病意義不大；而IL-18雖然是NLRP3炎癥小體的下游分子，但對(duì)AD或VD發(fā)病的意義均很有限。Halle等用Aβ處理小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，加有溶酶體抑制劑細(xì)胞松弛素D或組織蛋白酶B抑制劑處理組中，IL-1β表達(dá)均減少，提示Aβ通過溶酶體破裂途徑激活NLRP3炎性小體誘導(dǎo)IL-1β表達(dá)，并促進(jìn)AD進(jìn)展[13]；有時(shí)Aβ能夠誘導(dǎo)大量IL-1β表達(dá)，促進(jìn)AD發(fā)生和發(fā)展，在此過程中NLRP3起關(guān)鍵作用[14]。

在AD的發(fā)病機(jī)制中，鈣離子失衡也有較大作用。鈣離子在突觸的發(fā)育和重塑、神經(jīng)存活等方面起重要作用，鈣離子過多進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起神經(jīng)細(xì)胞死亡[15]。本研究顯示，如果單純分析患者血液WBC和血清總鈣濃度，并無異常情況；但AD患者NLRP3 mRNA與血清總鈣濃度呈正相關(guān)，與WBC無關(guān)；VD患者NLRP3 mRNA與這兩者均無相關(guān)性。提示NLRP3在AD發(fā)病中的作用可能與血液中鈣離子濃度的增高有一定關(guān)系。另外我們發(fā)現(xiàn)，AD患者NLRP3 mRNA表達(dá)與IL-1β呈正相關(guān)，而在VD患者中兩者無明顯相關(guān)，提示IL-1β在AD的發(fā)病中可能更重要，而與VD發(fā)病的關(guān)系有待進(jìn)一步分析。

在AD病程進(jìn)展中，關(guān)于鈣離子與IL-1β或NLRP3的相互作用可能是很復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，確切的機(jī)理還不清楚。有學(xué)者認(rèn)為，鈣離子與鈣敏感受體(calcium sensing receptor,CASR)結(jié)合，激活NLRP3炎性小體；活化的CASR一方面降低細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度，以解除cAMP對(duì)NLRP3的抑制作用，另一方面還可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平持續(xù)升高，導(dǎo)致線粒體功能受損，并釋放mtDNA誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化[15-16]。

總之，NLRP3炎性體的作用有可能是Aβ代謝異常誘導(dǎo)AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，針對(duì)這一環(huán)節(jié)深入研究有望對(duì)AD的治療產(chǎn)生新的突破。

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Expression of Nucleotide-binding Oligomerization Domain Receptor Protein 3 in Patients with Alzheimer's Disease and Vascular Dementia and Related Factors

BAI Hua1a,1b,YANG Bo1c,YU De-jun1a,ZHANG Qi-fang2
1.a.Medical Laboratory Center;b.Department of Neurology;c.Department of Psychiatry;the Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Duyun,Guizhou 558000,China;2.Key laboratory of Medical Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 555000,China

Correspondence to BAI Hua and ZHANG Qi-fang.E-mail:baihcd@126.com(BAI Hua),gracezhang886@hotmail.com(ZHANG Qi-fang)

Abstract:Objective To explore the role of nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3(NLRP3)inflammasome in the pathogenesis of dementia.Methods 16 patients with with Alzheimer's disease(AD),22 patients with vascular dementia(VD)and 20 healthy persons with similar age were detected the level of NLRP3 mRNA with RT-PCR in peripheral blood mononuclear cells January,2014 to October,2015.The serum level of interleukin(IL)-1β and IL-18 were detected with ELISA.The total number of white blood cells(WBC)and serum total calcium were collected.Single factor correlation analysis was performed between NLRP3mRNA and IL-1β,or IL-18,or WBC,or calcium concentration.Results The levels of NLRP3 mRNA ranged from high to low were as in AD group >VD group >the healthy group(q>11.48,P<0.05).The serum level of IL-1β was higher in AD group than in the the healthy group(q=16.74,P<0.05),but not significantly different between VD group and the healthy group,nor between VD group and AD group(P>0.05).There was no significant difference about IL-18 among AD group,VD group and the healthy group(P>0.05).NLRP3 mRNA was positively correlated with the serum levels of IL-1β(r=0.64)and calcium(r=0.58)in AD group.There was no correlation between NLRP3 mRNA and IL-18 or WBC(P>0.05).Conclusion The expression of NLRP3 inflammasome may be related with the pathogenesis of AD,but little impact on the pathogenesis of VD.

Key words:Alzheimer's disease;vascular dementia;nucleotide-binding oligomerization domain receptor protein 3;inflammation;pathogenesis

(收稿日期：2015-11-16修回日期：2016-03-01)

基金項(xiàng)目：1.國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.8156110223)；2.貴州省科技廳重大專項(xiàng)(No.黔科合計(jì)Z字2012-4010號(hào))。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.03.015

[中圖分類號(hào)]R749.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1006-9771(2016)03-0306-04

作者單位：1.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，a.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；b.神經(jīng)內(nèi)科；c.精神科，貴州都勻市558000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽市555000。作者簡介：柏華(1964-)，男，漢族，湖南寧遠(yuǎn)縣人，博士，教授，研究生導(dǎo)師，主要研究方向：老年性癡呆的發(fā)病機(jī)制和神經(jīng)保護(hù)治療。通訊作者：張啟芳(1966-)，女，博士，教授。E-mail:baihcd@126.com(柏華),gracezhang886@hotmail.com(張啟芳)。