番茄潰瘍病病原菌致病性的鑒定

張慶萍，王燕春，徐 佳，周艷芳，邱廷艷

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.赤峰市農(nóng)牧科學(xué)院 植保所，內(nèi)蒙古赤峰 024000；3.喀喇沁旗植保植檢站，內(nèi)蒙古錦山 024400）

番茄潰瘍病是一種由細(xì)菌引起的毀滅性病害，其病原為密執(zhí)安棒桿菌番茄潰瘍病致病型Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis（Smith）[1-2]。近幾年在赤峰市松山區(qū)、紅山區(qū)、元寶山區(qū)、喀喇沁旗及翁牛特旗等番茄種植基地均有不同程度發(fā)生，一般發(fā)病率10%～20%，嚴(yán)重的達(dá)50%以上，甚至造成毀棚，而且有擴展蔓延的趨勢。

從2011年開始我們對番茄潰瘍病綜合防治技術(shù)進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，在不同地區(qū)采集的病菌其致病力有所不同，甚至在同一地區(qū)不同時間采集的病菌的致病力也存在差異，明確不同來源潰瘍病菌的致病力差異是探索該病菌多態(tài)性以及開展其他相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)[3]，對此我們進(jìn)行了以下試驗。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株包括不同年份分離自赤峰市不同地區(qū)番茄潰瘍病發(fā)病田植株的菌株，共33株[4]，見表 1。

1.1.2 植物材料 供試番茄品種為普羅旺斯。育苗基質(zhì)經(jīng)160℃干熱滅菌5 h，冷卻后裝入50穴（5行×10列）育苗盤中，用水充分浸潤基質(zhì)24 h，隨后播種番茄種子，每穴2粒，在溫室中（日平均氣溫為26℃左右，夜間最低溫度控制在15～18℃，白天最高溫度為32～35℃；相對濕度控制在30%～60%，日平均相對濕度為42%）育苗；播種后7～10 d間苗，每穴選留1株長勢均勻健壯的幼苗，培育至2～3片真葉期供接種用。

表1 供試菌株

1.1.3 培養(yǎng)基 523培養(yǎng)基：蔗糖10 g，酵母膏4 g，酸水解酪素8 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.3 g，瓊脂18 g（液體不加瓊脂），水 1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌鑒定 病株分別是從2011—2016年在呼和浩特市賽罕區(qū)、赤峰市松山區(qū)、紅山區(qū)、元寶山區(qū)、喀喇沁旗、寧城縣等采集的經(jīng)分離鑒定所得。

1.2.1.1 培養(yǎng)基的配制 選用523培養(yǎng)基（番茄潰瘍病專用培養(yǎng)基）：蔗糖10 g，酸水解酪素8 g，酵母膏4 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.3 g，瓊脂15～18 g，水1000 mL，pH值6.8～7.1。

1.2.1.2 分離方法 將病莖用自來水和蒸餾水沖洗干凈，剪成1～2 cm小段，在70%的酒精中浸泡30 s，用滅菌水沖洗3～4次，放入滅菌的研缽中，研磨擠壓出組織液，向研缽中滴入1～2滴無菌水與組織液充分混合，吸取0.1 mL混合液，接入523平板培養(yǎng)基中，用玻璃刮鏟涂抹均勻，放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。

1.2.1.3 病原菌形態(tài)特征觀察 病原菌初分離成功后，對病原菌進(jìn)行單菌落的分離，28℃下培養(yǎng)48 h后，觀察單菌落的形狀、大小、顏色等形態(tài)特征。

1.2.1.4 染色及鏡檢 采用革蘭氏染色法，潰瘍菌經(jīng)染色后置顯微鏡下觀察為棍棒狀，紫色，為革蘭氏陽性菌。

1.2.1.5 致病性測定 確定供試病原細(xì)菌的致病性，采用蘸根接種方法對番茄幼苗進(jìn)行回接實驗。盆栽番茄（番茄種子在0.01%醋酸中消毒24 h后，催芽，待露白芽后播種于滅菌土壤中）接種時期選擇播種后2～3片真葉期番茄幼苗。將幼苗從土中拔出來傷根，在菌懸液中浸泡15 min，然后再重新栽種。在室溫下培養(yǎng)、觀察發(fā)病情況，一般14～21 d就可表現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為萎蔫。再將接種后的顯癥植株，進(jìn)行病原菌分離，可得到與所接菌相同的病原菌，且培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長情況、菌落情況都表現(xiàn)一致，確定此細(xì)菌即為番茄潰瘍病的致病菌。

1.2.2 接種體的制備 凍存于-80℃超低溫冰箱的Cmm菌株于523培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化，活化好的菌株在523培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h后，挑取單菌落在523液體培養(yǎng)基中搖培24 h，通過平板計數(shù)法確定菌液濃度達(dá)到109cfu/mL后備用（菌液稀釋倍數(shù)為10-9）。

1.2.3 接種方法[5-6]使用14 cm手術(shù)剪（型號：PTJ-3）的前端1 cm蘸取菌懸液后在番茄幼苗真葉上部1～2 cm處將主莖剪斷，每株菌株的接種處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)接種5株番茄幼苗，以無菌水為空白對照。接種的幼苗在溫室中培養(yǎng)，適時澆水保證秧床土壤濕潤。接種后30～40 d，調(diào)查記錄發(fā)病情況，計算病情指數(shù)。參照羅來鑫等的方法對番茄幼苗的潰瘍病進(jìn)行分級：0級，不出現(xiàn)葉片（或子葉）萎蔫或莖壞死；1級，葉片（或子葉）輕度變黃或萎蔫；2級，葉片（或子葉）中度萎蔫或莖輕度壞死；3級，葉片（或子葉）嚴(yán)重萎蔫或莖嚴(yán)重壞死；4級，植株死亡。

1.2.4 病原菌的再分離 方法同1.2.1.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

病原菌純化后48 h，番茄潰瘍病菌在523培養(yǎng)基上菌落呈凸圓形，不透明，鮮黃色，平滑，黏稠狀，邊緣無鋸齒，直徑1～3 mm。顯微觀察細(xì)菌體短桿狀棍棒形，大小測定為（0.3～6.6）μm×（0.6～1.1）μm。經(jīng)革蘭氏染色，革蘭氏反應(yīng)陽性。經(jīng)鞭毛染色后觀察無鞭毛。

2.2 回接分離結(jié)果

再將接種后的顯癥植株，進(jìn)行病原菌分離，可得到與所接菌相同的病原菌，且培養(yǎng)基上的細(xì)菌生長情況、菌落情況都表現(xiàn)一致，確定此細(xì)菌即為番茄潰瘍病的致病菌。

2.3 病原菌致病力檢測結(jié)果

由表2可以看出，不同菌株的致病力不同[7-8]。用病情指數(shù)來表示菌株致病力的大小，將菌株致病力分為4個等級，分別為致病力強（病情指數(shù)在80～100）、致病力中等（病情指數(shù)在 60～80）、致病力弱（病情指數(shù)在60以下）和無致病力（病情指數(shù)為0）。試驗的33個菌株均有致病力，其中屬于強致病力的菌株為以下 12 個：TDP14042602、TCF12032804、TNM13060301-2、TWNT13091403、TCF13061901、T CZ13061301、TWNT13091404、XTLS15052201、TBW 15042001、TDP15012101、TDP15012102 和 TDP15073101；屬于中等致病力的菌株為以下18個：TDP13091402、TWNT13091405、TDP14022502、TDP13091401、TKTJ14072302、TCZ12103001、TYB12061302、TCZ13051501、TKTJ14062501、TAQ13061401、TGS15012701、TBW15042003、TCZ15042201、TBW15042004、TDP15042702、XTLMD15052202、TNC15020301 和 XTBDM 15062801；屬于弱致病力的菌株為以下3個：TYB12061301、TDP14042601 和 TBW15020401。

表2 菌株致病性測定結(jié)果

續(xù)表2

3 討論

研究結(jié)果表明，在番茄幼苗真葉上部1～2 cm處將主莖剪斷接種可較好地測定不同來源番茄潰瘍病菌的致病力差異，根據(jù)病情指數(shù)可將病菌分為強（病情指數(shù)在 80～100）、中（病情指數(shù)在 60～80）、弱（病情指數(shù)在60以下）等不同的致病類型。不同菌株致病力不同，不同地區(qū)菌株致病力之間也存在差異。從發(fā)病幼苗分離Cmm時，使用523半選擇性培養(yǎng)基可以避免其他雜菌及腐生菌的污染，從而有效地分離到目標(biāo)菌。本研究中所選用的番茄品種普羅旺斯為赤峰地區(qū)主栽品種。目前國外雖然有文獻(xiàn)報道[8-9]，在一些與栽培番茄有親緣關(guān)系的野生種中，發(fā)現(xiàn)了一些對Cmm具有中度抗性的種質(zhì)資源，但世界上尚無商品化的番茄潰瘍病抗性品種[10]，這也是番茄抗病育種急需解決的難題之一。

參考文獻(xiàn)：

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